Un Microfluidic basato Trappola idrodinamico per particelle singole

Riepilogo

In questo articolo presentiamo una microfluidica metodo basato per il confinamento delle particelle sulla base del flusso idrodinamico. Dimostriamo cattura stabile di particelle in un punto di ristagno del fluido utilizzando un meccanismo di controllo del feedback, consentendo in tal modo confinamento e micromanipolazione di particelle arbitrari in un microdispositivo integrato.

Abstract

La capacità di limitare e manipolare singole particelle in soluzione gratuita è una tecnologia abilitante fondamentale per la scienza di base e applicata. Metodi per la cattura di particelle basati su tecniche ottiche, magnetiche, elettrocinetico e acustico hanno portato a grandi progressi nel campo della fisica e della biologia molecolare che vanno dalla a livello cellulare. In questo articolo introduciamo un nuovo microfluidica a base tecnica per la cattura e la manipolazione di particelle basato esclusivamente sul flusso del fluido idrodinamica. Utilizzando questo metodo, dimostriamo cattura di particelle micro-e nano-scala in soluzioni acquose per tempi lunghi. La trappola idrodinamica è costituita da un dispositivo integrato microfluidica con un cross-slot geometria del canale in cui due flussi laminari opposti convergono, generando così un flusso planare estensionale con un punto di ristagno del fluido (zero-velocità di punto). In questo dispositivo, le particelle sono confinate al centro trappola per il controllo attivo del campo di moto per mantenere la posizione delle particelle al punto di ristagno di liquidi. In questo modo, le particelle sono effettivamente intrappolate in soluzione libera utilizzando un algoritmo di controllo di feedback implementato con un custom-built codice LabVIEW. L'algoritmo di controllo è costituito da acquisizione di immagini per una particella nel dispositivo a microfluidi, seguita da monitoraggio delle particelle, la determinazione della posizione delle particelle baricentro, e la regolazione attiva del flusso del fluido, regolando la pressione applicata ad un on-chip valvola pneumatica con un regolatore di pressione. In questo modo, l'on-chip le funzioni dinamiche valvola dosatrice per regolare le portate relativa nei canali di uscita, consentendo così a scala fine il controllo della posizione del punto di stagnazione e di cattura delle particelle. La microfluidica a base di trappola idrodinamica mostra diversi vantaggi come metodo per la cattura delle particelle. Cattura idrodinamica è possibile per ogni particella arbitrario senza requisiti specifici sulle proprietà fisiche o chimiche dell'oggetto intrappolati. Inoltre, intrappolando idrodinamico permette il confinamento di un oggetto "unico" obiettivo di particelle in sospensione concentrata o affollati, che è difficile usare la forza alternativa di campo basati su metodi di cattura. La trappola idrodinamica è user-friendly, semplice da implementare e può essere aggiunto agli attuali dispositivi microfluidici di agevolare l'analisi cattura e di lunga data di particelle. Nel complesso, la trappola idrodinamica è una nuova piattaforma per confinamento, micromanipolazione, e l'osservazione di particelle senza immobilizzazione superficiale ed elimina la necessità per i campi ottici, magnetici ed elettrici potenzialmente perturbativi nella libera soluzione cattura di particelle di piccole dimensioni.

Protocollo

La trappola idrodinamica è costituito da un doppio strato ibrido (polidimetilsilossano (PDMS) / vetro) dispositivo a microfluidi per il confinamento delle particelle. Passi 1-2 descrivere fabbricazione di dispositivi microfluidica, e Piazza di 3-4 progettazione di dispositivi discutere e il funzionamento.

1. SU-8 di fabbricazione di stampi (non mostrato in video)

1. Pulire due wafer di silicio (3 "di diametro) con acetone e alcool isopropilico (IPA).
2. Wafer a secco con N ₂ e metterli su una piastra a 65 ° C per 1 min per rimuovere l'umidità residua.
3. Spin wafer cappotto # 1 con SU-8 2050 photoresist (PR) per 30 sec a 4000 giri per creare un ~ 40 micron di spessore stampo per lo strato di fluido. Spin wafer cappotto # 2 con PR per 30 sec a 1500 giri al minuto per creare uno stampo ~ 150 micron di spessore per il livello di controllo.
4. Morbido wafer cuocere # 1 a 65 ° C per 3 minuti e poi a 95 ° C per 6 min. Morbido wafer cuocere # 2 a 65 ° C per 5 minuti e poi a 95 ° C per 20 min.
5. Esporre ai raggi UV wafer con le loro maschere rispettivi (wafer # 1: porti e canali fluidici, wafer # 2: porta e livello di controllo) e l'intensità di esposizione appropriato (~ 150 mJ / cm ^2, ~ 260 mJ / cm ² rispettivamente).
6. Messaggio wafer cuocere # 1 a 65 ° C per 1 minuto e poi a 95 ° C per 6 min. Messaggio # 2 wafer cuocere a 65 ° C per 5 minuti e poi a 95 ° C per 10 min.
7. Sviluppare wafer con acetato di glicole propilenico metil etere (PGMEA) fino a quando non polimerizzato PR è stato rimosso. Sciacquare wafer con IPA e asciugare con N _2.

2. Dispositivo di fabbricazione Microfluidic

1. Silanize la superficie del SU-8 stampi mettendo il wafer in un essiccatore sotto vuoto per circa 10 minuti con un piatto di vetro contenente alcune gocce di triclorosilano. Silanizzazione superficie aiuta a pelare le (PDMS) repliche fuori dal SU-8 stampi.
2. Mescolare e degas PDMS in base: reticolante rapporto di 15:1 e 5:1 per la fluidica e livelli di controllo, rispettivamente.
3. Spin mano l'impasto 15:01 PDMS sullo stampo strato fluidica (wafer # 1) per 30 secondi a 750 giri al minuto e posizionare il wafer in una capsula di Petri. Mettere lo stampo livello di controllo in una piastra di Petri e versare 05:01 miscela PDMS sullo stampo di uno spessore di circa 4 mm.
4. Wafer cuocere / PDMS per 30 minuti a 70 ° C per curare parzialmente gli strati PDMS.
5. Dopo il raffreddamento dei wafer / PDMS a temperatura ambiente, tagliare la replica PDMS, che andranno a formare il livello di controllo (wafer # 2), dalla piastra di Petri con un bisturi e staccatelo il SU-8 stampo. Fori di una porta di accesso al microcanali che fungerà on-chip valvola a membrana con un ago calibro 21.
6. Luogo la replica PDMS con il livello di controllo sul wafer # 1 (che ha lo spin-rivestito PDMS strato fluido). Allineare con cura e sigillare il livello di controllo per lo strato fluidico utilizzando un microscopio stereo. Assicurarsi di rimuovere tutte le bolle d'aria tra gli strati e cuocere in forno a 70 ° C durante la notte per curare completamente entrambi gli strati. Questa fase di cottura si tradurrà in una lastra monolitica PDMS con due strati.
7. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, tagliare e sbucciare la replica PDMS che contiene sia il controllo e gli strati fluidico fuori dal SU-8 stampo utilizzando un bisturi. Rimuovere l'eccesso PDMS e separare ogni unità dispositivo con una lama di rasoio. Foro di porte di accesso pugno al microcanali nello strato fluidico con un ago calibro 21.
8. Legame la lastra PDMS di un coprioggetto per ottenere un dispositivo completo. In primo luogo, pulire un coprioggetto (No: 1,5, 24 x 45 mm) con acetone e IPA. Quindi, trattare sia il coprioggetto e le superfici replica PDMS con plasma di ossigeno meno di 500 mTorr per 30 secondi, e subito porta le due superfici a contatto per formare un sigillo irreversibile.
9. Cuocere i dispositivi durante la notte per aumentare legame tra gli strati PDMS e il coprioggetto.

Descrivere i passaggi 3-4 attuazione del trappola idrodinamica utilizzando il dispositivo a microfluidi descritto sopra.

3. Trappola installazione idrodinamica sperimentale

1. Posizionare il dispositivo a microfluidi sul palco di un microscopio invertito e fissarlo con clip palco.
2. Riempire due siringhe a tenuta di gas separatamente con soluzioni tampone e il campione e metterli su una pompa siringa Harvard Apparatus (PHD 2000 programmabili). Il buffer e le soluzioni campione sono consegnati al dispositivo a microfluidi attraverso un 1 ml e una siringa da 250 microlitri, rispettivamente. Tipicamente, un 50 mm Tris / soluzione tampone Tris HCl (pH 8,0) contenente 0,02% v / v Triton X-100 è utilizzato come soluzione tampone. La soluzione del campione è costituito da una sospensione di particelle (ad esempio perle di polistirene fluorescente) nella soluzione tampone.
3. Stabilire le connessioni tra le siringhe fluidico (consegna del campione e il buffer) e il dispositivo a microfluidi. Collegare le siringhe a 1 / 16 "di diametro esterno (OD) x 0,020" diametro interno (ID) perfluoroalkoxy (PFA) tubi con luer-lock adattatori. Collegare l'altra estremità del tubo PFA alle porte di ingresso del dispositivo a microfluidi con 24 meta manometrol tubi. Un T-valvola può essere posto tra il campione e la siringa porta campione del dispositivo a microfluidi per controllare la consegna del campione.
4. Stabilire le connessioni fluidico per i canali di sbocco nel dispositivo microfluidica. Collegare i due canali di uscita a tubi PFA (1 / 16 "OD x 0,020" ID) utilizzando 24 tubi metallici calibro. Il tubo in PFA per le prese devono essere di uguale lunghezza. Immergere due tubi di scarico in una provetta da centrifuga 1,5 ml riempito con una soluzione tampone, che serve a mantenere un costante calo di pressione tra le siringhe ei canali di uscita.
5. Compilare on-chip valvola con olio vettore fluorurati con un 3 ml luer-lock siringa di plastica per evitare che l'aria fuoriuscita nello strato fluido durante il funzionamento. L'aria nella camera della valvola viene spinta attraverso la membrana PDMS in microcanali nello strato fluido e poi rimosso dal dispositivo con il flusso del fluido attraverso le porte di uscita.
6. Collegare una pressione di gas inerte (azoto) l'alimentazione della porta nel livello di controllo per il chip funzionamento della valvola. A questo scopo, usiamo un serbatoio di azoto (2200 psi) e un regolatore di pressione elettronico per la fornitura di 0-30 bar alla valvola on-chip nel dispositivo microfluidica. Il serbatoio di azoto è collegato al regolatore di pressione con tubi da ¼ "OD x 0,170" ID. Il regolatore di pressione è collegato al dispositivo a microfluidi con 1 / 16 "OD x 0.020" tubi ID PFA con 24 tubi in metallo misuratore suo capolinea.
7. Sciacquare i collegamenti fluidi e il dispositivo a microfluidi con 0,5 ml di soluzione tampone per garantire che tutte le bolle d'aria vengono rimossi dal sistema compresi i canali di uscita. Portate tipiche utilizzate per la compensazione gamma bolle tra 2000-5000 microlitri / ora. Dopo le bolle d'aria vengono risciacquati fuori dei canali microfluidica, ridurre la portata a 50-100 microlitri / h, che è una tipica portata volumetrica per intrappolare particelle.
8. A questo punto, le connessioni sono stabilite fluidica, il campione e le soluzioni tampone sono consegnati al dispositivo a microfluidi con un flusso fisso (50-100 microlitri / ora), e il dispositivo è pronto per la cattura idrodinamica.

4. Trapping procedura idrodinamico

1. Eseguire il custom-built codice LabVIEW, che automatizza la cattura delle particelle (si veda la nota di utilizzo per LabVIEW codice qui sotto).
2. Utilizzando il microscopio xy traduzione fase, la posizione della regione cattura (cross-slot) al centro della vista della telecamera. Portare la regione cattura a fuoco della lente obiettiva e regolare le impostazioni della fotocamera per ottimizzare le condizioni di imaging.
3. Scegli una regione rettangolare di interesse (ROI) nel campo visivo della telecamera di vista in modo tale che il centro del ROI sarà la posizione del centro trappola.
4. Inizializzare la pressione di offset applicate alla valvola on-chip. In uno dei canali di uscita, una costrizione 100-200 micron gamma è introdotto per fornire una pressione di offset per l'on-chip valvola. La costante off-set pressione consente on-chip valvola per regolare la posizione di punto di ristagno in prossimità del centro del canale cross-slot. Per la maggior parte degli esperimenti, la pressione di offset è impostato tra 0-12 psi a seconda delle dimensioni del canale (altezza e larghezza), la larghezza costrizione, e le specifiche della valvola on-chip (diametro della valvola, spessore della membrana, ecc.)
5. Avviare il controller di feedback e regolare il guadagno proporzionale per ottimizzare la risposta trappola. Il controller feedback regolare la pressione applicata al on-chip della valvola per spostare la posizione del punto di ristagno, che minimizza l'errore o la distanza tra la posizione delle particelle e il set point (centro trappola). A seconda della portata e l'on-chip posizione della valvola, c'è un valore ottimale guadagno proporzionale, il che aumenta la stabilità trappola ed elimina le oscillazioni delle particelle indesiderate.
6. Trappola per una particella. Il codice LabVIEW automaticamente trappola una delle particelle che entrano nella regione di cattura. Una volta che una particella desiderato è intrappolato, è possibile spegnere il flusso del campione e isolare la particella intrappolata in una soluzione tampone, se lo si desidera.
7. Monitorare le particelle intrappolate e mantenere la concentrazione delle particelle all'interno del piano immagine con messa a fuoco manuale o un automatico di impostazione microscopio fuoco. Potrebbe essere necessario modificare leggermente il guadagno proporzionale del regolatore di feedback al fine di garantire la stabilità trappola nel corso di una lunga scala temporale dell'evento trapping (minuti a ore).

Codice LabVIEW: Nota di utilizzo per controller commenti

Cattura delle particelle automatizzati è realizzato utilizzando un algoritmo di controllo lineare di feedback implementato mediante un codice personalizzato LabVIEW. Il codice LabVIEW acquisisce immagini da una fotocamera CCD e trasmette un potenziale elettrico (tensione) di un regolatore di pressione, che modula attivamente la posizione (stato parzialmente aperto / chiuso) di un on-chip valvola pneumatica dinamica. Come cambia la posizione della valvola, il flusso idrodinamico in una linea di uscita is regolata, in modo da ri-posizionamento del punto di stagnazione e consentendo cattura idrodinamica. I passi nel circuito di retroazione sono in sequenza e iterativamente eseguito alla velocità di acquisizione dell'immagine (10-60 Hz). Il codice LabVIEW esegue le seguenti operazioni durante ogni ciclo di feedback:

• . Acquisizione di immagini Un'immagine viene acquisito per una particella "target" nella regione cattura del dispositivo a microfluidi mediante microscopia a fluorescenza con una lente obiettivo 10x (NA: 0,4) e una camera CCD.
• Tracciamento di particelle. Particelle posizione centroide è determinata, e l'algoritmo di tracciamento di particelle viene avviata. Le particelle sono localizzate inserendo il profilo intensità di emissione delle particelle a una funzione di diffusione del punto (PSF), da cui si determina la posizione di baricentro.
• Campo di controllo del flusso. La pressione aggiornato destinati al on-chip valvola dinamico viene calcolato utilizzando un algoritmo di controllo di feedback, con un controllore proporzionale. In questo modo, l'azione della valvola è di riposizionare il punto di stagnazione, che esercita una forza idrodinamica sulla particella in modo da guidare la particella verso il centro trappola.

Il codice LabVIEW registra i seguenti dati per ogni immagine catturata durante la cattura delle particelle: 1) il tempo trascorso, 2) baricentro (x, y) la posizione della particella intrappolata, 3) la posizione del centro della trappola, 4) distanza della particella dal pressione trappola centro, 5) applicato alla valvola on-chip. Inoltre, il codice registra anche un film della particella intrappolata in formato AVI.

5. Rappresentante Risultati

Siamo intrappolati perle di polistirene fluorescenti di varie dimensioni (100, 540, 830 nm e 2,2 micron di diametro) con una trappola idrodinamica. Figura 1 (a) mostra l'immagine di una particella intrappolata al cross-slot di giunzione in un dispositivo a microfluidi. La traiettoria di una particella intrappolata possono essere determinati direttamente dai dati di posizione centroide registrati dal codice LabVIEW durante un evento di cattura o di tracciamento e la localizzazione delle particelle intrappolate dal filmato registrato. Figura 1 (b) mostra la traiettoria di una particella intrappolata (2,2 micron fluorescenti di polistirene tallone) lungo la direzione del canale di uscita. Il tallone è inizialmente intrappolato (quadrati) per 3 minuti e poi viene liberato dalla trappola e scappa lungo uno dei canali di uscita (cerchi). Traiettorie delle particelle lungo l'asse del flusso di compressione (in direzione del canale di ingresso, dati non riportati) sono simili a traiettorie delle particelle lungo l'asse del flusso estensionale (direzione di deflusso) come mostrato nella Figura 1 (b). Un istogramma di spostamento delle particelle dal centro della trappola per un intrappolato tallone (2,2 micron di diametro) lungo le direzioni il canale di uscita è mostrata in Figura 1 (c). Utilizzando l'algoritmo di controllo del feedback descritti in questo lavoro, le particelle intrappolate sono confinati all'interno di ± 1 micron del centro trappola lungo la direzione del canale di ingresso e di uscita.

Uno schema del dispositivo a microfluidi utilizzato per intrappolare idrodinamico è mostrato nella Figura 2. Il dispositivo integrato microfluidica costituito da uno strato fluido e un livello di controllo ed è fabbricato utilizzando le normali litografia multistrato morbido come descritto in questo articolo. Lo strato fluidico contiene i canali di buffer e del campione, così come la croce slot geometrie canale per facilitare la cattura idrodinamica. Il livello di controllo è costituito da una valvola pneumatica posizionato sopra uno dei canali di sbocco nello strato fluidico, e il controllo e strati fluidici sono separate da una sottile membrana elastomerica. Durante il funzionamento del dispositivo, la valvola a livello di controllo è pressurizzato con azoto, che costringe la sottile membrana nello strato fluido, in modo da indurre una costrizione nel canale di uscita. La valvola pneumatica dinamica restringe il canale di uscita per importi variabili modificando la pressione esercitata sul livello di controllo, che regola le portate relativa nei canali di uscita e consente a scala fine il controllo del punto di stagnazione.

Figura 1: Trapping particelle. (A) immagine di un unico cordone confinati nella trappola idrodinamica. In aggiunta al tallone al centro trappola, diverse perline non catturabile sono mostrati nella regione di cattura. (B) Traiettoria di una particella intrappolata lungo i canali di sbocco (quadrati). Quando la particella viene rilasciato dalla trappola (freccia), sfugge a lungo uno dei canali di uscita (cerchi). (C) Istogramma degli spostamenti di una trappola tallone (2,2 micron di diametro) dal centro della trappola lungo i canali di uscita.

Figura 2:. Schematica del dispositivo a microfluidi per la cattura di idrodinamica La trappola idrodinamica è costruito utilizzando una a due strati dispositivo a microfluidi. Lo strato fluidico è costituito da un ingresso del campione, fil nostro insenature tampone, e due uscite dei rifiuti. Il livello di controllo è costituito da una valvola a membrana pneumatica situato sulla cima di uno dei canali di uscita nello strato fluido. Una costrizione nel canale di uscita opposte fornisce una pressione di offset per la valvola pneumatica. Dimensioni tipiche canale compreso tra 100-500 micron. Nella regione (A), ingresso del campionatore flusso focalizzato da due insenature buffer. Nella regione (B), i flussi di ingresso opposte convergono alla croce slot incrocio dove si cattura. La valvola pneumatica (C) è posizionato in cima ad uno dei canali di uscita. La posizione del punto di ristagno è modulata regolando la pressione di questa valvola.

Discussione

Gli attuali metodi di microfluidica per la manipolazione di particelle sulla base del flusso idrodinamico può essere caratterizzato come i metodi di contatto-based o senza contatto. Contatta metodi basati utilizzare il flusso del fluido per confinare fisicamente e immobilizzare particelle contro le pareti del canale microfabbricazione ^9, mentre i non-contatto metodi si basano sulla circolazione del flusso o microeddies ^10. In questo lavoro, presentiamo un metodo per la soluzione di free-cattura di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 gauge blunt needle	Zephyrtronics	ZT-5-021-1-L	For punching port holes in PDMS
3 ml plastic syringe	BD Biosciences	309585	For filling valve with oil
Si wafers	University Wafer		3” P(100) single side polished 380 μm test grade
Cover glass	VWR international	48404-428	24 x 40 mm #1.5
DAQ card	National Instruments	PCI 6229
Fluorescent beads	Spherotech, Inc.	FP-2056-2	2.2 μm Nile red
Fluorinert	3M	FC 40	Fluorinated carrier oil
Inverted Microscope	Olympus Corporation	IX-71
LabVIEW	National Instruments	Version 9.0f3 (32bit)
Stereo Microscope	Leica Microsystems	MZ6	For aligning PDMS control layer to fluidic layer.
Mechanical Convection Oven	VWR international	1300U	For baking devices to create monolithic PDMS slabs with two layers.
Microfluidic tubing and connectors	Upchurch Scientific		1/16 x .020 PFA tubing and super flangeless fittings
PDMS	GE Healthcare	RTV 615 A&B
Plasma Chamber	Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-001
Pressure Transducer	Proportion Air	DQPV1
Spin Coater	Specialty Coating Systems	G3P-8 Spin Coat
Photoresist	MicroChem Corp.	SU 8 2050
Syringe Pump	Harvard Apparatus	PHD 2000 Programmable
Terminal Block	National Instruments	BNC 2110	For analog output to pressure regulator and read out.
UV Collimated Light Source and Exposure System	OAI	Model 30 Enhanced Light Source