Isolamento e la coltura di cellule embrionali aviaria progenitrici valvolare

Riepilogo

Questo articolo fornisce un metodo per isolare e quaglia coltura o pollo HH14 ^- Valvola di cellule endocardico e HH25 cellule mesenchimali cuscino valvola.

Abstract

Un'adeguata formazione e la funzione delle valvole cardiache embrionali è fondamentale per la progressione di sviluppo. Il cuore embrionale precoce è un tubo a U di endocardio circondato da miocardio. Miocardio secerne pappa cardiaci, un acido ialuronico ricco di matrice gelatinosa, nel nodo atrioventricolare (AV) e del tratto di efflusso (OFT) lumen. Nella fase HH14 valvulogenesis inizia quando un sottogruppo di cellule endocardico ricevere segnali dai miocardio, sottoposti endocardico alla trasformazione mesenchimale (EMT), e invadono la pappa cardiaci. Nella fase HH25 i cuscini sono completamente valvolare mesenchymalized, ed è questo mesenchima che forma poi l'apparato valvolare e del setto del cuore. La comprensione dei meccanismi che innescano e modulano il processo di differenziazione delle cellule EMT e sono importanti per la loro connessione con gravi difetti cardiaci congeniti. In questo studio presenteremo i metodi per isolare pre-EMT endocardico e post-EMT cellule mesenchimali, che sono le due fenotipi cellulari diversi del cuscino prevalvular. Pre-EMT cellule endocardico possono essere coltivate con o senza il miocardio. Post-EMT cuscino AV cellule mesenchimali possono essere coltivate gel di collagene all'interno meccanicamente vincolato o senza stress. Queste 3D in modelli in vitro imitare principali eventi morfogenici valvolare e sono utili per decostruire i meccanismi di valvulogenesis fase precoce e tardiva.

Protocollo

1. Preparazione

1. Incubare uova di quaglia fertile o pollo allo stadio 14 ^- (circa 2 giorni) o 25 (circa 4,5 giorni) a 60% di umidità e 37 ° C.
2. Preparare la soluzione Balanced Salt Earl è sterile (EBSS)
   1. Aggiungere 100 mL EBSS 10X a 600 ml di acqua 18 MΩ
   2. Aggiungere 2,2 g di sodio bicarbonato
   3. Regolare il pH della soluzione a 7,2
   4. Portare la soluzione fino a 1000 ml
   5. Sterilizzare la soluzione passa attraverso un filtro 0,2 micron
3. Preparare sterile M199 terreno di coltura.
   1. Aggiungere 1 confezione di M199 in polvere a 700 ml di acqua 18 MΩ.
   2. Aggiungere 2,2 g di sodio bicarbonato
   3. Regolare il pH della soluzione a 7,2.
   4. Aggiungere 10 ml (1%) Penicillina-Streptomicina
   5. Portare la soluzione fino a 1000 ml
   6. Sterilizzare la soluzione passa attraverso un filtro 0,2 micron
   7. Aggiungere 1 ml sterile 100X Insulin-transferrina-selenio-G supplemento
   8. Aggiungere 10 ml (1%) siero di pollo sterile
4. Preparare tre gel tridimensionale di collagene ad una concentrazione di collagene di 1,5 mg / ml. Lavoro precedente nel nostro laboratorio ha dimostrato che una concentrazione di collagene di più di 1,5 mg / ml fornisce una matrice che è troppo rigida biomeccanico per le cellule per spostarsi. Concentrazioni di gel di collagene inferiore a 1,5 mg / ml sono fibre di collagene così pochi che il ciuffo cellula può distruggere le fibre a livello locale, producendo un 'isola di cellule.
   1. Aggiungere la seguente ghiacciata reagenti ad una provetta sterile 15 ml in ordine:
      • 3X M199: Volume = volume totale necessario / 3
      • 18 MΩ acqua sterile: Volume = volume totale necessario (M199 volume + volume di pollo siero + 0,1 M di NaOH il volume + volume collagene)
      • Siero di pollame sterile: Volume = volume totale necessario * 0.01
      • Rat collagene coda I: Volume = (gel di concentrazione di collagene * volume totale necessario) / collagene concentrazione magazzino
      • Sterile 0,1 M NaOH: Volume = volume collagene * 0,2
        Nota: La quantità di acqua, 0,1 M di NaOH, e collagene aggiunto varierà a seconda della concentrazione della soluzione di riserva collagene.
   2. Miscelare la soluzione collagene bene con una pipetta sterile.
   3. Trasferire immediatamente il 0,3 mL della soluzione di collagene in 1,9 cm ² pozzi di crescita dell'area. Questa è la soluzione di collagene sufficiente a coprire completamente il bene e per fornire un gel che è di circa 3 mm di spessore. Un gel spessore di almeno 250 micron è necessario per gli studi di invasione delle cellule.
   4. Lasciare che la soluzione di collagene gel per almeno 1 ora a 37 ° C, 5% CO _2, e 100% di umidità.

2. Pre-EMT endocardica isolamento delle cellule e Cultura

1. Embrione isolamento
   1. Posizionare un pezzo pollice di lunghezza del nastro di laboratorio oltre l'estremità più grande di un uovo. Questo è dove la cellula d'aria si trova. Il nastro stabilizza il fragile guscio d'uovo di quaglia.
   2. Delicatamente forare la superficie registrata dell'uovo nella cella d'aria con la punta delle forbici curve sterilizzati.
   3. Praticare un foro nella parte registrata dell'uovo che è grande abbastanza per permettere il tuorlo di passare attraverso. Avviare il foro alla puntura e tagliare verso l'esterno a forma di spirale. Assicurati di tagliare la membrana esterna, ma evitare di forare il tuorlo.
   4. Quando il buco nella shell è completo, visualizzare l'embrione di quaglia. L'embrione è normalmente situato sul lato superiore del tuorlo.
   5. Cominciate a versare il tuorlo attraverso il taglio foro nell'uovo con una mano. Tenere un # 55 pinzetta nell'altra mano. Come l'embrione esce l'uovo sul lato superiore del tuorlo, scorrere delicatamente il # 55 pinzette sotto l'embrione e rimuoverlo dal tuorlo. Nota: per uova di gallina, l'isolamento embrione comporta rottura le uova di pollo su un forte, superficie pulita e rompere l'uovo in un piatto da 100 mm di Petri. L'embrione deve essere posizionato sul lato superiore del tuorlo. Far scorrere delicatamente # 55 pinzette sotto l'embrione e rimuoverlo dal tuorlo.
   6. Mettere l'embrione in un piatto 100 mm Petri contenenti ghiacciata, EBSS sterile.
2. Fase gli embrioni secondo i criteri di Hamburger e Hamilton ^1. Embrioni allo stadio 14 ^- sono stadio ultimi 13, ma non ancora in fase di 15, con 20-21 somiti ed una gemma coda. Una caratteristica chiave della tappa 14 ^- embrioni è l'angolo di testa, che è leggermente superiore a 90 ° rispetto al corpo.
3. Rimuovere i cuori da embrioni di quaglia allo stadio 14 ^- con N ° 55 pinzette, tagliando trasversalmente in cui il canale AV e OFT entrare in contatto con la parete toracica. Mettere i cuori insieme su un lato della piastra di Petri.
4. Raccogliere i cuori isolati con una pipetta sterile per il trasferimento e metterli in un piatto nuovo 100 millimetri Petri riempite con una soluzione sterile, ghiacciata EBSS.
5. Tagliare il OFTs e canali AV trasversalmente dai ventricoli con # 55 pinzette.
6. Sezione i canali restanti AV e / o vie di deflusso (OFTs) longitudinalmente.
7. Impostare una pipetta ad un volume di 20 uL. Utilizzare questa pipetta per aspirare sei tagliato longitudinalmente canali AV e OFTs.
8. Espellere i canali AV e OFTs sul gel di collagene. Aspirare qualsiasi EBSS eccesso dalla superficie del gel.
9. Utilizzare # 55 pinzette per orientare la espianti in modo che siano piatte e quindi il lume lato si affaccia sul gel di collagene. Cercate di non forare il gel di collagene con le pinzette.
10. Dopo 2 ore a 37 ° C e 5% di CO _2, rimuovere il miocardio dal espianti con # 55 pinzette. Le cellule endocardico dovrebbe essere lasciato sulla superficie del gel di collagene. In alternativa, il miocardio può essere lasciato sul espianto. Con la rimozione miocardio, le cellule endocardici con non sottoposti EMT senza alcun intervento. Con il miocardio presente un sottogruppo di cellule endocardico si trasformerà in mesenchima, ma il grado di trasformazione può essere modulata da fattori esterni. Nota: Anche se il miocardio sarà lasciato, l'espianto deve essere consentito almeno 2 ore da allegare al gel prima media viene aggiunto.
11. Aggiungere 0,4 ml M199 medio pozzetti contenenti ciascuno espianti.
12. Coltura le cellule a 37 ° C, 5% CO _2, e 100% di umidità.

3. Post-EMT AV Cuscino isolamento delle cellule mesenchimali e Cultura

1. Rompere le uova di pollo su un forte, superficie pulita e rompere l'uovo in un piatto da 100 mm di Petri. L'embrione deve essere posizionato sul lato superiore del tuorlo. Raccogliete l'embrione con # 5 pinzette afferrando membrane che circondano l'embrione e poi posto l'embrione in un piatto 100 millimetri Petri riempite con ghiaccio freddo, EBSS sterile.
2. Fase gli embrioni secondo i criteri di Hamburger e Hamilton ^1. Caratteristiche di una fase embrionale 25 sono distinte gomito e ginocchio e la pigmentazione degli occhi leggermente.
3. Isolare i cuori di tutti HH25 embrioni e il luogo del cuore insieme su un lato della piastra di Petri.
4. Raccogliere i cuori isolati con una pipetta sterile per il trasferimento e metterli in un piatto nuovo 100 millimetri Petri riempite con una soluzione sterile, ghiacciata EBSS.
5. Isolare la regione AV da tutti i cuori in una volta. L'AVS posto insieme su un lato della piastra di Petri. Agitare delicatamente la regione AV per rimuovere tutto il sangue, che può influenzare la vitalità cellulare.
6. Raccogliere il isolato AVS con una pipetta sterile per il trasferimento e metterli in un piatto nuovo 100 millimetri Petri riempite con una soluzione sterile, ghiacciata EBSS.
7. Sequenziale isolare i cuscini dal AV. Assicurarsi che non sia presente miocardio sui cuscini AV.
8. Raccogliere i cuscini isolati con una pipetta sterile per il trasferimento e metterli in una provetta sterile 15 ml per centrifuga.
9. Spin i cuscini sul fondo della provetta da centrifuga a 15 xg per 3 minuti.
10. Utilizzare una punta sterile 1000 ml per rimuovere la maggior quantità di surnatante EBSS possibile senza disturbare i cuscini.
11. Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA che è stato pre-riscaldato a 37 ° C. Lasciare i cuscini ad incubare in tripsina fino a quando sono completamente sciolti, che normalmente è di circa 3-5 minuti.
12. Aggiungere 100 ml di siero di pollo al tubo di centrifuga per spegnere la tripsina.
13. Agglomerare le cellule a 160 xg per 5 minuti. Eliminare il surnatante con una sterile, punta di 1000 ml.
14. Risospendere le cellule in 2 ml di medium M199 e mescolare pipettando. Prendere 10 microlitri della sospensione cellulare contare su emocitometro e determinare il numero totale di cellule che sono state isolate
15. Determinare il numero di gel di collagene verrà effettuato in base al numero di cellule isolate. Celle devono essere placcati con una densità di 2 x 10 ⁵ cellule / ml con un volume di 250 microlitri di gel.
16. Agglomerare le cellule a 160 xg per 5 minuti. Eliminare il surnatante con una sterile, punta di 1000 ml.
17. Utilizzando il protocollo di cui sopra, aggiungere 3X M199, acqua, pollo siero, collagene, e 0,1 M di NaOH, in questo ordine, al pellet. Mescolare pipettando gentile.
18. Aggiungere 250 microlitri per ogni cm 1,9 ² area di crescita bene.
19. Lasciare che la soluzione di collagene gel per almeno 1 ora a 37 ° C, 5% CO _2, e 100% di umidità.
20. Aggiungere 0,4 ml di terreni di coltura e incubare una notte.
21. Per continuare a coltivare il gel in condizioni di stress, liberare il gel dai lati della cultura e con una sterile 200 microlitri punta della pipetta. Culture meccanicamente vincolato sono gel che rimangono attaccati ai lati della cultura del bene.

4. Rappresentante Risultati

Figura 1:. Esempi di embrioni (A) HH14-quaglia embrione, e (B) HH25 embrione di pollo sono mostrati qui.

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Figura 2: HH14 valvole espianti endocardico dopo 2 ore di cultura (A) con il presente miocardio, o (B) con il miocardio rimosso..

Figura 3:. HH14 valvole espianti endocardico (A) Con la presente miocardio, molte delle cellule subiscono endocardica alla trasformazione mesenchimali ed avere un mandrino a forma di fenotipo mesenchimale dopo 48 ore di cultura. (B) Quando il miocardio è stato rimosso tutte le cellule mantenere una forma di ciottoli, fenotipo endocardico dopo 48 ore di cultura.

Figura 4:. HH25 valvola cellule mesenchimali in un gel di collagene Le cellule sono arrotondati subito dopo la semina.

Figura 5:. HH25 cellule mesenchimali in coltura (A) Dopo 48 ore di cultura in un gel di collagene limitato la HH25 cellule mesenchimali stanno cominciando a diffondersi. (B) HH25 cellule in uno stress senza gel di collagene 7 giorni dopo la semina e 6 giorni dopo la liberazione hanno compattato il gel a circa il 50% della superficie originale.

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Discussione

Il metodo per isolare le cellule endocardico da stadio HH14 ^{- Cuori} originariamente sviluppato da Runyan e Markwald fornisce una controllata, in ambiente vitro per studiare i fattori che innescano e modulano embrionale EMT ^2. HH14 ^- espianti endocardico colta senza miocardio non subirà EMT senza l'intervento biomeccanici o biochimici. Se il miocardio è lasciato sul espianto sarà il segnale di un sottogruppo di cellule endocardico a subire la trasformazione mesenc...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extra fine Bonn scissors, curved	Fine Science Tools	14085-08
Dumont tweezers #55	World Precision Instruments, Inc.	14099
Dumont tweezers #5	World Precision Instruments, Inc.	14098
Sterile transfer pipettes	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	2041S
4-well culture plates	Nalge Nunc international	176740
Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane	Nalge Nunc international	566-0020
Sterile 15 mL centrifuge tubes	Corning	430828
Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm	VWR international	25384-342
Laboratory tape	VWR international	89097-920
Rat-tail collagen I	BD Biosciences	354236
10X Earl’s Balanced Salt Solution	Quality Biological, Inc.	119-064-131
M199 powder	Invitrogen	31100-035
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X)	Invitrogen	41400-045
Chicken serum	Invitrogen	16110-082
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide solution, 1.0 N	Sigma-Aldrich	S2770
Fertile quail eggs (Coturnix coturnix)	Lake Cumberland Game Bird Farm
Fertile chicken eggs (Gallus gallus)	Cornell University Poultry Farm