Saggio β-amiloide tossicità utilizzando un transgenici C. elegans Modello

Riepilogo

Il verme nematode intensamente studiato Caenorhabditis elegans Può essere transgenically progettato per esprimere l'umano peptide β-amiloide (Aβ). Espressione indotta di Aβ in C. elegans porta ad un rapido, fenotipo paralisi riproducibile che può essere utilizzato per monitorare i trattamenti che modulano la tossicità Aβ.

Abstract

Accumulo del peptide β-amiloide (Aβ) è generalmente ritenuto centrale per l'induzione della malattia di Alzheimer, ma il meccanismo in questione (s) di tossicità sono ancora poco chiari. Aβ è depositato per via intramuscolare nella miosite inclusione dell'organo, un grave miopatia umano. Il intensamente studiato verme nematode Caenorhabditis elegans può essere transgenically progettato per esprimere Aβ umano. A seconda del tessuto o la tempistica di espressione Aβ, vermi transgenici possono avere fenotipi facilmente misurabili che servono come lettura di tossicità Aβ. Per esempio, vermi transgenici con pan-neuronale espressione Aβ avere difetti è l'apprendimento associativo (Dosanjh et al 2009.), Mentre i vermi transgenici con costitutiva muscolo-specifica espressione mostrano un progressivo, età-dipendente fenotipo paralisi (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Uno particolarmente utile C. elegans modello si avvale di un sensibile alla temperatura mutazione del sistema di sorveglianza di mRNA ingegnere temperatura-inducibile espressione muscolare di un transgene Aβ, con conseguente paralisi fenotipo riproducibile su cambio marcia temperatura (Link et al. 2003). Trattamenti che contrastare la tossicità Aβ in questo modello [per esempio, espressione di un transgene di protezione (Hassan et al. 2009) o l'esposizione a estratti di Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] riproducibile alterare il tasso di paralisi indotta dalla temperatura salire di marcia di questi transgenici vermi. Qui si descrive il nostro protocollo per misurare il tasso di paralisi in questo C. transgenico elegans modello, con particolare attenzione alle variabili sperimentali che possono influenzare questa misura.

Protocollo

1) Preparazione dei nematodi media di crescita piastre per test paralisi.

Saggi di paralisi vengono eseguite sullo standard nematode crescita Media (NGM) piastre solitamente usata per C. elegans propagazione e genetica (Stiernagle, 2006).

1. Autoclave NGM la soluzione contenente NaCl, Agar e Peptone in una beuta e aggiungere la quantità appropriata di sterili CaCl _2, uracile, colesterolo, 1M MgSO ₄ e 1M KPO _4. Aliquota 10 ml di liquido in NGM ogni mm 60 x 15 mm piastra di Petri. Lasciare NGM a solidificare notte a temperatura ambiente.
2. Se il test per gli effetti dei composti / estratti, aliquota dell'estratto su ogni piatto e utilizzare una spatola per distribuire uniformemente l'estratto sulla superficie della piastra. Lasciare che l'estratto secco di notte a temperatura ambiente. Volumi oltre 1 ml richiederà più tempo per asciugare.
3. Spot ogni piatto con 250 ml di E. coli ceppo OP5O cresciuto nel Media LB durante la notte per una densità ottica di 0,4-0,6. Permettono ai batteri di asciugare durante la notte a temperatura ambiente.

Variabili rilevanti

L'età delle lastre ha un effetto significativo sul saggio paralisi, come vecchi piatti tendono ad asciugarsi. Usare piatti versato entro una settimana saggio paralisi. Per un risultato ideale, versare piastre 3-4 giorni prima dell'inizio delle popolazioni verme sincrono [vedi (2) qui sotto]. Per ogni esperimento, utilizzare solo piatti versato dalla stessa partita.

Alterare le dimensioni del prato (cioè macchiato vs diffusione) e / o il tipo di batteri anche alterare il comportamento del worm. Saggi di paralisi può essere effettuata con metodi alternativi E. coli come fonte di cibo (per esempio, l'HT115 ceppo usato per l'alimentazione degli esperimenti di RNAi), ma questo può cambiare la cinetica di paralisi, il che richiede adeguati controlli interni.

2) Preparazione di Age-sincrono popolazioni Worm

Ceppo CL4176 (SMG-1 (cc546 ^ts) I; dvIs27 [myo-3 / Aβ ​​minigene + rol-6 (su1006) gene marcatore] X è più comunemente usato per il saggio Aβ indotta dalla paralisi Questo ceppo e altri modelli transgenici sono disponibili. ai ricercatori universitari per una tassa nominale dalla Genetica Caenorhabditis Center (http://www.cbs.umn.edu/CGC/).

1. Per massimizzare la sincronia età della popolazione sottoposta a test è preferibile iniziare con una generazione sincronizzato dei genitori. Una settimana prima di iniziare l'analisi della paralisi della popolazione prova, utilizzare un selettore a vite senza fine di platino per trasferire 20-30 adulti gravido su 10 piatti diversi NGM centimetri diffuso con OP50 per un uovo 2 ora giaceva a 16 ° C (la temperatura permissiva per CL4176 ). Rimuovere gli adulti gravido e consentire la progenie di crescere per 7 giorni, quando ormai saranno "secondo giorno" adulti gravido.
2. (Giorno 1) Gli adulti secondo giorno gravido vengono utilizzati per preparare l'età sincrono popolazioni di prova. Per ogni condizione sperimentale, l'oggetto è quello di generare piastre triplice copia contenente 50-75 anni-sincrono vermi. Utilizzando un selettore verme platino, il trasferimento 10-12 del 2 adulti giorno gravido su 60 millimetri (10 ml) piastre NGM macchiato con OP50. Lasciare che il worm per deporre le uova a 16 ° C per 2 ore, poi prendere via gli adulti e consentire uova a schiudersi e crescere a 16 ° C. A questo punto è meglio avere qualcuno che non sarà segnare le targhe di codice loro, in modo che il marcatore sarà cieco alle condizioni sperimentali.

Variabili rilevanti

La fase di sviluppo embrionale, quando uova vengono deposte (~ i 26-cell stadio per i vermi wild-type in condizioni ottimali) è una funzione dell'età adulta e della nutrizione. Se gli adulti gravido utilizzati per la preparazione della popolazione di età superiore o test sono affamati, uova fase successiva saranno stabilite, riducendo la sincronia età della popolazione e la riproducibilità della cinetica paralisi. E 'essenziale che mono-axenic (cioè, solo OP50 batteri) le culture sono utilizzati (contaminanti microbici può seriamente influire su questo test), e la riproducibilità è più alta se le piastre tre esemplari hanno un numero simile di vermi.

3) Transgene induzione e analisi Paralisi

1. (Giorno 3) piastre cambio marce alte a 25 ° C 48 ore dopo la fine dell 'uovo sincrono laici; worm dovrebbe essere al terzo stadio larvale (L3). Piastre devono essere disposte senza accatastamento in un incubatore a 25 ° C per consentire tutte le lastre di raggiungere 25 ° C, allo stesso tempo.
2. (Giorno 4) Iniziare segnando la paralisi di vermi (ceppo CL4176) a 18-20 ore dopo l'inizio del cambio marcia. A questo punto, tutti i vermi nella popolazione dovrebbe avere raggiunto la larvale quarto (L4) stadio. Continuare ad ottenere in due ore con incrementi fino a che tutti i vermi su ciascuno dei piatti sono paralizzati. Per ragioni sconosciute, la paralisi non è nemmeno tutta la lunghezza del corpo: la regione della testa è l'ultima parte del worm di cessare in movimento. Così, wORM che hanno recentemente avviato la paralisi non può tradurre in tutto il piatto, ma può muovere la testa, aprendo i batteri intorno al loro anteriore e lasciando un "alone" di batteri cancellata. Questi worm inevitabilmente diventerà completamente paralizzato, e quindi worm con aloni sono classificati come paralizzati. Alcuni worm non avrà aloni, ma non anche mostrare movimento spontaneo: queste sono testati da incitando con il selettore worm. Se un worm pungolati non può subire una completa propagazione delle onde su sollecitazione del corpo, è anche notato come paralizzato. Per il punteggio efficiente, è più facile spostare il worm paralizzato per un settore senza macchia del piatto in modo che non sarà involontariamente rescored del prossimo periodo di punteggio. (Questo permette anche mis-classificati worm per dimostrare il movimento, consentendo una correzione di punteggio).
3. Per generare una curva di paralisi, in ogni fase la frazione di vermi su ogni piatto che non sono stati paralizzati viene convertito in una percentuale, e la media percentuale "unparalyzed" è rilevata in tempo di iniziazione salire di marcia. (Il razionale per la stampa in questo modo è che la curva risultante è formalmente analoga a una curva di sopravvivenza, e quindi possono essere analizzati utilizzando le normali non parametrica statistiche di sopravvivenza.)

Variabili rilevanti

Il cambio marcia di vermi myo-3/Aβ transgeniche deve avvenire prima che raggiungano la metà L4 fase di paralisi, che sarà avviata, in quanto il promotore myo-3 sia maturo e regolata, e ha notevolmente ridotto espressione in L4 in ritardo o vermi adulti. Allo stesso modo, l'espressione di questo transgene è bloccato se i vermi diventano affamati, quindi è essenziale che i vermi sono ben nutriti per tutto l'esperimento. Non abbiamo mai osservato un worm paralizzato per recuperare in qualsiasi condizione, e dopo 12-16 ore di salire di marcia, tutti CL4176 vermi paralizzare, anche se sono downshifted a 16 ° C. Nel ceppo CL4176, sovraregolazione sufficiente di espressione del transgene a causare paralisi può avvenire a temperature più basse (ad esempio, 20-25 ° C), anche se i tempi di paralisi sarà alterato. Il tasso di paralisi dipende dal ceppo specifico transgenici utilizzati (che abbiamo costruito ceppi myo-3/Aβ sia con i tassi più veloce e più lento rispetto CL4176), quindi con ceppi alternativa alla finestra di punteggio potrebbe essere necessario un aggiustamento.

4) Rappresentante Risultati

Mostrato nella Figura 1 è un grafico di una curva di paralisi per CL4176, sia non trattati ed esposti a 6,27 mM caffeina (concentrazione finale in lamiera NGM). Il risultato è un trattamento in un ritardo statisticamente molto significativo nella paralisi di circa 4 ore, che noi interpretiamo come indicativi di soppressione di tossicità Aβ in questo modello. Mostrato nella Figura 2 è un esperimento indipendente saggiare gli effetti di Cafestol, un altro composto trovato nel caffè. Questo grafico è tipico per i trattamenti che non hanno impatto sulla tossicità Aβ. Si noti che in entrambi gli esperimenti circa la metà della popolazione non trattata CL4176 sono paralizzati a 24 ore, e la paralisi è completa di 28 ore. Questi sono tempi tipici per la paralisi del controllo CL4176 popolazioni. Deviazioni significative da questo momento sono indicativi di mutate condizioni ambientali o l'eliminazione spontanea di copie del transgene. (CL4176 contiene un cromosomicamente integrato serie transgenici con più copie del transgene myo-3/Aβ. Sebbene questo array transgenico è normalmente abbastanza stabile, la diffusione del ceppo a temperature> 16 ° C selezionerà per i vermi rari che hanno subito un l'eliminazione spontanea di transgeni, con conseguente varianti che hanno ridotto l'espressione Aβ e dei risultati paralisi più lento.)

Figura 1. Curva paralisi dei ceppi CL4176 vermi non trattati o esposti a 6,27 caffeina mM (Sigma). I tempi indicati sono da inizio del cambio marcia temperatura. Barre di errore = SEM

Figura 2. Curva di paralisi per CL4176 vermi esposti a 0,48 mM Cafestol (Sigma). Barre di errore = SEM

Discussione

Il protocollo che abbiamo descritto può essere efficacemente utilizzato per test gli effetti dei composti sulla tossicità Aβ. Esempi pubblicati includono gli effetti costituenti dell'estratto di Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) e reserpina (Arya et al. 2009). Composti che sono stati protettivo contro la tossicità Aβ in altri sistemi hanno anche dimostrato di essere protettivo in questo modello (ad esempio, la memantina, i nostri risultati non pubblicati). Una logica importante per stabilire questo modello è che gli strumenti genetici e molecolari ben sviluppato in C. elegans può essere usato per indagare i meccanismi di tossicità Aβ. Quindi, le mutazioni effetti specifici sulla tossicità Aβ può essere analizzati (ad esempio, l'effetto di ridurre insulino-simile di segnalazione introducendo un daf-2 perdita di funzione di mutazione, Florez-McClure et al. 2007), e questo modello può anche essere usato per esaminare gli effetti di sovra-espressione transgeni (Fonte et al. 2008). Di recente abbiamo fatto ampio uso di questo modello per esaminare gli effetti sulla tossicità di singole sostituzioni aminoacidiche nella Aβ (dati non pubblicati).

Il modello transgenico qui descritto analisi l'effetto di acuta espressione Aβ sulla funzione delle cellule muscolari. Al tempo delle cellule muscolari e paralisi loro sarcomero sono intatte, il fenotipo paralisi non è il risultato della morte delle cellule muscolari. Tuttavia, dopo la paralisi (~ 48 ore dopo il cambio marcia iniziale) vi è una ripartizione di integrità muscolare e la morte dei vermi. Non abbiamo studiato questo effetto a valle di espressione Aβ o utilizzati come marker di tossicità.

La Aβ modello inducibile espressione qui descritto non è appropriato per indagare trattamenti che modulano β-amiloide formazione di per sé. Anche se i vermi transgenici con la forma costitutiva espressione Aβ depositi di amiloide facilmente rilevabili (Fay et al 1998;.. Link et al 2001), vermi transgenici con espressione inducibile Aβ raramente hanno depositi di amiloide e il fenotipo paralisi appare indipendente dalla deposizione di amiloide (Drake et al. 2003). I nostri risultati sono coerenti con la visione che la tossicità acuta dei risultati indotta da Aβ espressione l'accumulo di Aβ solubile oligomerici, non deposizione di amiloide.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenti	Quantity/2L	Azienda / Catalogo #	Commenti
NaCl	6g	Sigma-Aldrich / S9888
Agar	40g	Sigma-Aldrich / A7002
Peptone	5g	Sigma-Aldrich / P0556
DDH 2 O	2L
1M CaCl 2	2 ml		147.02mg/mL in DDH 2 O
Uracile	2 ml		2mg/ml in DDH 2 O
Colesterolo	2 ml		5mg/ml in etanolo (non in autoclave)
1M MgSO 4	2 ml		246.5mg/mL in DDH 2 O
1M KPO 4	50mL		98mg KH 2 PO 4. ML, 48mg K2HPO4/mL in DDH 2 O, pH
Erlenmeyer Flask		VWR