Espansione ex vivo di tumore cellule T reattive per mezzo di 1/Ionomycin Bryostatin e il Comune catena gamma Citochine Formulazione

Riepilogo

Un protocollo efficiente per la Ex vivo di tumore cellule T reattive da tumore-drenante linfonodi o altri tessuti linfatici secondari del tumore-cuscinetto ospita è descritto. Questo protocollo si espande selettivamente tumore-specifiche cellule T per l'uso in immunoterapia adottiva di cancro al seno.

Abstract

E 'stato riferito che i pazienti con cancro al seno hanno una risposta immunitaria preesistente contro i ^1,2 tumori. Tuttavia, tali risposte immunitarie non riescono a fornire protezione completa contro lo sviluppo o la recidiva di cancro al seno. Per superare questo problema aumentando la frequenza del tumore cellule T reattive, immunoterapia adottiva è stato impiegato. Una varietà di protocolli sono stati utilizzati per l'espansione del tumore-specifica delle cellule T. Questi protocolli, tuttavia, sono limitati per l'utilizzo del tumore ex vivo antigeni per l'attivazione di antigene-specifiche cellule T. Molto recentemente, comune citochine gamma catena quali IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21 sono stati utilizzati da soli o in combinazione per il miglioramento della risposta immunitaria anti-tumorale ^3. Tuttavia, non è chiaro quale formulazione avrebbe funzionato meglio per l'espansione del tumore cellule T reattive. Qui vi presentiamo un protocollo per l'attivazione selettiva e l'espansione delle cellule T tumorali-reattiva dal modello FVBN202 topo transgenico di carcinoma mammario HER-2/neu positivo per l'uso in terapia cellulare adottiva T di cancro al seno. Il protocollo prevede l'attivazione di cellule T con bryostatin-1/ionomycin (B / I) e di IL-2, in assenza di antigeni tumorali per 16 ore. B / I di attivazione imita segnali intracellulari che comportano l'attivazione delle cellule T, aumentando l'attività della proteina chinasi C e calcio intracellulare, rispettivamente ^4. Questo protocollo attiva specificamente tumore-specifica delle cellule T, mentre l'uccisione delle cellule T irrilevante. Il B / I-cellule T attivate sono in coltura con IL-7 e IL-15 per 24 ore e poi pulsato con IL-2. Dopo 24 ore, le cellule T sono lavati, divisi, e la coltura con IL-7 + IL-15 per ulteriori 4 giorni. Tumorali specificità e l'efficacia anti-tumorale della ex vivo delle cellule T espanse è determinata.

Protocollo

1. Isolamento dei linfociti ⁵

1. Isolare tumore-drenante linfonodi o milza di portatori di tumore FVBN202 topi transgenici e preparare sospensione singola cellula ghiacciato RPMI1640 supplementato con 10% FBS. B / I di attivazione in 50 ml in polipropilene risultati tubi conici in una maggiore produzione di cellule T rispetto ai tubi in polistirolo. Ketamina e xilazina vengono iniettati ip per l'anestesia. Dislocazione cervicale è utilizzato come metodo di eutanasia.
2. Coltura delle cellule (10 ⁶ cellule / ml) in terreno completo contenente 15% FBS con bryostatin-1 (5 nm) e ionomicina (1 mM) insieme a 80 U / mL di IL-2 (Peprotech) per 16 h.
3. Lavare le cellule tre volte con mezzo caldo (37 ° C) e la cultura a 10 ⁶ cellule / ml in terreno completo con IL-7 (10 ng / ml) e IL-15 (10 ng / ml) (Peprotech) per 24 ore .
4. Pulse le cellule con IL-2 (40 U / mL) per 24 h.
5. Dividere le celle e la cultura con IL-7 e IL-15 (10 ng / ml) per 4 giorni. Cambiamenti a medio e dividere le celle, se necessario, ogni 2 giorni.

2. Determinare espansione Fold delle cellule T dai conti cellulare e Citometria a flusso Analisi ⁵

1. Conta delle cellule al microscopio ottico
   1. Preparare la diluizione appropriata di cellule (1:100) in trypan blu e aggiungere alcuni microlitri su emocitometro
   2. Conte 9 quadrati e determinare il numero totale delle cellule dividendo conta delle cellule al numero di camere moltiplicato per il fattore di diluizione. I risultati saranno presenti numero x 10 ⁴ cellule / ml.
2. Determinare percentuale di CD8 + e cellule T CD4 + nelle cellule espanse mediante citometria di flusso
   1. Blocca legame non specifico degli anticorpi ai recettori Fc dalla coltura le cellule con anticorpi anti-CD16/CD32 (Biolegend) per 20 minuti in ghiaccio e poi lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS ghiacciato integrato con sodio azide 1% .
   2. Macchiare le cellule da coltura con FITC-CD4 e CD8 PE-anticorpi per 20 minuti in ghiaccio e poi lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS ghiacciato integrato con FBS 1% e sodio azide allo 0,1%.
   3. Fissare le cellule con 1% paraformaldeide ed eseguire campioni su un Beckman Coulter FC 500 e analizzare con la versione 4,3 vertice del software.

3. Determinare Tumore specificità del Vivo ex Expanded cellule T

1. Cultura della ex vivo ampliato linfociti in terreno completo con un rapporto 10:1 con irradiati neu positivo cellule tumorali MMC (15.000 rad) per 24 h. ⁵
2. Surnatanti raccolta e conservare a -80 ° C fino al momento. ^5,6
3. Rileva IFN-γ utilizzando un mouse IFN-γ ELISA set (BD Pharmingen) secondo il protocollo del produttore. ^5,6

4. Determinare antitumorale Funzione dell'ex Vivo Expanded cellule T ^5,6

1. Incubare cellule T con le cellule tumorali in un effettore 10:01: rapporti bersaglio per 48 ore in terreno completo a 3 ml di mezzo completo (RPMI-1640 integrato con 100 U / mL di penicillina, 100μg / ml streptomicina, 10% FBS, glutammina e β - mercaptoetanolo) e 20U / mL di IL-2 (Peprotech) in 6 piatti cultura ben 37 ° C / 5% di CO _2.
2. Eseguire tre macchie di colore per gli anticorpi neu (anti-c-Erb2/c-neu, clone-4, Calbiochem) seguito da PE-anti IgG di topo, annessina V-FITC e ioduro di propidio (PI), secondo il protocollo del produttore (BD Pharmingen)
3. Porta sulle cellule tumorali neu positivo e analizzare la vitalità (annessina V-/PI-) delle cellule tumorali

5. Modello murino di cancro al seno

FVBN202 topi transgenici femminile (Charles River Laboratories) può essere utilizzato per la fonte del tumore cellule T reattive. Questi topi iperespressione di uno disattivo ratto neu transgene sotto il controllo del promotore MMTV e di conseguenza lo sviluppo spontaneo di carcinoma mammario tra i 4-10 mesi di età ^7. Questi topi sviluppano premaligne iperplasia mammaria simile al carcinoma duttale in situ (DCIS) prima dello sviluppo della spontanea carcinoma8. Spontanea del tumore-cuscinetto topi sono usati come donatori di cellule T.

6. Rappresentante dei risultati:

Attivazione delle cellule T con B / I per 16 ore in risultati uccisione di cellule T naive che non sono sensibilizzati con il tumore in vivo. Dopo la B / I selettività di tumore cellule T reattive si espandono fino a 2,8 volte all'interno di un 6 giorni di cultura con citochine catena gamma (Figura 1). Entrambi i CD8 + e cellule T CD4 + sono ugualmente ampliata con citochine catena gamma (Figura 2). L'ex-vivo delle cellule T espanse mostrare reattività alta contro i tumori che i topi sono stati sensibilizzati al donatore, come valutato dalla produzione di IFN-γ in presenza di carcinoma mammario positivo del mouse neu (MMC), le cellule tumorali (Figura 3). L'ex vivo delle cellule T espanse può indurre l'apoptosi in positivo tumore cel neu MMCls tale che la vitalità delle cellule tumorali scende dal 92% al 61% entro 48 ore (Figura 4).

Figura 1. Fold espansione dei linfociti in diversi momenti seguenti B / I di attivazione (giorno 1) ed espansione ex vivo con citochine catena gamma (giorni 3, 5 e 7)

Figura 2. Percentuale totale di cellule CD4 + e CD8 + T prima e dopo 7 giorni di espansione con citochine catena di gamma.

Figura 3. Tumore stimolata la produzione di IFN-γ da parte delle cellule T isolate da topi portatori di tumore prima e dopo 7 giorni di espansione con citochine catena di gamma, con IFN-γ ELISA

Figura 4. Citotossici funzione della ex vivo delle cellule T espanse con citochine catena gamma del mouse neu contro il carcinoma mammario positivo (MMC), le cellule tumorali

Discussione

Espansione selettiva del tumore-reattiva cellule T effettrici con funzione anti-tumorale può essere ottenuto utilizzando il protocollo proposto B / I di attivazione ed espansione ex vivo con citochine catena gamma di IL-2, IL-7 e IL-15. Mentre IL-2 è un fattore di crescita delle cellule T in grado di supportare la differenziazione e l'espansione di antigene-specifiche cellule T, IL-7 in grado di inibire l'apoptosi delle cellule T e sostenere la loro vitalità durante l'espansione. IL-15 può suppo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bryostatin 1	Sigma-Aldrich	B7431-10ug
Ionomycin	Calbiochem	407950
Mouse IL-7	PeproTech Inc	217-17
Mouse IL-15	PeproTech Inc	210-15
Human IL-2	PeproTech Inc	200-02
RPMI1640	Invitrogen	11875
FBS	Gemini Bio Products	100-106
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
L- glutamine	Invitrogen	25030081
β- mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
anti-CD16/32 antibody	Biolegend	101302
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit	BD Biosciences	556547
FITC-CD4	Biolegend	100406
PE-CD8	Biolegend	100708
anti-c-Erb2/c–Neu	Calbiochem	OP16
PE- anti mouse IgG	Biolegend	405307
formaldehyde	Polysciences, Inc.	04018
Hemocytometer	Hycor	87144
Light microscope	VWR international	V200073
Mouse IFN-γ ELISA set	BD Biosciences	555138
Cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175