Analisi diretta di singole cellule mediante spettrometria di massa a pressione atmosferica

Riepilogo

Analisi di singola cellula viene effettuata mediante spettrometria di massa su cellule animali e vegetali a pressione atmosferica, utilizzando una fibra ottica affilato per assaggiare le cellule per la ionizzazione elettrospray ablazione laser (LAESI) spettrometria di massa.

Abstract

Analisi di sostanze biochimiche in singole cellule è importante per comprendere il metabolismo cellulare, ciclo cellulare, l'adattamento, stati di malattia, ecc Anche i tipi di cellule stessa mostra eterogenea composizione biochimica a seconda delle loro condizioni fisiologiche e le interazioni con l'ambiente. Metodi convenzionali di spettrometria di massa (MS) per l'analisi di biomolecole in singole cellule contare su di preparazione del campione esteso. Rimuovere le cellule dal loro ambiente naturale e trattamento del campione ampio potrebbe portare a cambiamenti nella composizione cellulare. Metodi di ionizzazione ambiente consentire l'analisi di campioni nel loro ambiente nativo e senza preparazione del campione esteso. ¹ Le tecniche basate sul medio infrarosso (mid-IR) ablazione laser di materiali biologici a 2,94 micron di lunghezza d'onda utilizzano l'eccitazione improvvisa di acqua che si traduce in fase di esplosione. ² tecniche di ionizzazione ambientale sulla base di mid-IR radiazione laser, come la ionizzazione elettrospray ablazione laser (LAESI) e pressione atmosferica infrarossi matrix-assisted laser ionizzazione desorbimento (IR AP-MALDI), hanno dimostrato con successo la capacità di analizzare direttamente acqua tessuti ricchi e biofluidi a pressione atmosferica. ^3-11 LAESI Nella metà degli IR pennacchio ablazione laser che consiste principalmente di particelle neutre sotto il campione si fonde con le goccioline elettrospray alta carica per la produzione di ioni. Recentemente, a metà IR ablazione di singole cellule è stata effettuata con la consegna dei mid-IR radiazione attraverso una fibra inciso. Il pennacchio generato da questo ablazione è stata postionized da un elettrospray consentendo l'analisi dei metaboliti diversi in singole cellule da LAESI-MS. ^{12 L'articolo} descrive il protocollo dettagliato per l'analisi singola cella utilizzando LAESI-MS. Il video presentato mostra l'analisi di una singola cellula epidermica dalla pelle di una lampadina Allium cepa. Lo schema del sistema è mostrata in Figura 1. Un esempio rappresentativo di ablazione singola cellula e spettro di massa LAESI dalla cella sono forniti in Figura 2.

Protocollo

1. I componenti ottici

1. Ablazione laser per la ionizzazione elettrospray ablazione laser (LAESI) spettrometria di massa (MS) è prodotto da un ns 5 impulso laser a lunghezza d'onda 2,94 micron. Un sintonizzabile oscillatore parametrico ottico guidato da un laser Nd: YAG (Opolette 100, Opotek Inc., Carlsbad, CA) è utilizzata per l'ablazione in questo studio. Il tasso di ripetizione è stato selezionato tra i 5 ei 100 Hz.. Si tratta di un laser di classe IV, che in caso di esposizione diretta può causare gravi danni permanenti agli occhi e alla pelle. La riflessione diffusa del raggio laser può anche essere pericolosa per la pelle o degli occhi. Indossare un adeguato laser occhiali di protezione.
2. La fibra ottica di vetro a base di biossido di germanio è stato ottenuto da infrarossi Fiber Systems, Inc. (Silver Spring, MD). Se ci sono Hytrel e poliimmide rivestimenti in fibra di seguire le indicazioni qui sotto per rimuoverli dalle estremità. Calore 1-metil-2-pirrolidone a 130-150 ° C in una cappa aspirante. Immergere le estremità della fibra si vuole mettere a nudo in questo liquido per circa 1 minuto o fino a quando il rivestimento comincia ad ammorbidirsi e staccare. Immergere il rivestimento ammorbidito in metanolo o isopropanolo per un minuto, ed eliminare ogni residuo di rivestimento con un panno privo di tovagliolo. Dopo aver rimosso il rivestimento, fendere entrambe le estremità della fibra con una lama di zaffiro (Kitco Fibra Ottica, Virginia Beach, VA), segnando e delicatamente scattare.
3. Per ottenere la nitidezza desiderata, chimicamente etch una estremità della punta della fibra di 1% (v / v) di acido nitrico (grado reagente) soluzione. Verticalmente immergere l'estremità della fibra selezionati nella soluzione acida ad una profondità tra i 300 ei 500 micron, dopo il contatto iniziale. Dopo circa 15 minuti di incisione, la punta si staccano spontaneamente dalla superficie acido. Ciò si traduce in una punta affilata con fibra ~ 15 micron raggio di curvatura. Risciacquare con acqua deionizzata per rimuovere eventuali residui di acido.
4. Montare la fine della fibra inciso su un micromanipolatore (MN-151, Narishige, Tokyo, Giappone) e portarlo alla vicinanza (~ 20 micron) della superficie cellulare per la deposizione di efficienza energetica.
5. Tenere la non incise fine della fibra ottica da una fibra mandrino nudo (BFC300, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). Per l'allineamento ottico, la fibra mandrino è montato su un cinque assi traduttore (BFT-5, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). L'energia laser (da 0,5 a 1 mJ) è accoppiato in fibra mettendo a fuoco il fascio di un piano-convessa fluoruro di calcio o di lenti antiriflesso ZnSe patinata (Infrared prodotti ottici, Farmingdale, NY) sulla sua non-inciso fine. Specchi d'oro protette (PF10-03-M01, Thorlabs, Newton, NJ) sono utilizzati per indirizzare la metà degli IR raggio laser sulla lente di messa a fuoco.

2. Elettrospray installazione

1. Il sistema elettrospray può essere costruito utilizzando i seguenti componenti: l'unione in metallo con ghiera perfluoroelastomero conduttivo, raccordi, tubi guaina, porta aghi (ad esempio, U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, rispettivamente IDEX Salute e delle Scienze, Oak Harbor, WA), così come tubi di silice fusa (ad esempio, CT360-100-50-5, Nuovo Obiettivo Inc., Woburn, MA). L'emettitore raccomandata è realizzato in acciaio inossidabile ed ha una punta conica con una id 50 micron (ad esempio, MT320-50-5-5, Nuovo Obiettivo Inc., Woburn, MA).
2. Preparare la soluzione di metanolo 50% con 0,1% di acido acetico (v / v) per la elettrospray. La soluzione viene pompata ad una velocità da 200 a 300 Nl / min con una pompa a siringa (Harvard Apparatus, Holliston, MA) utilizzando, ad esempio, una siringa da 500 microlitri (81222, Società di Hamilton, Reno, NV).
3. Applicare ad alta tensione tra 2.800 e 3.000 V per il sindacato di metallo da un alimentatore stabilizzato (PS350, Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA) per generare un elettrospray costante. Assicurarsi che tutte le connessioni elettriche sono sicure e schermati con la schermatura messa a terra. Il contatto diretto con esposti ad alta tensione può causare scosse elettriche.

3. Esempio di Manipolazione

1. Ottenere il campione di tessuto vivo o cellule da una fonte appropriata e tenerli come raccomandato prima dell'analisi. Le lampadine Allium cepa per questa manifestazione sono stati acquistati da un negozio locale. Tagliare una lampadina longitudinalmente da una bisturi chirurgico. Un segmento di pochi centimetri di una scala è stato sezionato in una striscia. Un monostrato intatto il tessuto epidermico interno è staccata.
2. La superficie bagnata dell'epidermide è usato per montare il tessuto su un vetrino pre-lavaggio microscopio. Tenere la diapositiva da una piastra di supporto generale scopo (FP01, Thorlabs Inc., Newton, NJ) montata su un tre assi fase di traduzione per il posizionamento. Acquisire gli spettri di massa subito dopo il montaggio del campione per evitare la degradazione delle cellule.

4. Sistema di visualizzazione

1. Due microscopi a lunga distanza sono usati per selezionare le celle di analisi e di mantenere la distanza tra la punta della fibra affilata e la superficie cellulare. Questo è montato sotto i 15 ° -30 ° angolo misurato dalla superficie. Questo sistema consiste di almicroscopio distanza ong video (zoom ottico 7x precisione, Edmund Optics, Barrington, New Jersey), con un infinito 5x corretto lente dell'obiettivo (Apo Piano M 5x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Giappone) dotato di una fotocamera CCD (Marlin F131, Allied Vision Technologies , Stadtroda, Germania) per il monitoraggio e la cattura delle immagini.
2. Il microscopio secondo video è montato ad angolo retto rispetto alla superficie del campione per visualizzare le cellule dall'alto. Questo sistema fornisce un feedback visivo per allineare la punta della fibra sopra la cella selezionata per l'ablazione e l'analisi. Si tratta di una precisione dello zoom ottico 7x (Edmund Optics, Barrington, New Jersey), dotato di un infinito 10x corretto lungo lavoro lente dell'obiettivo distanza (M Piano 10x Apo, Mitutoyo Co., Kanagawa, Giappone) e una camera CCD.

5. Acquisizione di spettri di massa

1. Accendere il laser, il electrospray e lo spettrometro di massa, ad esempio, un quadrupolo tempo di volo del sistema (Q-TOF Premier, Waters, Milford, MA). Ottimizzare la geometria della sorgente di ioni LAESI regolando la posizione della macchia ablazione ed emettitore elettrospray rispetto all'altro e l'orifizio dello spettrometro di massa per raggiungere la massima intensità di ioni.
2. Selezionare la cella di interesse per l'analisi utilizzando la vista dall'alto sistema di visualizzazione. Dopo la selezione, spostare il palco per portare il campione cella selezionata direttamente sotto la punta affilata della fibra ottica. Utilizzando la vista laterale microscopio regolare nuovamente la punta-cellula distanza della superficie di circa 20 micron.
3. Impulsi laser fuoco alla cella selezionata attraverso la punta fibra inciso. Questo risultato nella perforazione della parete cellulare e l'espulsione del citoplasma in forma di particolato. Dopo postionization dal electrospray, gli ioni prodotti sono raccolti dallo spettrometro di massa e gli spettri di massa sono registrati.
4. Dopo l'acquisizione dei dati, mettere il laser, il electrospray e lo spettrometro di massa in modalità standby o disattivarli. Mantenere la A. ablazione cepa campione di tessuto per l'osservazione al microscopio ottico opzionale.

6. Rappresentante Risultati

Ablazione riuscita di un risultato singola cella nel scoppio della parete cellulare e la raccolta di uno spettro di massa LAESI. Un esperimento fallito risultati generalmente in nessun ablazione e / o non spettro di massa. A scopo dimostrativo, presentiamo i risultati del LAESI-MS analisi di una singola cellula epidermica incorporato di una A. CEPA lampadina. Figura 2a mostra un'immagine rappresentativa di microscopia ottica, dopo il prelievo di una cellula. La parete cellulare è forata e l'estensione della perforazione è limitata dai confini con le cellule vicine. Le celle adiacenti sembra essere intatto. Figura 2b mostra un rappresentante spettro di massa LAESI prodotta dalla cella. Una grande varietà di ioni vengono rilevati dalla A. cepa delle cellule e in base alle loro masse accurate, modelli di distribuzione isotopica e, in alcuni casi, spettri di massa tandem, sono provvisoriamente assegnati a metaboliti endogeni. Gli ioni rilevato da una singola cellula erano simili a quelli osservati per l'analisi del tessuto stesso convenzionali LAESI-MS di più celle ^13.

Figura 1. Schematico di analisi singola cellula da LAESI-MS. Un mid-IR impulso laser è accoppiato ad una fibra ottica e consegnato al campione immessi sul vetrino. La punta della fibra affilato concentra la luce nella cella di destinazione e l'energia depositata scoppia la cellula. Il pennacchio ablazione prodotti (punti rossi) è fusa con un pennacchio elettrospray (punti neri), le goccioline si uniscono (punti verdi) con conseguente produzione di ioni campione specifico. Questi ioni vengono analizzati e rilevati dal spettrometro di massa (MS). Due lunghi microscopi video di distanza, Microscopio Microscopio 1 e 2, sono utilizzati per monitorare distanza tra la punta della fibra e la superficie cellulare e selezionare una cella per l'analisi, rispettivamente.

Figura 2a. Ablazione segno su una singola cellula epidermica di una A. CEPA lampadina. Le celle adiacenti non presentano danni visibili e, successivamente, possono essere analizzati separatamente.

Figura 2b. Spettro di massa corrispondente alla ablazione di un singolo A. cepa cellule epidermiche mostra la presenza di metaboliti primari e secondari.

Discussione

Il contenuto di acqua del citoplasma cellulare e la resistenza alla trazione della parete cellulare o la membrana sono i fattori critici che disciplinano l'ablazione di singole cellule durante LAESI-MS. La fluenza laser deve essere regolata per raggiungere le soglie di ablazione dei diversi tipi di cellule. La fluenza laser consegnato dipende dall'energia dell'impulso laser e della distanza tra la punta della fibra e la superficie cellulare. Minimizzare la perturbazione delle cellule vicine durante l'analisi singola cella è fondamentale. Mantenere l'energia laser sulla soglia di ablazione limita l'effetto di analisi sulle cellule adiacenti.

Una delle potenziali applicazioni è usando le cellule unico come il naturale pixel volumetrico (voxel) per l'industria chimica di imaging da MS. Rispetto alla raccolta di dati su una griglia rettangolare spesso artificiale, l'imaging chimica di una cellula del tessuto, uno alla volta ha più probabilità di conservare l'organizzazione spaziale delle interazioni biochimiche tra le cellule.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Fluka	45727
Methanol	Fluka	65548
1-methyl-2-pyrrolidinon	Sigma-Aldrich	M79603
Water	Fluka	39259