Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans</em

Riepilogo

Stabile mediante l'analisi isotopica profilazione di massa gas-cromatografia spettrometria di flusso intermediario metabolica è descritto nel nematode, Caenorhabditis elegans. I metodi sono specifici per la valutazione di arricchimento isotopico nel biossido di carbonio, acidi organici, aminoacidi e dopo l'esposizione isotopo sia durante lo sviluppo su piastre di agar o durante l'età adulta in coltura liquida.

Abstract

Stabile profilazione isotopica è da tempo consentito indagini sensibile delle conseguenze metaboliche di mutazioni genetiche e / o terapie farmacologiche in modelli cellulari e mammiferi. Qui, descriviamo i metodi dettagliati per eseguire stabile profilazione isotopica del metabolismo intermedio e flusso metabolico nel nematode, Caenorhabditis elegans. I metodi sono descritti per il profiling intero verme amminoacidi liberi, anidride carbonica marcata, etichettato acidi organici, aminoacidi ed etichettato in animali esposti a isotopi stabili sia dal primo sviluppo su piastre di agar nematode terreni di coltura o dall'inizio come giovani adulti, mentre esposti a vari trattamenti farmacologici in coltura liquida. Aminoacidi liberi sono quantificati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) in aliquote verme estratto in tutto 4% acido perclorico. Universalmente etichettati ¹³ C-glucosio o 1,6 - ¹³ C _2-glucosio è utilizzato come precursore stabile isotopica di carbonio la cui etichetta è tracciata mediante spettrometria di massa di biossido di carbonio (sia atmosferiche e disciolti) così come in metaboliti indicativi del flusso attraverso la glicolisi , metabolismo del piruvato, e il ciclo degli acidi tricarbossilici. Risultati rappresentativi sono inclusi per dimostrare gli effetti del tempo isotopo esposizione, diversi protocolli di compensazione batterica, e di metodi alternativi interruzione verme nel wild-type nematodi, come pure l'estensione relativa incorporazione isotopica nel complesso mitocondriale III vermi mutanti (isp-1 (qm150) ) rispetto al wild-type vermi. Applicazione di isotopi stabili profiling nei nematodi vivono fornisce una capacità nuova di indagare a livello di intero animale in tempo reale, alterazioni metaboliche che sono causati da malattie genetiche individuali e / o terapie farmacologiche.

Protocollo

Protocollo A: Stabile profilazione isotopica del metabolismo intermedio durante C. sviluppo elegans su piastre NGM.

* Nota: l'arricchimento isotopo stabile può essere misurato con successo nelle popolazioni di nematodi giovani adulti in seguito ad esposizione isotopo (sia con universalmente glucosio marcato con ¹³ C o 1,6 - ¹³ C _2-glucosio) a partire sia in prime fasi dello sviluppo o nella prima età adulta. Questo protocollo facilita il monitoraggio simultaneo di salute degli animali, lo sviluppo e la crescita su standard nematode crescita media (NGM) piatti, che non è così facilmente ottenibile in coltura liquida.

1. La preparazione di 100 millimetri piatti di Petri con 10 ml di terreni di crescita nematode (NGM), per tecnica standard ^1.
2. Piastre NGM diffuso con OP50 E. coli ¹ e lasciare asciugare durante la notte.
3. Aggiungere 500 ml di 200 mM 1,6 - ¹³ C ₂ glucosio (per ottenere una concentrazione finale di 10 mm sulla piastra NGM) uniformemente al piatto. Lasciare asciugare durante la notte.
4. Bleach gravido vermi adulti ^1. Piastra recuperato le uova su piastre NGM senza batteri o 1,6 - ¹³ C ₂ glucosio. Incubare a 20 ° C durante la notte.
5. Il giorno successivo, il trasferimento nati, L1, arrestato larve su piastre NGM precedentemente diffuso con 1,6 - ¹³ C _2-glucosio e OP50 E. coli (al punto # 2, sopra). Crescono i vermi allo stadio adulto giovane (48-72 ore, a seconda del ceppo), worm presa in carico non morire di fame.
6. Raccogliere sincrono, primo giorno di vermi adulti giovani di piatti con 3-4 ml di S. basale.
7. Lavare i vermi in 50 mL di S. basale in 50 mL tubi Falcon. Lasciare worm per far sedimentare per gravità per 5 minuti. Rimuovere il surnatante a ~ 5 ml. Ripetere il lavaggio altre due volte.
8. Stima numero verme contando tre aliquote di 100 microlitri ^2. Regolare la concentrazione verme a 1000 worm / mL di S. basale.
9. Pipettare 1 ml (1000 vermi) in una provetta di plastica centrifuga 1,5 ml.
10. Aggiungere 69 ml di 60% PCA contenente lo standard interno (ε-aminocaproico acido) ad una concentrazione finale del 4% PCA e 200 micromol di standard interno.
11. Lasciate che i vermi risolvere per gravità x 5 minuti. Rimuovere e conservare il surnatante in un'altra provetta.
12. Grind campioni verme utilizzando plastica omogeneizzatore (Kontes pellet Pestello) e motorizzato trapano (Kontes Pellet Motor Pestello cordless) per 15 secondi. Confermare visivamente interruzione verme al microscopio ottico. Ripetere se necessario.
13. Trasferire il surnatante dal punto # 11 a combinare con omogenato dal punto # 12.
14. Centrifugare campione a 2250 rpm (1300 xg) per 5 minuti.
15. Trasferire il surnatante in fresco 7 tubo di vetro ml. Salva pellet per il saggio di concentrazione di proteine, come dettagliato nel punto # 20, di seguito.
16. campioni a pH 7-8 (neutro) intervallo utilizzando 4N KOH.
17. Centrifugare i campioni neutralizzato in 7 ml di tubo di vetro a 2250 giri al minuto (1300 xg) per 5 minuti per rimuovere i sali.
18. Trasferire il surnatante in fresco 7 tubo di vetro ml.
19. Preparare i campioni neutralizzato per la quantificazione metabolita da:
    1. Ad alte prestazioni (HPLC): separare 50 ml di campione neutralizzato per l'iniezione diretta in HPLC. Libero quantificazione amminoacido viene eseguita mediante HPLC (Varian) con derivatizzazione pre-colonna con rilevazione o-phthalaldehyde e fluorescenti, come descritto in precedenza ^3-4.
    2. Gascromatografia / spettrometria di massa (GC / MS): Procedere con l'estrazione di campioni rimanenti neutralizzato utilizzando resine a scambio ionico (Bio-Rad) per GC / MS determinazione di arricchimento isotopico in aminoacidi e acidi organici, come descritto nel protocollo D.
20. Aggiungere 1 ml di NaOH 1N alle proteine ​​pellet rimanenti (dal punto # 15) in 7 ml di tubo di vetro.
21. Incubare NaOH campione sottoposto a trattamento di proteine ​​a temperatura ambiente durante la rotazione (Labnet * Rotator LabRoller) durante la notte fino alla dissoluzione.
22. Usa 75-100 ml di NaOH trattati con proteina per determinare la concentrazione di proteine ​​con metodi standard (DC Protein Assay, Bio-Rad).

Protocollo B. profilazione Stabile isotopica del metabolismo intermedio in C. elegans giovani adulti in coltura liquida.

* NOTA: effetti farmacologici sul flusso metabolico intermediario nei nematodi adulti possono essere studiati seguendo inizio isotopiche esposizione il primo giorno di deposizione delle uova sia su piastre NGM (vedi protocollo A, sopra) o in coltura liquida. Noi preferiamo il secondo approccio per massimizzare l'efficienza dei costi di isotopi stabili e l'utilizzo agente farmacologico.

1. Diluire sincrono, primo giorno di deposizione delle uova giovani adulti in basale S. contenente 0,0005% di colesterolo (ottenuto con l'aggiunta di 0,5 ml di 1% di colesterolo (sciolto nel 95% etanolo) a 1L di S. basale) a 2000 capi per 500 microlitri.
2. Impostare ~ 4 cultura volume totale mL (s) in 25 mL beute, come segue:

   TRATTAMENTO:	NESSUNO	"DROGHE A"
   S. basale di colesterolo	3020 microlitri	3020 uL - "A Drug" volume
   Isotopi stabili (1,6 - 13 C 2-glucosio)	80 microlitri	80 microlitri
   K12 E. coli (OD 660 2,5-3)	400 microlitri	400 microlitri
   Worms Giovane adulto (2.000)	500 microlitri	500 microlitri
   Un farmaco (concentrazione desiderata)	-	Come desiderato

3. Coprire con un foglio di fiaschi. Agitare palloni per 24 ore a 220 rpm a 20 ° C incubate piattaforma shaker.
4. Assicurarsi che fiaschi non sono completamente sigillate, come l'ossigeno è necessario per flusso intermediario metaboliche e per conseguente etichettatura dei metaboliti endogeni nematode.
5. Lavare i vermi con l'aggiunta di 4 volumi cultura ml a 46 ml di S. basali in un tubo di plastica 50 ml. Lasciare worm per far sedimentare per gravità per 5 minuti. Vuoto di aspirazione surnatante fino a ~ 5 rimane ml. Ripetere il lavaggio di riempimento del tubo altre due volte a 50 ml con S. basale.
6. Concentrato worm lavato a 1000 worm / ml in un tubo di plastica centrifuga 1,5 ml.
7. Aggiungere 69 ml di 60% di acido perclorico (PCA) e 2 ml di 10 micron di standard interno (ε-aminocaproico acido) per ottenere una concentrazione finale di 200 micromol livello interno e il 4% PCA.
8. Preparare i campioni come passi al # 11-22 nel protocollo A.

PROTOCOLLO C-1. Monitoraggio dell'utilizzo isotopica in vermi adulti su piastre tracciando carbonica marcata anidride carbonica atmosferica e sciolto.

* NOTA: Mentre i protocolli A e B dettaglio i metodi di monitorare incorporazione isotopo in metaboliti libero entro le viti senza fine in 2-3 giorni di sviluppo o di 1 giorno di vita adulta, rispettivamente, al lordo conferma del successo e della cinetica di incorporazione isotopica su un percorso breve periodo di tempo (cioè, a pochi minuti a ore) si può ottenere l'etichetta di monitoraggio di anidride carbonica atmosferica _(CO2) rilasciato dai vermi o contenuto in anidride carbonica disciolta all'interno estrarre worm. Batteri vivi o morti possono essere alimentati a worm se coltivate su piastre (PROTOCOLLO C-1). I batteri non è necessaria per esposizione a breve termine isotopo di vermi in coltura liquida (PROTOCOLLO C-2).

1. La preparazione di 100 millimetri piatti di Petri con 10 ml di agar NGM. Diffusione piastre NGM con vivo o UV ucciso OP50 E. coli (come mostrato nella Figura 1). Lasciare le piastre ad asciugare durante la notte.
2. Aggiungere 500 ml di 200 mM ^{1,6-etichetta-13} C _2-glucosio a piastre diffusione OP50 NGM (per la concentrazione degli isotopi finale di 10 mm sulla piastra NGM). Lasciare le piastre ad asciugare durante la notte.
3. Ottenere sincrono, primo giorno di deposizione delle uova, vermi adulti giovani cresciuti su piastre di agar NGM diffusione solo con OP50 E. coli.
4. Trasferimento 1000 vermi adulti giovani a piastre di agar sperimentale NGM contenenti isotopi stabili ed E. coli (preparato come passi per # 1-2, sopra).
5. Inserire la piastra di NGM sperimentale (senza copertura) in camera di vetro personalizzati dotati di ben chiuso 3-way rubinetto per consentire il campionamento atmosfera preciso e sostituzione. Sigillare immediatamente camere con disco di vetro otticamente trasparente. Coprire cucitura dove il vetro si siede su disco piatto con grasso ad alto vuoto per sigillare. Tempo di record "0 Time".
6. Campione di 10 mL di atmosfera da camera di vetro con rubinetto a 3 vie con una siringa da 20 ml al minuto 30, 60, 90 e 120. Trasferire ciascun campione atmosferica per un pre-preparato 10 ml tappo di gomma in cima tubo di vetro contenente 1 ml di mM NaHCO 1 ₃ a 0,1 N NaOH che è stato sottovuoto.
7. Iniettare 10 ml di ritorno d'aria in ogni camera di vetro con rubinetto a 3 vie con una siringa da 20 ml. Chiudere rubinetto alla camera dopo il campionamento / reintroduzione atmosfera e prima di riprendere il tempo di incubazione tra i punti di raccolta.
8. Iniettare 100 ml di acido fosforico 20% attraverso il tappo in 10 mL tappo di gomma in cima tubo di vetro contenente CO2 _{nell'atmosfera} campione.
9. Rimuovere 2 ml di atmosfera e di iniettarlo in 12 ml blu-top autocampionatore tubi pre-riempita con elio per misura del CO ₂ atmosferica.
10. Analizza "atmosferica di CO ₂ campioni" di Mass Spectrometer Gas-Ratio (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
11. Camere di vetro aperta successivo periodo di due ore di incubazione isotopo e la raccolta di tutti i campioni atmosferici.
12. Lavare i vermi off di piastre NGM in 3 mL di S. basale.
13. Lavare i vermi in 50 mL S. basali in 50 mL tubi Falcon. Ripetere il lavaggio altre due volte.
14. Concentrato worm per ~ 1000 worm / ml in 7 mL a fondo rotondo tubo di vetro (s).
15. Vuoto del tubo di vetro con tappo di tenuta in gomma.
16. Aggiungere 100 uldi acido fosforico 20% attraverso il tappo di gomma con la siringa per rilasciare disciolta di CO _2.
17. Rimuovere 2 ml di atmosfera e di iniettare in 12 ml blu-top autocampionatore tubi pre-riempita con elio per disciolta misura del CO _2.
18. Analizza "sciolto CO ₂ campioni" da Gas-Rapporto di spettrometro di massa (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).

Alternative protocollo (C-2): utilizzo di monitoraggio isotopica in vermi adulti in coltura liquida tracciando carbonica marcata anidride carbonica atmosferica e sciolto.

1. Ottenere sincrono, primo giorno di deposizione delle uova, vermi adulti giovani cresciuti su piastre di agar diffusione NGM con OP50 E. coli.
2. Lavare i vermi in 50 mL di S. basali in 50 mL tubi Falcon. Lasciare worm per far sedimentare per gravità per 5 minuti. Rimuovere il surnatante a ~ 5 ml. Ripetere il lavaggio altre due volte.
3. Trasferimento 1000 vermi adulti giovani in 1 ml S. basale a 10 ml a fondo rotondo tubo di vetro. Aggiungere 10,1 ml di 1 M di magazzino universalmente marcata con ¹³ C-glucosio per 1 ml di vermi per raggiungere la concentrazione finale di 10 mm.
4. Ossigenare il fondo rotondo tubo di vetro contenente i vermi e di isotopi attraverso lo scambio con l'atmosfera che scorre ossigeno al 100% nel tubo aperto per 2 minuti. Chiudere immediatamente tubo con tappo di gomma.
5. Agitare i tubi sperimentale in 20 ° incubate piattaforma C shaker a 220 rpm. Record di partenza tempo come "0 Time".
6. Campione di 5 ml di atmosfera da 10 ml a fondo rotondo tubo di vetro con una siringa da 10 ml e 25 gauge attraverso il tappo di gomma ai minuti 30, 60, 90 e 120.
7. Trasferire ciascun campione atmosferica per un pre-preparato, tappo di gomma in cima provetta da 10 ml di vetro contenente 1 ml di 1 mM NaHCO ₃ a 0,1 N NaOH che è stato sottovuoto.
8. Iniettare 5 ml di ritorno d'aria in ogni sperimentale a fondo rotondo tubo di vetro contenente i vermi e di isotopi con tappo di gomma con una siringa da 10 ml e 25 gauge.
9. Curriculum di incubazione di 10 mL sperimentale a fondo rotondo tubi di vetro contenenti worm e di isotopi agitando a 220 giri al minuto di tempo tra i punti di raccolta.
10. Iniettare 100 ml di acido fosforico 20% attraverso il tappo in atmosfera contenente tappo di gomma in cima provetta da 10 ml di vetro.
11. Rimuovere 2 ml di atmosfera e di iniettare in 12 ml blu-top autocampionatore tubi pre-riempita con elio per misura del CO ₂ atmosferica.
12. Analizza "atmosferica di CO ₂ campioni" di Mass Spectrometer Gas-Ratio (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).
13. Alla fine del periodo sperimentale, lavare i vermi in 50 mL S. basale in tubo da 50 ml Falcon. Lasciare verme pellet a formare per gravità. Vuoto di aspirazione surnatante fino a ~ 5 rimane ml. Ripetere il lavaggio per altre due volte in 50 ml di S. basale.
14. Concentrato worm per ~ 1000 worm / ml in 7 mL a fondo rotondo tubo di vetro. Aggiungi tappo di gomma e sigillo di tubo a vuoto. Aggiungere 100 ml di acido fosforico al 20% utilizzando una siringa da 1 ml con un ago da 25 attraverso il tappo di gomma a rilascio di CO ₂ disciolta verme.
15. Rimuovere 2 atmosfera ml e iniettare in 12 ml blu-top autocampionatore tubi pre-riempita con elio per disciolta misura del CO _2.
16. Analizza "sciolto CO ₂ campioni" da Gas-Rapporto di spettrometro di massa (ThermoQuest Finnigan Delta Plus).

Protocollo D. Elaborazione neutralizzato campioni di protocolli A e B per l'analisi degli aminoacidi e degli acidi organici mediante gascromatografia / spettrometria di massa.

1. Bead Preparazione:
   1. Aggiungere 1 N HCl a entrambi Ag Ag 1 e 50 perle separatamente in bicchieri di 1L.
   2. Mescolare ogni pallone per 30 minuti con agitatore magnetico.
   3. Lavare con acqua deionizzata perline 10 volte fino a pH di lavaggi sono uguali a pH dell'acqua.
2. Colonna Preparazione:
   1. Inserire un tappo di cotone appena sopra la parte più stretta della punta della pipetta Pasteur.
   2. Aggiungi perline carico a ciascuna delle due colonne per ogni campione, riempiendo ciascuno a circa un terzo dell'altezza della colonna. Usa AG1 perline per l'estrazione di acidi organici. Usa AG50 perline per l'estrazione di aminoacidi.
3. Esempio di elaborazione:
   1. Aggiungere 500 l di campione alla colonna con perline AG1 carica. Nulla è aggiunto al campione (vedi PROTOCOLLO A, punto # 19B) prima di applicare a AG1 colonna per estrarre acidi organici, se il campione è già a pH neutro.
   2. Aggiungere 1 ml di HCL 0,1 N al campione rimanente prima di applicarlo alla colonna AG50 per estrarre aminoacidi.
   3. Attendere che i campioni per eseguire completamente attraverso le colonne.
   4. Lavare la colonna con acqua 10 volte fino a lavaggi sono neutrali (7-8 range di pH).
   5. Eluire colonne i prodotti freschi, etichettati 4 flaconcini di vetro ml di campione:
      1. Per l'estrazione degli acidi organici, aggiungere 3 ml di 3 N HCl a AG1 colonna. Questo permette l'analisi degli isotopi di arricchimento nel numero totale di atomi di carbonio marcato tra i 3-carbonio specie (lattato), 4-carbonio specie (aspartato, succinato, malato),5-carbonio specie (glutammato), e 6-carbonio specie (citrato).
      2. Per l'estrazione degli amminoacidi: aggiungere 3 ml di 4 N NH ₄ OH per AG50 colonna. Questo permette l'analisi degli isotopi di arricchimento nel numero totale di atomi di carbonio marcato tra i 3-carbonio specie (alanina) e 5-carbonio specie (glutamina).
   6. Mettere il campione in fiale riattiva Vap III evaporatore durante la notte fino a secco.

E. Derivitization campione e impostazioni della macchina per la Spettrometria di Massa

Aggiungere 50 ml di acetonitrile e 50 ml di n-metil-nt-butyldimethylsilyl Trifluoroacetamide (MTBSTFA) per ogni flaconcino campione. Cover, mix e incubare per 30 minuti a 60 ° C. Iniettare 1-2 microlitri per ogni campione in gascromatografia / spettrometro di massa (GC / MS).

F. Analisi dei risultati

1. Quantificazione dei picchi di aminoacidi. La determinazione quantitativa di ogni amminoacido mediante l'analisi HPLC è calcolata utilizzando l'area di ogni picco rispetto a quella dello standard interno.
2. Calcolo di arricchimento isotopico. Stabile arricchimento isotopico è calcolato in Excel (Microsoft) per ogni specie secondo la seguente formula: Percentuale eccesso Atom, corretto (APE) = (R _{sa-R °)} * 100 / [(R _{sa-R st)} 100], dove R _sa - rapporto tra il campione e R _° - Rapporto dello standard.
3. Valutare differenze statistiche tra l'arricchimento del campione. Student t-test è utilizzato per valutare la significatività dei relativi aminoacidi e le differenze etichetta isotopica tra i campioni.

RAPPRESENTANTE RISULTATI:

Isotopo stabile è ben incorporata in vermi adulti giovani, come dimostra carbonica marcata misurata di CO e CO ₂ atmosferica verme sciolto 2. In vermi nutriti vivo o UV-irradiati ucciso OP50 E. coli, il rapporto di ¹³ CO ^_2-12 CO ₂ era maggiore nel disciolta di CO ₂ verme frazione rispetto al rilascio in atmosfera di CO ₂ (Figura 1). Worm alimentazione dal vivo o ucciso OP50 E. coli non ha alterato significativamente la misurava ¹³ CO ^_2-12 CO ₂ rapporto in estratto verme lavato (vedi PROTOCOLLO C1).

L'esposizione prolungata a isotopo stabile del primo periodo larvale maggiore arricchimento isotopico in metaboliti intermedi. Corretto eccesso Percentuale atomi di carbonio etichettati determinato in metaboliti intermedi di giovani adulti wild-type worm è stato maggiore tra tutte le specie di glutammato, quando i vermi sono stati alimentati universalmente marcata con ¹³ C-glucosio e batteri vivi durante lo sviluppo rispetto agli animali nutriti trattamenti analoghi batteri etichettati per 48 solo poche ore dopo aver raggiunto la deposizione delle uova stadio adulto (Figura 2).

Effetto di compensazione volte su arricchimento isotopico. Indipendentemente dal timecourse esposizione, tutti gli animali cresciuti su piastre sono state 'cancellate' di etichetta isotopica prima della preparazione a valle per GC / MS analisi. Confronto di protocolli di compensazione è stata effettuata, come mostrato nella Figura 2, compresa l'alimentazione worm per 2 ore su piastre di agar diffusione NGM vivere con nuovi batteri senza isotopo o di alimentazione su piastre di agar NGM senza batteri per 2 ore, e l'alimentazione su piastre di agar NGM senza batteri per 2 o 6 ore. Indipendentemente dal corso dell'esposizione isotopica, nessuna differenza significativa arricchimento isotopico in metaboliti intermedi da giovani adulti estratto verme intero è stata osservata quando gli animali sono stati liquidati senza batteri su piastre per 2 o 6 ore. Al contrario, l'arricchimento isotopico meno è stato osservato in metaboliti intermedi in cui gli animali sono stati poi 'cancellato' di isotopo in eccesso si nutrono di batteri senza etichetta per due ore. Tuttavia, un maggiore arricchimento a +3, +4, e +5 specie è stata evidente quando i vermi sono stati esposti a isotopo del primo periodo larvale. Pertanto, il protocollo di compensazione ottimale è stato determinato in compensazione vermi dopo la loro incubazione su piastre NGM diffuso con isotopi stabili e batteri con successiva incubazione per 2 ore su piastre NGM unspread. Di nota, vermi cresciuti in coltura liquida sono stati lavati chiara etichetta isotopiche e batteri in tre volumi di S. basale (vedi protocollo B); GC / MS di lavaggi non ha mostrato alcuna significativa arricchimento isotopico dal terzo lavaggio.

Worm rettifica ceduto arricchimento massima in metaboliti intermedi. Per ottimizzare l'arricchimento per cento in metaboliti intermedi seguenti condizioni di trattamento analogo, il confronto è stato fatto di campioni verme interrotta da sonicazione da soli o sonicazione più di rettifica. La figura 3 mostra che i vermi interrotto in seguito all'esposizione isotopo mediante ultrasuoni, più rettifica avuto maggiore arricchimento isotopico rispetto ai campioni interrotto solo mediante ultrasuoni. Questi dati suggeriscono che le frazioni più sub-organismal sono stati interrotti dalla macinazione che per sonicazione. Studi successivi hanno rivelato rettifica da solo senza sonication è stato sufficiente per ottenere la massima arricchimento isotopico (dati non riportati).

Esposizione verme intero isotopica permette l'analisi di flusso via metabolica intermediario. Alimentazione vermi che vivono con isotopi stabili precursore sia durante lo sviluppo (PROTOCOLLO A, Figura 4A) o all'inizio negli animali da stadio adulto (PROTOCOLLO B, Figura 4B) permette l'analisi sensibili dell'arricchimento isotopico tra i metaboliti indicativi di flusso attraverso la glicolisi (lattato, alanina), il piruvato metabolismo (alanina), e il ciclo degli acidi tricarbossilici (citrato, malato, succinato, aspartato, glutammato e la glutammina). Universalmente marcato ¹³ C-glucosio fornisce l'etichettatura robusta di tutte le specie di carbonio, mentre l'utilizzo di 1,6 - ¹³ C _2-glucosio permette di etichettatura affidabile solo in uno specie di ogni metabolita. Questa tecnica può sensibilmente discernere differenze da wild-type flusso metabolico intermedio tra vite senza fine della catena respiratoria mitocondriale ceppi mutanti, come il complesso III subunità della catena respiratoria mitocondriale mutante isp-1 (qm150). La Figura 5 illustra l'entità delle differenze osservate in etichetta assoluta tra isp-1 (qm150) e vermi N2 ogni esposte per 24 ore a 1,6 - ¹³ C _2-glucosio in coltura liquida con K12 E. coli dal primo giorno di deposizione delle uova stadio giovani adulti (protocollo B). Ulteriori studi isotopici stabili in una gamma di mitocondriale vermi mutanti sono in corso.

Figura 1. Universalmente marcato ¹³ C-glucosio isotopo stabile è stato ben incorporato nel vermi adulti giovani ¹³ CO _2: ^12. CO ₂ rapporto (cento atomi in eccesso (APE), corretto) nel wild-type (N2) vermi due ore successive alimentazione universalmente etichettati ¹³ C-glucosio e uno ai raggi UV uccisi o OP50 batteri su piastre (PROTOCOLLO C1) ^13. incorporazione C in metaboliti worm è stato robusto, dopo due ore di esposizione isotopo. Barre blu e rosso indicano relativo arricchimento isotopico in fase gassosa ("atmosferica di CO _2") e fase liquida ("verme di CO _2"), rispettivamente.

Figura 2. Esposizione prolungata isotopo del primo periodo larvale e successivamente 'compensazione' vermi su piastre di agar NGM senza batteri maggiore arricchimento isotopico in glutammato libero di vermi adulti giovani. Arricchimento isotopico in specie glutammato è indicato per i vermi nutriti con piastre di agar NGM con universalmente marcato- ¹³ C-glucosio e OP50 batteri sia durante lo sviluppo dalla fase larvale L1 attraverso la fase di 959 adulti di cellule giovani ("L1", vedere PROTOCOLLO A), o per 48 ore dall'inizio, quando i vermi raggiunto il primo giorno di deposizione delle uova giovani stadio adulto ("YA"). Asse X indica il numero totale di atomi di carbonio etichettate in ogni specie glutammato. Asse Y indica la percentuale di arricchimento (atomi corretto per eccesso (APE)). Le barre verdi indicano worm cancellato in seguito all'esposizione degli isotopi di alimentazione OP50 E. coli senza isotopo su piastre NGM per due ore prima dell'estrazione PCA. Barre blu e grigio indicano worm cancellato in seguito all'esposizione isotopo su piastre NGM senza batteri o isotopo per due o sei ore, rispettivamente, prima dell'estrazione PCA.

Figura 3. L'interruzione worm dalla macinazione di rendimento massimo arricchimento isotopico in metaboliti verme intermediario. Percentuale di arricchimento di carbonio misurata in uno specie di citrato nelle wild-type vermi trattati per 24 ore in coltura liquida con 1,6 - ¹³ C _2-glucosio senza batteri (PROTOCOLLO B). Barre nere e grigie indicano i vermi che sono stati interrotti solo da sonicazione o sonicazione e rettifica, rispettivamente. Arricchimento isotopico in seguito all'esposizione a 1,6 - ¹³ C _2-glucosio è meglio valutata in metaboliti indicato su un atomo di carbonio. Al contrario, l'etichetta si arricchisce in tutte le specie di ogni metabolita quando universalmente ^{etichettati-13} C-glucosio viene utilizzato.

Figura 4. Risultati rappresentativi illustrano il grado di arricchimento isotopico in metaboliti intermedi verme indicativa del flusso attraverso la glicolisi, il metabolismo del piruvato, e il ciclo degli acidi tricarbossilici. Corretto per cento atomi in eccesso (APE) è stata determinata in giovani adulti wild-type (N2 Bristol) vermi seguenti 1, ^6-13 C _2-glucosio esposizione sia (A) durante lo sviluppo dalla fase L1 su piastre (PROTOCOLLO A), o (B) a partire dal primo giorno di deposizione delle uova, come i giovani adulti per 24 ore in coltura liquida (PROTOCOLLO B) . Le barre di errore indicano la deviazione standard in cui i dati isotopici affidabile da tre repliche biologiche era disponibile.

Figura 5. Assoluto quantificazione degli aminoacidi di specie aminoacidi metabolita nel wild-type e mitocondriali ceppi mutanti verme. Etichetta assoluto in ogni specie di quattro amminoacidi è stata calcolata moltiplicando HPLC-determinata concentrazione di aminoacidi liberi (nmol / mg di proteina verme) da correggere per cento in eccesso atomi (APE) per ogni specie. Barre grigie e nere indicano wild-type (N2 Bristol) e mitocondriale complesso subunità III ceppi mutanti (isp-1 (qm150)), rispettivamente. Le barre indicano la media di tre esperimenti biologici replicare per ceppo.

Discussione

L'applicazione di spettrometria di massa per misurare l'abbondanza isotopica in metaboliti intermediario offre un quadro meravigliosamente dettagliato dei critici cambiamenti biochimici ^5. Qui, abbiamo predisposto protocolli dettagliati per sfruttare questa metodologia altamente sensibile e specifico per la valutazione del metabolismo flusso intermediario nel modello animale geneticamente versatile, C. elegans. Infatti, l'alimentazione degli animali che vivono con isotopi stabili etichettati precursori metabolici (come il ¹³ C-glucosio) permette di comprendere romanzo in via di flusso intermediario metabolica quando si misura l'arricchimento isotopico in metaboliti a valle. Abbiamo sviluppato una metodologia affidabile per ottenere un'analisi robusta di flusso attraverso la glicolisi, il metabolismo del piruvato, e il ciclo degli acidi tricarbossilici. Ciò può essere realizzato sia in animali nutriti con isotopo stabile dai primi stadi larvali di sviluppo o all'inizio del periodo post-mitotico adulti. Arricchimento isotopico in diverse specie metabolita può essere studiato insieme a tutto il profilo di acidi verme aminoacidi mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni, come descritto in precedenza ^4, per determinare assoluto arricchimento isotopico in diverse specie di alanina verme libero, aspartato, glutammato e la glutammina. Infatti, i modelli coerenti di arricchimento isotopico si ottengono quando si misurano analiti di aminoacidi e acidi organici in aliquote da 1.000 a 2.000 giovani vermi adulti sincrono. Tale metodologia può discriminare sensibilmente il flusso anormale intermediario nucleare ceppi gene mitocondriale basato mutante rispetto al wild-type vermi.

Questa tecnica ha un valore di indagare le alterazioni del flusso in specifiche vie biochimiche di rilevanza per comuni errori congeniti del metabolismo. In particolare, l'utilizzazione del glucosio marcato con isotopi stabili informa flusso di carbonio attraverso vie metaboliche centrale di rilevanza per le malattie mitocondriali. Infatti, i nostri dati suggeriscono l'applicazione di tale metodologia può sensibilmente discriminare flusso anomalo intermediario in un gene nucleare basato mitocondriale complesso subunità III ceppo mutante (isp-1 (qm150)) rispetto al wild-type vermi.

E 'importante riconoscere che da quando l'esposizione isotopiche è completato in un periodo di uno o più giorni, quantificati arricchimento isotopico rappresenta un "steady state" valore di arricchimento, piuttosto che il flusso quantificabile in un periodo di tempo definito come potrebbe essere determinato nella cella modelli basati su esposti a isotopo per un periodo di minuti per ore. Un altro potenziale limite di interrogare flusso percorso nel corso dello sviluppo dei nematodi si riferisce a diverse lunghezze di sviluppo larvale che si verificano in particolare i ceppi mutanti. Per esempio, molti gravi mutazioni mitocondriali sono noti per causare l'arresto al terzo (L3) stadio larvale ^6. Così, l'analisi di incorporazione dell'isotopo solo negli animali che sopravvivono fino all'età adulta può non essere rappresentativo dell'intera popolazione mutante. Tuttavia, questa metodologia potrebbe essere adattato per valutare l'incorporazione isotopica in metaboliti intermediario in una fase specifica larvale (come L2) piuttosto che aspettare che gli animali per raggiungere lo stadio adulto. Allo stesso modo, gli animali che entrano stadio alternativo larvale conosciuto come dauer probabilmente hanno notevolmente modificato (probabilmente inferiore) rispetto al flusso metabolico animali che procedere direttamente attraverso i quattro stadi larvali. Studio futuro potrebbe essere effettuata anche per valutare direttamente l'incorporazione isotopica negli animali fase dauer di differenti background genetico. Esponendo gli animali a isotopi stabili per un periodo di tempo fisso (qui, da 24 a 48 ore) inizio una volta raggiunto lo stadio animali giovani adulti (come specificato nel protocollo B) elimina l'impatto della variabile periodi di sviluppo. Mentre ¹³ C-glucosio interroga solo la glicolisi, il metabolismo del piruvato e ciclo degli acidi tricarbossilici flusso, altri traccianti isotopici potrebbe essere valutata a interrogare flusso biochimico percorso attraverso altre vie di interesse nei nematodi. Per esempio, ¹⁵ N-glicina può essere utilizzato per valutare fatturato aminoacidi nei nematodi.

Un'altra potenziale limitazione di questo approccio è il livello di sensibilità di rilevazione metabolita. La nostra esperienza suggerisce un minimo di 500 nematodi giovani adulti hanno l'obbligo di quantificare con successo incorporazione isotopica con i metodi HPLC e GC / MS impiegato qui. Uso di strumenti con maggiore sensibilità, come la cromatografia liquida ad ultra (UPLC), può permettere un'ulteriore riduzione del numero di animali studiati, anche se prevediamo che questo è improbabile per consentire la quantificazione affidabile di metaboliti e incorporazione isotopica in specie metabolita da worm singolo. Abbiamo studiato le popolazioni verme di 1.000 animali per esperimento, che abbiamo trovato per rilevare in modo affidabile metaboliti abbondanza a basso contenuto di ogni ceppo. Tuttavia, alcuni metaboliti, come ad esempio GABA, non può che essere attendibilmente quantificati in popolazioni molto più grandi di nematodi, su ordine di1x10 ⁶ animali ^4.

In sintesi, il profilo degli isotopi stabili fornisce un metodo non invasivo e sicuro (non radioattivo), approccio che è stato a lungo utilizzato per lo studio degli errori congeniti del metabolismo. L'applicazione di questa metodologia a C. elegans romanzo fornisce la capacità di indagare in vivo e in tempo reale, alterazioni metaboliche che si verificano a livello di intero animale, che possono derivare da singole malattie genetiche e / o esposizioni agente farmacologico.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. basal		1 - page 59	Protocols A and B
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8503	Protocol B
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocols A and C
K12 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocol B
NGM agar	Research Products International Corp.	N81800-1000.0	Protocols A, B, and C
13C glucose (universally labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-1396	Protocol A and C
13C glucose (1,6 labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-2717	Protocol B
60% Perchloric acid (PCA)	Fisher Scientific	MK2766500	Protocols A and B
ε-aminocaproic acid (Internal Standard)	Sigma-Aldrich	A-2504	Protocols A and B
MTBSTFA	Regis	270243	Protocol E
Acetonitrile	Regis	270010	Protocol E
AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin	Bio-Rad	140-1441	Protocols A and B (organic acid extraction)
AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin	Bio-Rad	142-1441	Protocols A and B (amino acid extraction)
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S-8875	Protocol C
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	Protocol C
3N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
1N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol A
0.1 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
4N NH4OH	Sigma-Aldrich	30501	Protocol D
4N KOH	Sigma-Aldrich	484016	Protocols A and B
Deionized water	Milli Q Biocel	ZMQA60F01	Protocol D
Helium	Airgas	24001364	Protocol C2
SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope	Nikon Instruments	NI MNA41000	Protocols A, B, and C
pH meter	Fisher Scientific	S68167	Protocols A and B
Table top centrifuge - 5804R	Eppendorf	05-400-93	Protocols A and B
Incubated platform shaker	New Brunswick Scientific	M1324-0004	Protocol B
Mini LabRoller Rotator	Labnet International	H-5500	Protocols A and B
Pestles	Kontes Corp	K749520-0090	Protocols A and B
Drill	Kontes Corp	K749540-0000	Protocols A and B
1 L glass beaker	Fisher Scientific	02-539P
1 L Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-368
25 mL Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-356	Protocol B
7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6431	Protocols A, B, and C1,C2
10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6430	Protocol C2
Blue top tubes	Labco	438B
50 ml conical plastic tubes	Falcon BD	14-959-49A	All protocols
1.5 ml microfuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320	Protocols A and B
Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)	BD Biosciences	301025, 301029, 301031	Protocols C1 and C2
25 gauge needles	Fisher Scientific	22-253-131	Protocols C1 and C2
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550	Protocol D
Pasteur pipettes	VWR international	14673-043	Protocol D
60mm Petri dishes	VWR international	25373-085	Protocol C
Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock	Custom Made		Protocol C
Optically transparent glass plate	Custom Made		Protocol C
Reacti-Vap III Evaporator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	18826	Protocol D
Cotton	VWR international	14224-516	Protocol D
High Vacuum Grease	Dow Corning	1597418	Protocol C1
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-18	Protocol B
Timer	ISC Bioexpress	T-2504-5	Protocol C
Gas-Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Protocol D
GC-MS	Hewlett-Packard	5980/5971	Protocol D
GC-MS	Agilent Technologies	6980N/5973N	Protocol D
HPLC	Varian Inc., Agilent	9010	Protocol D