Microdissezione di Black Widow Spider Silk ghiandole che producono

Riepilogo

Qui si descrive una strategia efficace per rimuovere la seta ghiandole che producono con l'addome della femmina ragni vedova nera. Questa procedura permette l'isolamento rapido della seta producono sette distinte ghiandole in un modo altamente purificato, un importante processo di ricercatori che studiano la produzione della seta di ragno e l'assemblaggio delle fibre.

Abstract

Ragni moderni rotazione ad alte prestazioni fibre di seta con una vasta gamma di funzioni biologiche, compresa la cattura delle prede locomozione, lo sviluppo e la protezione di ^1,2 figli. Ragni eseguire queste operazioni da diversi tipi di filatura di fibre distinte che hanno diverse proprietà meccaniche. Specializzazione di tale tipi di fibre si è verificato attraverso l'evoluzione delle diverse ghiandole che producono la seta, che funzionano come biofabbriche di piccole dimensioni. Queste produzione biofabbriche e archiviare grandi quantità di proteine ​​della seta alla produzione di fibre. Attraverso una complessa serie di eventi biochimici, queste proteine ​​della seta vengono convertite da un liquido in un materiale solido su di estrusione.

Gli studi hanno dimostrato che la meccanica seta di ragno sono più forti di acciaio ad alta resistenza ^3. Le analisi per comprendere la relazione tra la struttura e la funzione di fili di seta di ragno hanno rivelato che la seta di ragno è costituito in gran parte delle proteine, o fibroins, che hanno ripete blocco all'interno del loro sequenze di proteine ^​​4. Comune firme molecolari che contribuiscono alla resistenza alla trazione incredibile e l'estensibilità di seta di ragno vengono svelati attraverso l'analisi di cDNA seta tradotte. Date le straordinarie proprietà del materiale di ragno sete, laboratori di ricerca in tutto il mondo fanno a gara per capire e simulare il processo di filatura per la produzione di fibre di seta sintetica per applicazioni commerciali, industriali e militari. Una delle sfide principali di filatura della seta artificiale ragno in laboratorio di ricerca comporta una completa comprensione dei processi biochimici che si verificano durante l'estrusione di fibre della seta ghiandole che producono.

Qui vi presentiamo un metodo per l'isolamento di sette diverse ghiandole che producono la seta dal ragno cobweaving vedova nera, che include le ghiandole ampullate maggiori e minori [produce seta dragline e ponteggi] ^5,6, tubuliform [seta uovo sintetizza caso] ^{7 , 8,} flagelliform [funzione sconosciuta in pannocchia-tessitori], aggregato [rende seta colla], aciniforme [preda sintetizza il confezionamento e le discussioni caso uovo] ⁹ e piriforme [attaccamento produce seta disco] ^10. Questo approccio si basa su anestetizzare il ragno con il gas di anidride carbonica, successiva separazione del cefalotorace con l'addome, e microdissezione del ventre per ottenere le ghiandole che producono la seta. Dopo la separazione dei diversi seta ghiandole che producono, questi tessuti possono essere utilizzati per recuperare le macromolecole diverse per distinte analisi biochimiche, tra cui quantitativa real-time PCR, nel nord-ovest e assorbente, la spettrometria di massa (MS o MS / MS), analisi per identificare nuove sequenze di proteine ​​della seta, ricerca per le proteine ​​che partecipano al percorso di assemblaggio di seta, o utilizzare il tessuto intatto per colture cellulari o esperimenti istologici.

Protocollo

1. Anestetizzare il ragno e l'isolamento del ventre

1. Trasferire il ragno da un vaso di vetro in una scatola di cartone foderato con plastica (Figura 1A). Noi di solito raccolgono ragni da cataste di legna, garage o cespugli e ospitarli in laboratorio in contenitori di vetro. Perché il ragno non può salire il rivestimento in plastica, fornisce un metodo efficiente per trasferire il ragno da un vaso di vetro o di latta di caffè in una piccola fiala per scopi anestetizzante. Durante la manipolazione del ragno, a questo punto, si dovrebbe indossare due paia di guanti in lattice o guanti da giardinaggio per motivi di sicurezza.
2. Mentre il ragno è in cassa foderata con la plastica, l'approccio del ragno dalla sua parte posteriore e lascia la diapositiva ragno nel flaconcino cultura di plastica. Dopo il ragno entra nella fiala, immediatamente posto il tappo sopra la parte superiore (Figura 1B). Si consiglia di utilizzare un flacone che è di circa 101,6 millimetri x 31,75 millimetri (L x P). Questo minimizza la quantità di anidride carbonica necessaria per la fase di anestetizzante.
3. Anestetizzare il ragno con l'introduzione di anidride carbonica a 5-10 libbre per pollice quadrato per 10 min (Figura 1C). Questa quantità di gas solo battere il ragno fuori per circa 5 minuti, così dopo anestesia si deve immediatamente procedere ai passaggi 1,4-1,5.
4. Posizionare il ragno anestetizzato in un piatto dissezione piccole e utilizzare pinze per posizionare il lato dorsale fino ragno (clessidra rosso rivolto verso il basso).
5. Agganciare il pedicello (fusto stretto che collega il cefalotorace e l'addome) per rilasciare l'addome dal resto del ragno (Figura 1D). Conservare il cefalotorace nel congelatore durante la notte in una capsula di Petri e scartare dopo congelato il giorno successivo. Fare attenzione quando si sposta il cefalotorace come le zanne del ragno sono presenti su questo segmento.
6. Fissare l'addome al materiale Sylgard nel piatto dissezione piccolo utilizzando un singolo pin di insetti. Inserire il perno degli insetti attraverso il foro fatto dal ritaglio pedicello (figura 1E). Questo può essere facilmente identificata come il luogo in cui il fluido è che emerge dal taglio della pedicello. Assicurarsi che la filiera (estremità opposta del pedicello) è orientata verso il basso (più vicino).

2. La rimozione del esoscheletro

1. Fare la prima incisione attraverso l'esoscheletro usando un paio di microscissors, partendo dal foro dal ritaglio pedicello. Tagliare lateralmente fino a quando il lato dorsale si raggiunge su entrambi i lati (Figura 1F). Usando un paio di pinze, staccare il segmento anteriore esoscheletro e inserire un secondo perno in questa posizione. Dopo l'inserimento del secondo perno, girare il vassoio dissezione caudale (90 ° angolo) dai tagli laterali iniziale e continuare a tagliare fino al raggiungimento filiere (figura 1G). Questa incisione sarà perpendicolare o verticale per il taglio iniziale laterale. Non tagliare le filiere in cui l'incisione verticale è fatto (relativamente posteriori alla clessidra e ha un aspetto circolare). Il mancato inserire il secondo perno si tradurrà in addome filatura quando le incisioni verticali vengono eseguiti.
2. Immergere l'addome nella dissezione soluzione tampone (0,1 M cloruro di sodio, citrato di sodio 0,015 M, 0,1% dietilico pirocarbonato).
3. Sbucciate l'esoscheletro residua a partire dalla iniziale, incisione laterale. Quando questo è completato, il tessuto adiposo deve essere chiaramente visibile (Figura 1H).

3. Isolamento della seta ghiandole che producono

1. Forcipe utilizzando cominciare prendere in giro via lo strato di grasso (Figura 1H). Il grasso avrà un aspetto biancastro a giallastro. Continuare fino a quando la maggior parte del grasso viene rimosso e le ghiandole della seta sono chiaramente visibili. La ghiandola tubuliform è composto da tre coppie di molto lungo, tubi cilindrici che sono abbondanti nella cavità addominale. Il ampullate principali, che si trova in coppia, è un grande ampolla a forma di mezzaluna con una lunga coda contorti distali e prossimali un condotto che riduce in larghezza che si avvicina filiere del ragno. Il ampullate minori è molto simile nella morfologia del ampullate importanti, ma è significativamente più piccola. La ghiandola flagelliform, si verificano anche in coppia, è rotonda e multilobari con un cilindrico piccolo zig-zag condotto che si estende verso il filiere. La ghiandola aggregato (che si trova in coppia) è un grande, ghiandola multilobari che ha un dotto escretore di grandi dimensioni che ha grandi lobi irregolari su di esso. Le ghiandole aciniforme si verificano in gran numero e assomigliano a breve, proiezioni fingerlike piccoli. La ghiandola piriforme è la più piccola ghiandola nell'addome e ha molte compattato, condotti cilindrica che assomigliano a un ventilatore con molti dotti escretori piccoli che si estendono fino al filiere.
2. Si consiglia di rimuovere le ghiandole nel seguente ordine: tubuliform, ampullate importanti, flagelliform, ampullate minori, aggregati, aciniforme, e poi il piriforme (Figura 2A-B).
3. A partire dal tubuliform, prendere in giro queste ghiandole fuori del resto del secologhiandole e - dovrebbero essere seduto sulla cima delle altre ghiandole (Figura 2A). Ci sono tre coppie di ghiandole tubuliform in un ragno singolo. Consentire loro di galleggiare liberamente, ma rimangono attaccati alla loro filiere da loro condotti.
4. Poi, via i stuzzicare ghiandole ampullate principali. Ci sono due ghiandole ampullate principali presenti in un ragno. Durante la procedura di rimozione, assicurarsi che i condotti rimangono attaccati alle ghiandole (Figura 2A).
5. Continuare a stuzzicare il resto delle ghiandole distanza gli uni dagli altri, lavorando con attenzione per evitare la puntura qualsiasi delle ghiandole, in particolare l'aggregato e delle ghiandole flagelliform. Ogni ghiandola dovrebbe essere libero flottante fino al punto di uscita in esoscheletro al filiere. Queste ghiandole si trovano anche in coppia. Rimuovere ogni ghiandola pizzicando il condotto con una pinza e tirare con cura fino a quando non si stacca dal punto di uscita. Il ampullate principali, flagelliform, ampullate minori, e le ghiandole aggregati si trovano a coppie. Le ghiandole aciniforme e piriforme si verificano in molte coppie più.
6. Rimuovere ogni ghiandola pizzicando il condotto con una pinza e tirare con cura fino a quando non si stacca dal punto di uscita dalla filiera. Noi di solito archiviare le ghiandole bagnato, tuttavia, non aggiungere ulteriore cuscinetto.
7. Come le ghiandole vengono rimossi, mettetele in sterili pre-etichettati tubi da 1,5 ml microcentrifuga. Ghiandole individuale sono indicati nella figura 3A-G. Tenere queste ghiandole sul ghiaccio e poi il flash li congelare in azoto liquido. A seguito di congelamento flash in azoto liquido, deve tenerli a -80 ° C per la conservazione.

4. Rappresentante Risultati

Durante la rimozione delle ghiandole differenti, la cura estrema dovrebbe essere presa durante la manipolazione del flagelliform e delle ghiandole aggregata, in quanto queste due strutture possono essere facilmente perforati e danneggiato con le pinze. Inoltre, vale la pena notare che morfologicamente le ghiandole flagelliform e aggregati sono molto simili prima della loro rimozione e sono spesso intrecciate tra loro. Per evitare la contaminazione incrociata di questi tessuti dopo la rimozione, il dissettore attentamente prendere in giro queste strutture a parte. Inoltre, dopo l'esposizione iniziale della seta ghiandole che producono, le ghiandole aciniforme piriforme e sarà la più difficile da visualizzare immediatamente a causa della loro dimensione e della localizzazione anatomica. Spesso vi è la presenza di molte uova. Inoltre, la cura supplementare deve essere presa durante la rimozione della ghiandola piriforme, in quanto questo tessuto è estremamente appiccicoso e spesso aderiscono al forcipe. Quando questa procedura viene effettuata correttamente, è possibile ottenere tutte e sette le ghiandole che producono la seta di un ragno solo in un modo altamente purificato. Tipicamente, si può recuperare quantità microgrammi di RNA totale e proteine ​​da una dissezione ragno singolo. Un esempio di utilizzo del RNA totale per qPCR di esaminare i livelli di mRNA di un gene tubuliform limitato fibroina, TuSp1, viene visualizzato (Figura 4). Esperimenti di rappresentanza che coinvolgono proteine ​​lisati raccolti dalle ghiandole ad esempio in soluzione digestione trittico seguito da MS (potrebbe anche essere utilizzato per MS / MS) o un aminoacido analisi composizione in acidi è mostrato (Figura 5-6, rispettivamente).

Figura 1. Manipolazione, anestetizzante, e la rimozione del esoscheletro dall'addome di un ragno femmina vedova nera. A) Cessione del ragno in una scatola di cartone rivestito in plastica per facilitare lo spostamento il ragno in un flacone di plastica più piccoli. B) Spider inserito in una fiala di plastica con tappo. C) Anestesia il ragno con il gas di anidride carbonica. D) La separazione del cefalotorace con l'addome con microscissors. E) Immobilizzazione dell'addome nel cassetto sezionare con perni di insetti. F) Visualizza dopo una incisione laterale è realizzato con le forbici e una porzione di esoscheletro è sbucciata indietro con le pinze. G) Le incisioni in corso perpendicolare al taglio iniziale laterale. H) La rimozione del esoscheletro e l'esposizione dello strato di grasso.

Figura 2. Visualizzazione dei sette diverse ghiandole che producono la seta, mentre intatto nell'addome del ragno così come i tessuti circostanti. A) Immagini della tubuliform, ampullate importanti, flagelliform, aggregare, tessuti ampullate minori con ingrandimento 12X. B) Immagine delle ghiandole aciniforme e piriforme con ingrandimento 12X.

Fotografie Figura 3. Dei sette seta ghiandole che producono dopo la loro rimozione dall'addome. Tutte le immagini sono state catturate a 20X di ingrandimento, con l'eccezione del aciniforme e ghiandole piriforme, che sono stati fatti a 40X. A) maggioreampullate ghiandola; B) ampullate maggiori e minori (lato destro) per la valutazione del peso; C) tubuliform; D) flagelliform; E) aggregato, F) aciniforme; G) piriforme.

I risultati rappresentativi figura 4. Dei pattern di espressione del gene di seta, TuSp1, dopo i rilievi TuSp1 livelli di mRNA nelle diverse ghiandole che producono la seta (esclusa la ghiandola piriforme) utilizzando quantitativa real-time PCR (qPCR) isolamento successivo di RNA totale da le ghiandole.

Figura 5. Esempio di analisi MS di estratti proteici ottenuti dalla ghiandola piriforme seguenti soluzione digestione trittico. Nota: x2 rappresenta 2 volte ingrandimento di intensità dello spettro. Spettro masse di ioni peptide che corrispondono alle regioni del fibroina PySp1 sono indicati con il simbolo #.

Figura 6. Risultato tipico del profilo di composizione amino acidi delle proteine ​​estratte dalla ghiandola tubuliform. Nota: ASX = Asp e Asn; GLX = Glu e Gln. Colorazione blu riflette aminoacidi con gruppi polari catena laterale, mentre la colorazione rossa rappresenta residui di aminoacidi con gruppi laterali non polari a catena.

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Discussione

La nostra metodologia per la microdissezione della seta ghiandole che producono dalla vedova nera offre un mezzo efficace per ottenere altamente purificato seta ghiandole che producono. Dissezioni può essere completato in 1,5 a 3 ore, producendo un set completo di sette distinte seta ghiandole che producono da cobweavers. Ottenere altamente purificato seta ghiandola campioni consente agli investigatori la possibilità di eseguire una vasta gamma di studi biochimici, inclusa l'identificazione di seta o di nuove prot...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Electron Microscopy Sciences	SX0420-1	0.1 M in water
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758 - 5 ml	0.1% v/v
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804 - 1 kg	0.015 M in water
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica MZ16
Digital microscope camera	Leica Microsystems	DFC320	Software - Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors	World Precision Instruments, Inc.	500260
Stainless steel forceps	World Precision Instruments, Inc.	501764	Mini Dumont #M5S
Insect pins	Indigo Instruments	33414-2	Insect pins #2
Small or large dissection dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S or DD-90-S	52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm
Drosophila culture vials	Carolina Biological	FR-17-3076	Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm