Iniezione di dsRNA in femmine di A. aegypti Zanzare

Riepilogo

Reverse approcci genetici si sono dimostrati estremamente utili per determinare quali geni di resistenza agli agenti patogeni sottostanti vettore nelle zanzare. Questo protocollo video illustra un metodo utilizzato dal laboratorio di James per iniettare dsRNA in femmine di A. aegypti zanzare, che ospitano il virus dengue. La tecnica per la calibrazione di aghi da iniezione, manipolare la configurazione di iniezione e iniezione di dsRNA nel torace è illustrato.

Abstract

Reverse approcci genetici si sono dimostrati estremamente utili per determinare quali geni di resistenza agli agenti patogeni sottostanti vettore nelle zanzare. Questo protocollo video illustra un metodo utilizzato dal laboratorio di James per iniettare dsRNA in femmine di A. aegypti zanzare, che ospitano il virus dengue. La tecnica per la calibrazione di aghi da iniezione, manipolare la configurazione di iniezione e iniezione di dsRNA nel torace è illustrato.

Protocollo

1. Fai aghi microiniezione tirando tubi di vetro capillari. Noi utilizziamo un estrattore ago dal CO Strumento Sutter, (modello P-2000). Le specifiche estrattore programma aghi sono i seguenti:
   
   di calore: 275
   fil: 3
   vel: 37
   Del: 250
   PUL: 125
   
   
2. Carico di un volume noto (ad esempio, 1 ml) di acqua nel aghi e contrassegnare manualmente la bilancia con un pennarello fine.
3. Impostare una post-iniezione di coppa per le zanzare. Prima tagliare la punta più esterno al largo di punta della pipetta 1000 microlitri. Poi, un buco nel fianco di una tazza e inserire la restante parte del puntale in tazza. Mettere una rete o coperchio sulla parte superiore della coppa.
4. Riempire due scatole di polistirolo con ghiaccio. Luogo ice box # 1 con uno stereomicroscopio e mettere un vetro d'orologio di vetro sul ghiaccio.
5. Anestetizzare le zanzare adulte con CO ₂ e coppa posto con gli adulti in ghiacciaia # 2.
6. Preparare ago per l'iniezione di dsRNA. Mettere l'ago riempito con dsRNA sul tubo di plastica del blocco di iniezione (per la descrizione del blocco di iniezione vedi sotto).
7. Spostare una zanzara anestetizzato dalla coppa al vetro da orologio con una pinza. Rompere la punta dell'ago iniezione cuticola zanzara. Scarta questa zanzara.
8. Per preparazioni iniettabili, l'ago viene inserito nel torace della zanzara. Con la mano libera, regolare la valvola di iniezione da "posizione di riposo" in "posizione di iniezione" e comprimere stantuffo fino a quando quantità desiderata di dsRNA è stato iniettato.
9. Luogo iniettato zanzara in post-iniezione tazza.

Blocco di iniezione impostato

1. Fissare una siringa da 50 ml a un blocco cenere.
   
2. Collegare un regolabile 1-vie fino alla fine della siringa con almeno 2 prese d'aria.
   
3. Collegare un tubo di plastica a tenuta d'aria a 1 uscita dell'aria.
   
4. Inserire un adattatore in micropipetta l'estremità libera del tubo.
   

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