Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

Riepilogo

Qui si descrive un metodo per estendere in modo efficiente e purificare un gran numero di cellule NK e valutare la loro funzione.

Abstract

Natural killer (NK) svolgono un ruolo importante nella sorveglianza immunitaria contro una varietà di microrganismi infettivi e tumori. Limitata disponibilità di cellule NK e la capacità di espandere in vitro ha limitato lo sviluppo di immunoterapia delle cellule NK. Qui si descrive un metodo per estendere in modo efficiente grandi quantità di funzionali NK cellule ex vivo utilizzando cellule che esprimono K562 legata alla membrana IL21, come artificiale delle cellule presentanti l'antigene (aAPC).

Terapie con cellule NK adottivi fino ad oggi hanno utilizzato un prodotto cellulari ottenute da steady-state leucaferesi del donatore seguita da deplezione delle cellule T o selezione positiva delle cellule NK. Il prodotto è solitamente attivata in IL-2 durante la notte e poi somministrato il giorno seguente ^1. A causa della bassa frequenza di cellule NK nel sangue periferico, un numero relativamente piccolo di cellule NK sono stati consegnati nel corso degli studi clinici.

L'incapacità di propagare le cellule NK in vitro è stato il fattore limitante per la generazione di numero di cellule sufficiente per l'ottimale risultato clinico. Alcuni di espansione delle cellule NK (5-10 volte più di 1-2 settimane) è essere raggiunto attraverso alte dosi di IL-2 solo ^2. L'attivazione di cellule T autologhe possono mediare l'espansione delle cellule NK, presumibilmente anche attraverso il rilascio di citochine locali ^3. Supporto con stroma mesenchimale o cellule che presentano l'antigene artificiale (aAPCs) in grado di supportare l'espansione delle cellule NK sia da sangue periferico e cordone ombelicale ^4. Combinato NKp46 e l'attivazione da CD2 legate agli anticorpi perline è attualmente commercializzato per l'espansione delle cellule NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), con conseguente espansione circa 100 volte in 21 giorni.

Studi clinici utilizzando aAPC-espanso o attivate le cellule NK sono in corso, uno che utilizza la linea cellulare leucemica CTV-1 al primo e attivare le cellule NK ⁵ senza significativa espansione. Un secondo processo utilizza EBV-LCL per l'espansione delle cellule NK, raggiungendo una espansione media 490 volte in 21 giorni ^6. Il terzo utilizza un K562-based aAPC trasdotte con 4-1BBL (CD137L) e legata alla membrana IL-15 (MIL-15) ^7, che ha raggiunto una media di espansione NK 277-volte in 21 giorni. Anche se, le cellule NK espansa utilizzando K562-41BBL-mIL15 aAPC sono altamente citotossici in vitro e in vivo rispetto ai non espanso cellule NK, e partecipare a ADCC, la loro proliferazione è limitata dalla senescenza attribuito a un accorciamento dei telomeri ^8. Più di recente di 350 volte l'espansione delle cellule NK è stato segnalato con K562 esprimere MICA, 4-1BBL e IL15 ^9.

Il nostro metodo di espansione delle cellule NK descritta nel presente documento produce rapida proliferazione delle cellule NK senza senescenza raggiungere un'espansione media 21 mila volte in 21 giorni.

Protocollo

1. Isolamento di PBMC da Buffy Coat

Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ottenuti per centrifugazione densità di galleggiamento su Ficoll-Paque da donatore sano campioni di buffy coat derivato da leucaferesi.

1. Il Ficoll-Paque centrifugazione è fatto come protocollo per fabbricante, con piccole modifiche.
2. Aggiungi PBS a un normale-donatore di sangue-banca buffy coat ad un volume finale di 140 mL (tipico il volume buffy coat è 40-70 ml).
3. Strato di 35 ml di campione buffy coat su 15 ml di Ficoll-Paque (4 tubi).
4. Centrifugare a 400g per 20 minuti senza freno.
5. Recuperare il PBMC dal Ficoll-Paque: interfaccia plasma, non gettare i globuli rossi alla fine del Ficoll-Paque.
6. Lavare PBMC tre volte con PBS, centrifugazione di volta in volta a 400g per 10 minuti.
7. PBMC può essere utilizzato direttamente per l'espansione delle cellule NK in questa fase o cellule NK può essere isolato da RosetteSep (sezione 4)
8. PBMC restanti possono essere congelati in FBS contenente il 10% di DMSO in azoto liquido.
9. Aspirare il Ficoll e raccogliere i globuli rossi dal punto 5 a due tubo da 50 ml per centrifuga, lavare tre volte con PBS (aggiunti a 50 ml mark), ogni volta che aspirare la scrematura surnatante la parte superiore dello strato di RBC per rimuovere granulociti.
10. I globuli rossi possono essere utilizzati immediatamente per la depurazione RosetteSep  delle cellule NK (vedi capitolo 4) o conservati in uguale volume di soluzione Alsever è a 4 ° C per un uso successivo (I globuli rossi si possono conservare per un massimo di 4 settimane).

2. Espansione delle cellule NK

L'espansione delle cellule NK può essere avviata utilizzando PBMC purificati o cellule NK. La quantità di PBMC utilizzati per l'espansione può essere variata in base alla quantità di cellule NK desiderato al termine di una espansione tre settimane, fare riferimento alla sezione risultati rappresentativi per i dettagli. (Vedi Nota 1)

STIMOLAZIONE 1

Giorno 0

1. Per ogni 5x10 ⁶ PBMC da espandere, conteggio e irradiare 10x10 ⁶ K562 CL9 mIL21 utilizzando un irradiatore gamma a 100 Gy.
2. Irradiazione post, lavare le cellule con PBS e risospendere in espansione dei media cellule NK (NKEM).
3. Semi di 5x10 ⁶ PBMC con 10x10 ⁶ irradiati K562 CL9 mIL21 (rapporto 1:2) in 40 mL di NKEM in un pallone T75 e metterlo in posizione verticale in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2.

Giorni 3 e 5

4. Recuperare le cellule mediante centrifugazione a 400g per 5 minuti e sostituire la metà della media con NKEM fresca (aggiungendo IL2 fresco per l'intero volume media) e continuare la cultura.

STIMOLAZIONE 2

7 ° giorno

1. Contare il numero di cellule in coltura, alla fine di una settimana.
2. Mettere da parte 5x10 ⁵ celle per fenotipizzazione mediante citometria di flusso (vedi nota 2)
3. Per ogni 5x10 ⁶ celle da restimolati, conteggio e irradiare 5x10 ⁶ K562 CL9 mIL21 utilizzando un irradiatore gamma a 100 Gy.
4. Aggiungi un numero uguale di irradiati K562 CL9 mIL21 (rapporto 1:1) e risospendere in NKEM a 2.5x10 ⁵ cellule totale / mL (vedere Nota 3).
5. Semi di cellule in fiasche T75 (massimo 50 ml per ogni cilindro).

Giorni 10 e 12

6. Contare il numero di cellule.
7. Cambia supporto intero con NKEM fresca sulla base del numero di cellule (vedere Nota 3).

Giorno 14

8. Alla fine di due settimane di espansione contare il numero di cellule in coltura.
9. Mettere da parte 5x10 ⁵ celle per fenotipizzazione mediante citometria di flusso (vedi nota 2)
10. Se l'espansione è stata avviata da PBMC cellule NK può essere purificato in questa fase di espansione utilizzando il protocollo RosetteSep purificazione (vedi capitolo IV). Se l'espansione è stata avviata da purificato le cellule NK procedere alla stimolazione 3.
11. Dopo la purificazione mettere da parte 5x10 ⁵ celle per fenotipizzazione mediante citometria di flusso per verificare la purezza delle cellule NK (come al punto 8).
12. Procedere con stimolazione 3 usando tutte le cellule NK purificate (vedi Nota 4).

STIMOLAZIONE 3

1. Risospendere le cellule NK con irradiati K562 CL9 mIL21 (rapporto 1:1) in NKEM base ai numeri di cellulare (vedere Nota 3).

Giorni 17 e 19

2. Contare il numero di cellule.
3. Cambia media con NKEM fresca sulla base del numero di cellule (vedere Nota 3).

Giorno 21

4. Alla fine delle tre settimane di espansione contare il numero di cellule in coltura.
5. Recuperare 1x10 ⁶ celle per l'analisi di citometria a flusso per la piena del pannello degli anticorpi fenotipizzazione delle cellule NK (vedi tabella 1).
6. Congelare le cellule in FBS contenente il 10% di DMSO ad una densità massima di 5x10 ⁷ celle per flaconcino per uso futuro.

3. Test di citotossicità delle cellule NK

1. Scongelare una fiala di cellule NK e le sementi in NKEM, un giorno prima performing test di citotossicità per permettere il recupero.
2. Per ogni test di citotossicità delle cellule NK utilizzando una linea singola cellula bersaglio, 6x10 ⁵ cellule NK e 3x10 ⁵ cellule bersaglio sono obbligatori (vedi nota 5).
3. Preparare CAM-Media diluendo calceina-AM (stock 1 mg / mL in DMSO) in NKEM (vedi Nota 6).
4. Risospendere 10 ⁶ cellule bersaglio in 1 ml di CAM-media (vedi nota 7).
5. Incubare per 1 ora a 37 ° C, con agitazione occasionale.
6. Risospendere le cellule NK a 1x10 ⁶ cellule / ml e aggiungere 200uL di sospensione delle cellule NK a ciascuno dei 3 pozzi di un U-basso 96-pozzetti corrispondenti a 10: 1 E: rapporto T mostrato nella Figura 1. (Vedi nota 8)
7. Aggiungi 100uL dei media completa per tutti i pozzetti rimanenti ad eccezione di "Massimo".
8. Aggiungi 100uL del 2% Triton X-100 al "Massimo".
9. Effettuare diluizioni seriali delle cellule NK per il successivo E 5: Rapporti con il trasferimento di T 100uL di cellule di volta in volta, mescolare bene. Eliminare 100uL degli ultimi pozzi (E: rapporto T di 0.3125:1).
10. Dopo 1 ora di carica calceina, lavare le cellule bersaglio in NKEM due volte, centrifugando per 5 min a 1200 giri al minuto. (Vedi nota 9)
11. Ricontare le cellule bersaglio e risospendere a 1x10 ⁵ cellule / ml.
12. Aggiungere 100 ml di cellule bersaglio ad ogni pozzetto (1x10 ⁴ / e). Centrifugare per 1 minuto a 100g per iniziare il contatto delle cellule.
13. Incubare a 37 ° C e 5% di CO ₂ per 4 ore.
14. Mescolare delicatamente la cultura pipettando con un pipetter 100 ul al fine di sospendere in modo uniforme la calceina rilasciato, spin down piastra a 100g per 5 minuti per far sedimentare le cellule e trasferimento 100 l del surnatante in una nuova piastra avendo cura di evitare bolle. Pop eventuali bolle che si possono formare con ago sottile.
15. Leggere la piastra con un lettore di piastre a fluorescenza (eccitazione filtro di 485 nm, emissione filtro di 530 nm). Leggere in basso è raccomandato.
16. Calcolare Lysis specifici percentuale secondo la formula [(rilascio spontaneo rilascio di test) / (massimo stampa - rilascio spontaneo)] x 100.

4. Purificazione di cellule NK RosetteSep

1. Prendere di 100 volte l'eccesso di globuli rossi a quella di PBMC o cellule espanse, in una provetta da 50 ml (100:1 RBC: PBMC).
2. Se si utilizza globuli rossi freschi procedere direttamente alla fase successiva o se i globuli rossi venivano conservati in soluzione Alsever s, contare il numero di globuli rossi e lavare appropriati (100 volte in eccesso) quantità di globuli rossi con PBS integrata con il 2% FBS tre volte, centrifugando a 1200 rpm per 10 minuti ogni volta.
3. Combina globuli rossi con PBMC dal punto 1.7 o cellule espanse a partire dal punto in PBS 2,10 + 2% FBS ad un volume finale di 1 mL per 5x10 ⁷ di PBMC o cellule espanse.
4. Aggiungere 1ml di RosetteSep  umani Cocktail cellule NK di arricchimento per 1x10 ⁶ di PBMC o cellule espanse.
5. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti con dolce mescolando ogni 5 minuti.
6. Aggiungere uguale volume di PBS mix + 2% FBS delicatamente e strato sulla parte superiore di Ficoll-Paque.
7. Ripetere le operazioni di Ficoll-Paque centrifugazione citati per l'isolamento PBMC (Sezione I).
8. Contare le cellule NK recuperato dopo purificazione e mettere da parte 5x105 cellule per phenotpying mediante citometria di flusso per la purezza delle cellule NK (Punto 8).

5. Note

NOTA 1. Cellule NK può essere espansa direttamente da PBMC, o da RosetteSep  purificato le cellule NK. Abbiamo preso atto di efficienza simile espansione, ma alcuni donatori possono avere molto basso numero di cellule NK con conseguente difficoltà da purificare RosetteSep prima espansione.

NOTA 2. Noi abitualmente uso CD56-FITC, CD16-PE, e CD3-PE-Cy5 per fenotipizzazione durante l'espansione, enumerando le cellule NK, come quelle che sono negativi e CD3-CD16 o CD56-positive.

NOTA 3. Ad ogni cambio dei media o la stimolazione, risospendere le cellule a 2,5 x 10 ⁵ / ml per mantenere PBMC / numero di cellule NK pari o inferiore a 2 milioni di euro mL nelle fasi di picco di espansione. Questo consentirà di evitare l'esaurimento delle sostanze nutritive e di contribuire a realizzare la massima espansione e sopravvivenza.

NOTA 4. Il tasso di espansione è donatore NK dipendente e alla fine di stimolazioni 1 o 2 parte delle cellule possono essere congelati e parte ampliato ulteriormente a seconda delle esigenze sperimentali. Abbiamo avuto un buon successo nell'usare le cellule congelate per le espansioni in un secondo momento.

NOTA 5. Al fine di consentire margine di errore si consiglia di utilizzare un minimo di 7x10 ⁵ cellule NK risospese in 700 ULS di NKEM e 4x10 ⁵ calceina-AM cellule bersaglio colorate risospese in 4 ml di NKEM per l'impostazione del test di citotossicità. Se si utilizza pipetta multicanale per la semina delle cellule bersaglio maggiori volumi di cellule (fino a 6x10 ⁵ in 6 ml) può essere richiesto in base alle dimensioni del supporto bacino utilizzato. Anche i numeri consigliati cellule NK sono specifici per la E: T ratio mostrano nel protocollo, per l'utilizzo di più E: T ratio aumentareil numero delle cellule NK per ml di conseguenza (ad esempio per un 40:1 E: 4x10 rapporto T usare ⁶ cellule / ml)

NOTA 6. Si consiglia di eseguire una preliminare calceina-AM carico titolazione per la linea di cellule bersaglio di scelta, utilizzando i seguenti diluizioni di 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 e 1:100 per ottenere differenza ottimale tra massimo rilascio e spontaneo.

NOTA 7. Quando si utilizza una linea aderente cella come obiettivo, prima preparare sospensione singola cella utilizzando non enzimatica delle cellule tampone dissociazione. Se si esegue ADCC, preparare un tubo duplicato di cellule bersaglio nel CAM-media.

NOTA 8 Se si esegue ADCC, aggiungere stessa cellule NK di 3 pozzi che corrisponde a 10:1 E:. T per ADCC. Ripetere l'operazione per i donatori aggiuntivi. Ripetere l'operazione per le cellule bersaglio aggiuntivi.

NOTA 9. Se si esegue un esperimento ADCC, dopo 45 minuti di carico calceina, aggiungere 10ug di anticorpi specifici per indurre ADCC contro le cellule bersaglio. Dopo 15 minuti, lavare le cellule bersaglio in terreno completo due volte, centrifugando per 5 min a 1200 giri al minuto. Risospendere le cellule a 1x10 ⁵ cellule / ml e procedere con il passo successivo nel protocollo.

6. RAPPRESENTANTE RISULTATI

Figura 2. Quando l'espansione è effettuata secondo lo schema descritto sopra, usando 5x106 PBMC come materiale di partenza, tipico delle cellule NK gamma rese da 1x10 ^{dal 9-10} ottobre cellule (variabilità donatore dipendente). La figura mostra l'espansione delle cellule NK volte (n = 19) rispetto alle cellule NK presenti nel prodotto originale (media + / - quartile).

Figura 3. Le cellule NK ampliato esprimere vari recettori delle cellule NK, che sono paragonabili alle cellule primarie non espanso NK con poche eccezioni (CD11b, CD160 e CD244).

Figura 4. Ripresa PBMC da Buffy pelo è donatore dipendente e può variare da ⁶ a 300x10 800x10 ^6. Le cellule NK possono prevedere 2% - 18% dei PBMC. RosetteSep per la purificazione delle cellule espanse, recupero di puro cellule NK al giorno 14 compreso tra 40-70%. Seguendo il protocollo raccomandato di espansione e di purificazione, la purezza delle cellule NK del 99% può essere previsto.

Figura 5. Cellule NK espanso hanno dimostrato la citotossicità contro una serie di linee cellulari tumorali tra cui il neuroblastoma, leucemia mieloide acuta, l'osteosarcoma e il melanoma (rappresentante uccidendo AML mostrato come lisi specifica per cento).

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Anticorpo	Volume per test	Azienda	Numero di catalogo
Provetta 1	Isotipo FITC Isotipo FITC Isotipo FITC Isotipo FITC FACS Buffer Volume totale	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	555748 555749 557224 340442
Provetta 2	CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS Buffer Volume totale	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 558407 558563 557991 555341 557710
Tubo 3	CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS Buffer Volume totale	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen R & D Systems Miltenyi Biotec R & D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071
Tubo 4	CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS Buffer Volume totale	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 555388 555341 558664
Tubo 5	CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS Buffer Volume totale	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 559789 555341 51-1609-42
Tubo 6	CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS Buffer Volume totale	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 550816 555341 17-1979-42