Ad alta risoluzione in fibra ottica per Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Riepilogo

In molte situazioni biologici e clinici è vantaggioso per lo studio dei processi cellulari, come si evolvono nel loro microambiente nativo. Qui si descrive il montaggio e l'uso di un basso costo in fibra ottica microscopio in grado di fornire immagini in tempo reale in coltura cellulare, studi su animali e studi clinici del paziente.

Abstract

Molti studi biologici e clinici richiedono lo studio longitudinale e l'analisi della morfologia e funzione con risoluzione a livello cellulare. Tradizionalmente, gli esperimenti multipli sono in parallelo, con singoli campioni rimosso dallo studio in momenti sequenziali per la valutazione al microscopio ottico. Intravitale diverse tecniche sono state sviluppate, con confocale, multiphoton, e secondo microscopia armonica tutti dimostrando la loro capacità di essere utilizzato per l'imaging in situ ^1. Con questi sistemi, tuttavia, la cosa è tecnicamente complessa e costosa, che coinvolgono i sistemi di scansione laser e complessi sorgenti luminose. Qui vi presentiamo un protocollo per la progettazione e l'assemblaggio di una ad alta risoluzione microendoscope che può essere costruita in un giorno con off-the-shelf componenti per meno di US $ 5.000. La piattaforma offre flessibilità in termini di risoluzione, campo di vista, e la lunghezza d'onda di funzionamento, e viene descritto come questi parametri possono essere facilmente modificato per soddisfare le esigenze specifiche dell'utente finale.

Noi e gli altri hanno esplorato l'utilizzo del microendoscope ad alta risoluzione (HRME) in coltura cellulare in vitro ^2-5, in ⁶ asportato e tessuti animali che vivono ^2,5, e nei tessuti umani in vivo ^2,7. Gli utenti hanno segnalato l'uso di diversi agenti di contrasto fluorescente, tra cui proflavina ^2-4, benzoporfirina derivate anello monoacid A (BPD-MA) ^5, e fluoroscein ^6,7, che hanno ricevuto pieno, o l'approvazione sperimentale da parte della FDA per l'uso in soggetti umani. Ad alta risoluzione microendoscopy, nella forma descritta qui, può fare appello ad una vasta gamma di ricercatori che lavorano nel campo delle scienze di base e clinica. La tecnica offre un approccio efficace ed economica che integra microscopia tradizionali da banco, permettendo all'utente di eseguire ad alta risoluzione, immagini longitudinale in situ.

Protocollo

1. Microendoscope Assemblea

L'alta risoluzione microendoscope qui descritto (figura 1a) dovrebbe essere considerata come una configurazione di base con diverse variazioni possibili in assemblea e di applicazione. Descriviamo in dettaglio in questa sede l'incarnazione della piattaforma che è stato progettato per essere utilizzato con proflavina come agente di contrasto fluorescente. Proflavina nucleare è un luminoso macchia con l'assorbimento di picco e lunghezze d'onda di emissione di 445 nm e 515 nm rispettivamente. L'uso di altri mezzi di contrasto richiede all'utente di selezionare eccitazione, emissione e filtri dicroici in modo appropriato. Diversi elementi di alta risoluzione microendoscope sono generici e possono essere ottenute da fornitori diversi. Per esempio, i componenti di posizionamento optomechanical sono disponibili da Thorlabs, Newport, Linos tra gli altri. Compatte telecamere CCD sono disponibili da aziende quali Point Grey Research, Prosilica e Retiga; sensibilità della telecamera deve essere scelto tenendo in considerazione la luminosità del fluoroforo da utilizzare, così come il frame rate desiderato. Ad alta potenza diodi emettitori di luce (LED) possono essere ottenuti da Luxeon, Cree, e Nichia tra gli altri. Fasci di fibre ottiche sono disponibili da Sumitomo, Fujikura, e Schott. Nella scelta dei componenti per una specifica applicazione, l'utente deve prendere in considerazione le relazioni inerenti coinvolti in microscopia a fluorescenza tra la concentrazione di fluoroforo, photobleaching, intensità di illuminazione, la sensibilità della telecamera, il guadagno e tempo di esposizione.

1. Collegare i 6 "gabbia di aste al 1,5" aste gabbia, per formare una coppia di 7.5 "aste lunghe. Avvitare queste aste in una faccia dell'unità specchio piega. Avvitare il 0,5" aste in faccia opposta. Far scorrere il cubo gabbia sulle aste gabbia, tramite il basso due fori passanti. Avvitare le 2 "aste in faccia lato del cubo gabbia (figura 1b).
2. Fissare la fotocamera a un piatto gabbia utilizzando un C-mount adattatore SM1. Fissare la piastra gabbia sul 0,5 "aste gabbia, a filo con la faccia dell'unità specchio piega.
3. Inserire l'obiettivo "tubo" in un "3 tubo lente lungo e sicuro l'obiettivo con un anello di sicurezza. La lunghezza focale dell'obiettivo dovrebbero essere selezionati in modo che il core della fibra ottica fascio sono campionati da almeno due pixel quando proiettato sulla fotocamera. Rilasciare il filtro per le emissioni nel tubo sulla parte superiore del primo anello di sostegno, e aggiungere un altro anello per fissare il filtro in posizione. Osservare la convenzione filtro orientamento indicato dal produttore del filtro. Avvitare il tubo lente nella parte del gabbia cubo più vicino alla fotocamera CCD. noti che nella figura 1c, questo obiettivo e filtro sono riportate senza il "3 tubi lente per chiarezza.
4. Collegare la fotocamera a un computer e visualizzare l'immagine sullo schermo. Diretto il gruppo telaio ad un oggetto distante e far scorrere il cubo gabbia lungo i binari fino a quando l'immagine appare a fuoco. Bloccare il cubo gabbia in questa posizione. (Questo è un metodo semplice per garantire che la lente del tubo formerà una immagine messa a fuoco quando combinato con l'infinità-corretti lente dell'obiettivo).
5. Inserire lo specchio dicroico nel supporto e posto a 45 ° nel cubo gabbia.
6. Avvitare l'obiettivo, attraverso un RMS per SM1 adattatore filettato e tubo lente regolabile, nella faccia del cubo gabbia di fronte al tubo porta-lente. A z-traduttore può essere usato al posto del tubo lente regolabile per facilitare la messa a fuoco. Vite di un connettore SMA in un piatto e montare questa gabbia sulle aste, a circa la distanza di lavoro della lente obiettiva.
7. Montare un LED su un piatto gabbia e far scorrere sulla fine del 2 "aste. Aggiungere una lente ad un 0,5" tubo lenti in modo che quando questo tubo è avvitato nel lato del cubo gabbia, formerà l'immagine del LED che riempie l'apertura posteriore della lente obiettiva. Questo (Kohler illuminazione) di configurazione in modo che la faccia prossimale del fascio di fibre ottiche è uniformemente illuminato. Aggiungere il filtro di eccitazione al "0,5 tubo lente e fissarlo in posizione con un anello di sicurezza (figura 1c).
8. Collegare un connettore SMA ad un fascio di fibre ottiche. Avvitare il fascio di connettore SMA nella presa SMA montati sulle aste gabbia. Diretta l'estremità distale del fascio verso una sorgente di luce a banda larga (illuminazione fluorescente è sufficiente) e osservare l'immagine del volto fascio prossimale sulla fotocamera CCD. Regolare la posizione della lente obiettivo avvitando dentro o fuori del cubo gabbia fino a quando il fascio di fibre immagine appare a fuoco. I singoli core dovrebbe essere chiaramente visibile (Figura 2).

2. GRIN Lens Assemblea

La risoluzione spaziale del microendoscope può essere aumentata collegando un micro-lente o gruppo ottico alla punta distale del fascio di fibre. Queste ottiche sono configurati in modo tale che invece di mettere la punta pacco direttamente sul tessuto, la punta è ripreso sulla superficie del tessuto con demagnification, aumentando così la frequenza spaziale di campionamento imposto dalla luce-guidnuclei zione del fascio di fibre. Il grado di demagnification corrisponde l'aumento della risoluzione spaziale, e allo stesso tempo, ad una diminuzione proporzionale nel campo di vista. Componenti lente gradiente di indice (GRIN) sono compatibili con fibre ottiche e sono disponibili da GrinTech, NSG, Schott, tra gli altri, e può essere direttamente legato alla punta distale di un fascio di fibre.

1. Seleziona una lente GRIN con l'ingrandimento desiderato e distanza di lavoro per l'applicazione. Assicurarsi che il diametro della lente è superiore a quella del fascio di fibre che si intende lavorare. È consigliabile che il fascio di fibre ottiche e lenti GRIN essere montato sui palcoscenici manuale separato 3-asse di posizionamento al microscopio a bassa potenza o stereoscopio per l'allineamento preciso prima dell'incollaggio.
2. Mettere una goccia di adesivo ottico (es. adesivi UV Noland cura) su entrambi l'obiettivo o il viso fascio. Portare i due componenti in contatto utilizzando la posizionatori manuale. Esporre l'interfaccia ai raggi UV per la dose raccomandata dal produttore.
3. Per proteggere la lente GRIN e all'interfaccia collegata, un breve tratto di tubo in alluminio capillare (parti piccole Inc.) possono essere utilizzate per racchiudere il comune. Far scorrere il tubo sopra il giunto e fissarlo in posizione con resina epossidica. Guaina termorestringente può essere utilizzato per completare l'assemblaggio.

3. Microendoscope Imaging

1. Applicare il mezzo di contrasto alle cellule o tessuti da acquisire. Con proflavina (0,01% w / v in PBS), nella diagnostica per immagini in vitro di cellule in coltura può essere effettuata mediante incubazione breve (<1 minuto) e un accurato risciacquo. Imaging di ex campioni di tessuto vivo o in tessuti in vivo è possibile dopo l'applicazione topica del colorante. La diffusione delle proflavina in queste condizioni è stato trovato per essere quasi istantanea, con l'imaging possibile in pochi secondi e duratura per diversi minuti.
2. Posizionare il fascio di fibre ottiche in leggero contatto con il campione da acquisire. Quando le cellule in coltura di imaging o ex campioni di tessuto vivo, è consigliato il montaggio della parte distale del fascio di fibre in un dispositivo di sicurezza con le fasi di posizionamento manuale sugli assi XYZ per la stabilità durante l'imaging.

4. Rappresentante dei risultati:

Quando assemblate correttamente, il microendoscope opererà come un epi-microscopio a fluorescenza, diffusa attraverso un coerente fibra ottica fascio. Per ottenere risultati ottimali di imaging, l'attenzione dovrebbe essere rivolta a garantire che le tre condizioni fondamentali requisiti:

1. La faccia prossimale del fascio di fibre dovrebbe essere ripreso sul CCD senza defocus, al fine di ottenere la risoluzione completa del sistema. Figura 2a, b, c dimostrare una porzione di un fascio di fibre ripreso con scarsa attenzione, defocus leggera e buona messa a fuoco, rispettivamente. La messa a fuoco ottimale si trova regolando la posizione assiale della lente obiettivo relativo al viso bundle.
2. La faccia prossimale del fascio di fibre dovrebbe essere uniformemente illuminata oltre il suo diametro totale (campo di vista). Come descritto nel testo del protocollo (1,7), ciò si ottiene mediante la configurazione delle ottiche di illuminazione per l'illuminazione di Kohler. Figura 2d mostra un'immagine acquisita quando un campione uniforme fluorescente è illuminato in questa configurazione preferita, con 2e figura dimostrando il corrispondente risultato in condizioni di illuminazione critiche. In quest'ultimo caso, la struttura del LED è ripreso sul viso fascio di fibre, con la conseguente comparsa di questo modello indesiderate sovrapposto alla struttura del campione vero.
3. Entrambe le facce prossimale e distale del fascio di fibre devono essere pulite e prive di graffi e patatine. Figura 2f dimostra la presenza di detriti attacca alla faccia fagotto, con un danno sotto forma di un piccolo chip alle 5 sul perimetro fibra. Detriti possono essere rimossi dal fascio volti pulendo allo stesso modo come convenzionale connettori a fibre ottiche, con carta per lenti e isopropanolo, o standard in fibra ottica strumenti di pulizia. Se una delle estremità del fascio di fibre è graffiato o tagliato, o se il fascio rompe lungo la sua lunghezza, il volto può essere lucido piatto da manuale standard, o tecniche di lucidatura meccanica. Si consiglia di 12-15 micron lappatura della carta per una lucidatura iniziale ruvido, con un tocco finale su carta 0,5-1,0 micron.

Figura 3a mostra immagini di 1483 cellule in vitro, a seguito di etichettatura con il posizionamento proflavina e la luce del fascio di fibre nude sul campione. Figura 3b mostra il miglioramento della risoluzione spaziale e la riduzione del campo di visualizzazione fornita da una lente GRIN 2.5x legato alla punta bundle. Movie 1 dimostra imaging in vivo del cuscinetto di grasso mammario in un modello murino. Qui, un fascio di fibre con 0,5 mm di diametro esterno (330 micron campo di vista) era passato attraverso un ago da 21 gauge e avanzato nel tessuto. Le cellule adipose sono ben visibili, con movimento a causa del ciclo cardiaco apparente in questa acquisizione a 15fotogrammi al secondo. Figura 3c mostra immagini della mucosa orale in un volontario sano, questa volta utilizzando un fascio di fibre più grande, con 1,5 mm di diametro esterno (1,4 mm campo di vista). In tutti gli esempi mostrati, proflavina è stato usato come agente di contrasto nucleare marcatura fluorescente.

Figura 1. Assemblaggio ad alta risoluzione microendoscope (HRME). (A) Schema del sistema HRME. (B) Montaggio della struttura principale di supporto optomechanical. (C) aggiunta di elementi ottici, illuminazione a LED, e camera CCD. (D) Fotografia del sistema HRME, confezionato in un 10 "x 8" x "recinto 2.5.

Figura 2. Impostazione del HRME. Esempi di immagini con la fibra ottica in fascio (a) scarsa attenzione, (b) vicino ad una buona messa a fuoco, (c) messa a fuoco ideale. In (d), un obiettivo uniforme fluorescente all'estremità distale del pacchetto è ripreso sotto Kohler (uniforme) illuminazione. (E) Un obiettivo uniforme fluorescenti ripreso in condizioni di illuminazione critiche, con la struttura sorgente apparente sull'oggetto. (F) i tessuti e le cellule allentati possono aderire al viso fascio di fibre, che è anche soggetto a danni minori alla sua periferia.

Figura 3. Imaging con il HRME. (A) 1483 cellule in vitro, ripreso con un fascio di fibre nude (IGN-08/30) a seguito di etichettatura con proflavina 0,01% (w / v). (B) Lo stesso 1483 la coltura cellulare come mostrato in (a), ripreso con un fascio di fibre ottiche con lente GRIN 2.5x allegato. (C) Immagine di normale mucosa orale umana in vivo, a seguito di applicazione topica di proflavina 0,01% (w / v).

Movie 1. Imaging il cuscinetto di grasso mammaria di un topo mediante inserimento di un bundle 450 diametro esterno in fibra di micron all'interno del lume di una 21-gauge passato nel tessuto. Proflavina 0,01% (w / v) è stato consegnato al sito di immagini attraverso lo stesso ago prima dell'inserimento della fibra di imaging. Clicca qui per guardare il video

Discussione

La tecnica ad alta risoluzione microendoscopy qui descritta fornisce ricercatori nel campo della ricerca biomedica di base e clinica con un metodo flessibile, robusta e conveniente per la visualizzazione dei dettagli cellulari in situ. Abbiamo descritto un protocollo per il montaggio del sistema di imaging e dimostrato il suo impiego in colture cellulari in vitro e in animali e tessuti umani in vivo. Mentre i risultati delle immagini qui presentate proflavina usato come agente di contrasto fluorescente, altri gruppi hanno dimostrato le versioni del sistema di illuminazione a LED con lunghezze d'onda e filtri scelti per abbinare eccitazione / emissione spettri di altri coloranti ^5-7.

Risoluzione e campo di vista sono inizialmente determinati dal core-to-core spaziatura e il diametro di imaging della fibra ottica fascio. Abbiamo utilizzato fasci di circa 4 micron nucleo-core spaziatura, l'imaging e diametri di 330 micron (filmato 1), 720 micron (Figura 2, Figura 3a, b), e 1400 micron (Figura 3c). I fasci più piccoli che possono essere passate aghi calibro più stretto e sono molto più flessibili rispetto alle fibre più grandi. Noi e gli altri ⁸ hanno, in alcuni casi, ha osservato la comparsa di emissioni di autofluorescenza dalla fibra stessa bundle. Quando si tenta di eccitare fluorofori a lunghezze d'onda UV, o raccogliere emissione nella gamma spettrale rosso, l'attenzione dovrebbe essere prestata al livello di autofluorescenza fascio di fibre che contribuiscono al segnale complessivo misurato.

Mentre la maggior parte del lavoro ad alta risoluzione microendoscopy segnalato fino ad oggi hanno utilizzato un fascio di fibre nudo, un ingrandimento extra può essere fornito da uso di lenti GRIN legato alla punta distale. Le lenti GRIN offrono un modo semplice ed economico per aumentare la risoluzione spaziale, anche se la loro suscettibilità alle aberrazioni ottiche e limitato NA è ben riconosciuta. Se l'obiettivo delle prestazioni GRIN è inadeguata per una particolare applicazione, GRIN ibrido / obiettivi lente sferica ⁹ o in miniatura assemblee lenti dell'obiettivo ^10-11 può essere impiegato.

L'alta risoluzione microendoscope qui descritto essenzialmente funziona come un grande campo epi-microscopio a fluorescenza, quindi non sezionamento ottico (come in microscopia confocale o non lineare) deve essere previsto. Nella nostra esperienza, usando luce di eccitazione 455 nm e proflavina attualità come agente di contrasto, la luce è in primo luogo raccolto da una profondità corrispondente ad un paio di strati di cellule.

Questo protocollo deve permettere al lettore di assemblaggio ad alta risoluzione microendoscope sul bancone, con un ingombro compatto di 10 "x 8". Se lo si desidera, il sistema può essere racchiuso in una scatola ed i componenti elettrici (LED e telecamera) alimentato da un pacco batteria (Figura 1d). Molte fotocamere compatte può essere alimentato da IEEE-1394 (Firewire) e le porte USB del computer host.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD camera	Point Grey Research	GRAS-14S5M
LED	Thorlabs Inc.	M455L2	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Excitation filter	Semrock	452/45	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Emission filter	Semrock	550/88	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	485 DCLP	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Objective lens	Thorlabs Inc.	RMS 10X
Tube lens	Thorlabs Inc.	AC-254-150-A1	Select focal length to achieve required magnification to CCD
Condenser lens	Thorlabs Inc.	ACL2520
Cage cube unit	Thorlabs Inc.	C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2
Cage rods and plates	Thorlabs Inc.	ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)
Fold mirror unit	Thorlabs Inc.	KCB1, PF10-03-G01
Lens tubes	Thorlabs Inc.	SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)
Adapters / couplers	Thorlabs Inc.	SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)
SMA connectors	Thorlabs Inc.	SM1SMA, 11040A
LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B TPS001
Fiber optic bundle	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	IGN-08/30	Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)