Valutare scavatori, Costruzione nido, e Tesaurizzazione in topi

Riepilogo

Tana, nidificazione e accaparramento sono specie tipiche attività che i topi prontamente eseguire in laboratorio. Questo articolo descrive come possono essere facilmente ed economicamente valutati. Questi protocolli sono estremamente sensibili alla pressione del mouse, lesioni cerebrali e malattie. Costituiscono altresì un "arricchimento ambientale" per i topi, e incarnano l'aspetto "raffinatezza" del "3 R" 18.

Abstract

Deterioramento della capacità di svolgere "attività della vita quotidiana" (ADL) è un segno precoce della malattia di Alzheimer (AD). Preclinici di screening comportamentale su possibili trattamenti per dC attualmente in gran parte si concentra sui test cognitivi, che richiede attrezzature costose e spesso un sacco di tempo sperimentatore. Tuttavia, umano memoria episodica (l'aspetto più gravemente colpiti della memoria in AD) è diverso da memoria roditore, che sembra essere in gran parte non episodica. Pertanto i modi attuali di screening per i trattamenti nuovo annuncio per dC nei roditori sono intrinsecamente scarse probabilità di successo. Un nuovo approccio allo screening preclinico sarebbe quello di caratterizzare l'ADL di topi. Fortuitamente, alcuni tali dosaggi sono stati recentemente sviluppati a Oxford, e qui i tre più sensibili e ben caratterizzati sono presentati.

Scavatore è stato sviluppato a Oxford ^13. Si è evoluta da una necessità di sviluppare un paradigma di accaparramento del mouse. La maggior parte delle pubblicareed paradigmi accaparramento roditore richiesto una fonte di cibo distante da collegare alla gabbia a casa da un passaggio di collegamento. Ciò comporterebbe la modifica alla gabbia a casa oltre a rendere un mouse a prova di passaggio di collegamento e fonte di cibo. Così è stato valutato se fosse possibile inserire la fonte di cibo all'interno della gabbia. Si è riscontrato che se un contenitore è stato posto sul pavimento è stato svuotato la mattina dopo., I pellet cibo erano, però, semplicemente depositati in un mucchio all'ingresso contenitore, piuttosto che collocati in un luogo discreto lontano dal contenitore, come ci si potrebbe aspettare se i topi sono stati veramente loro accaparramento. Attento esame ha mostrato che i topi sono stati eseguendo scavo ("tana") i movimenti, non portare le palline in bocca ad un luogo scelto come farebbero se veramente li accaparramento ^6.

Pellet alimentare non sono un substrato essenziale per cunicoli; topi tubi vuoti riempiti di sabbia, ghiaia, anche biancheria da letto sporca dalla loro gabbia proprio. Di piùoltre, si svuoterà un tubo pieno, anche se uno vuoto è posto accanto ad esso ^8.

Diversi protocolli di nidificazione presenti in letteratura. L'attuale Oxford uno semplifica la procedura ed ha un ben definito sistema di punteggio per la qualità nido ^5.

Un paradigma accaparramento è stato poi sviluppato, in cui i topi, invece di accumulare di nuovo alla gabbia vera casa, sono stati adattati a vivere nella "casa base" di un apparato di accaparramento. Questa base di partenza è stato collegato ad un tubo di rete metallica, l'estremità distale che conteneva la fonte di cibo. Questa disposizione ha dimostrato di produrre un buon comportamento accaparramento, a patto che i topi sono stati adattati a vivere nella "casa base" durante il giorno e solo il permesso di entrare nel tubo di accaparramento durante la notte.

Protocollo

1. Tana

1. Apparato

Disegni vari container sono stati processati (per esempio una brocca di metallo che potrebbero essere facili da pulire, ma i topi sono stati riluttanti a entrare in esso). Alla fine si è scoperto che un pezzo di pluviale in plastica (come collegato alla grondaia sul case) leggermente sopraelevata da un lato per evitare lo spostamento accidentale (non intenzionale) di pellet cibo e sigillata, alla fine, era un pezzo di apparato efficiente. Cunicoli sono ora realizzati in plastica pluviale, 68 mm di diametro, tagliato in lunghezza 20 cm di lunghezza (Figura 1). Una estremità è sigillata con un tappo di 12 millimetri di fibra di media densità (mdf). (Protezione delle vie respiratorie è consigliabile quando si lavora con mdf). Per pulizia e impermeabilizzazione, un impermeabile composto mastice adesivo può essere applicato alle superfici interne ed esterne del mdf oltre a servire per incollare nel tubo scavare. Viti (5 cm di lunghezza) sono utilizzati per elevare l'altra estremità of il tubo di 3 centimetri dal pavimento. Due fori sono realizzati 1 cm dal lato aperto del tubo scavare con un angolo di 90 ° e le viti inserite e serrate ^4.

Il diametro dei cunicoli è probabilmente critico; Schmid-Holmes et al ¹⁹ osservato che i topi in the wild "tana pulita" principalmente dalle dimensioni simili a quelle nostre tane artificiali..

Figura 1. Un mouse in un tubo tana.

2. Procedura

1. Assuefazione
   Scavatore è normalmente spontaneo, ma c'è un elemento certo di apprendimento. Il processo di apprendimento si arricchisce di facilitazione sociale. Quindi luogo una tana piena notte nella gabbia gruppo a casa di topi, che sono poi sottoposte alla prova con un trattamento. Ogni tana è riempito con 200 g di pellet cibo normalmente fornito come dieta. (Si riferisce alla tsi fitta tipo compressa di dieta, se una dieta "espanso" è in uso la tana terrà meno di 200g). Sperimentatori dovrebbe prendere in considerazione fattori quali nella scelta di un substrato tana.
   
   Se i topi sono sul razionamento del cibo (ad esempio, per motivarli a eseguire un'attività concorrente labirinto di apprendimento) non alimentari sostanze possono essere utilizzate, per le palle d'argilla, ad esempio, utilizzato per allineare la superficie del terreno nei vasi delle piante al coperto; pisello scandole (piccole pietre ~ 1 cm di diametro) e sabbia. Ghiaia pisello e sabbia, essendo tre volte più pesante di pellet cibo, sono sostituti utili per pellet cibo se i topi sono scavare molto vigorosamente, per evitare un "effetto tetto".
2. Baselining
   Run (preferibilmente due) al basale tana test di 48 ore a parte nello stesso modo, come sarà fatto per il test dopo il trattamento proposto. Il test è iniziato in modo ottimale circa 4 pm se i topi sono alloggiati su un h 0700-1900 ciclo luce-buio. Questo è un momento delicatoper testare, in quanto non sono normalmente sveglio in questo momento e inizia a scavare più lentamente che se fossero bene per la fase di buio e di conseguenza molto attivo. Due ore dopo la partenza, una misura "istantanea" è preso di peso del cibo scavato, la tana è svuotato in un contenitore tarato e pesati e il pellet sostituito nella tana che è rimesso in gabbia. Se il mouse è nella tana, così delicatamente versarlo e il contenuto nel contenitore di pesatura e sostituire il mouse nella gabbia. Il peso rintanati in due ore è poi calcolato per differenza da quella originale 200 g. La lettura definitiva del mattino successivo. Timing non è critica come i topi sono tornati a dormire (spesso nella tana) e non sono più attivamente tana. Utilizzare le 2 h di misura presa sulla seconda prova per formare gruppi equilibrati per prestazioni di riferimento. Come scavare aumenta con la pratica ^17, baselining aiuta anche i topi di raggiungere asymp più stabileprestazioni Totic che rivela gli effetti del trattamento migliore.
3. Analisi
   Per il test, dopo i trattamenti vengono somministrati ai topi viene data la prova scavare esattamente come nella fase baselining. Se il test di scavare deve essere utilizzato cronicamente, si raccomanda che almeno 48 ore separano il test per evitare una diminuzione delle prestazioni a causa di eccessiva esposizione alla procedura.
4. Nota
   NON sostituire il cibo scavato sul pavimento della gabbia nella tana. Anche se il mouse non ha scavato nulla, eseguire la procedura di pesatura, come si farebbe se scavando si era verificato, il disturbo causato dal peso tende a stimolare comportamenti e topi che hanno già scavato alcuni dei substrato spesso inizio scavando con rinnovato vigore dopo la processo di pesatura.

2. I risultati attesi

~ C57 BL / 6 topi di solito cunicolo di circa 70 g nelle prime due ore, e vicino a 200 gdurante la notte. Dell'ippocampo topi lesionati spesso tana inferiore a 5 g ¹¹ (Figura 2). Malattia da prioni inibisce scavare ^1,2, così come l'amministrazione lipopolisaccaride ^20. Scavando in grado di rilevare prioni (scrapie) malattia a 10-12 settimane dopo l'iniezione di omogenato di cervello malato, mentre i segni clinici compaiono solo a 22 settimane ^13. (Figura 3). Scavatore ha dimostrato di essere sensibili alle differenze di ceppo ¹⁵ e knock-out di subunità canale ionico di potassio ^10.

Figura 2. Peso di pellet alimentare (mediane e range interquartile) rintanata in due ore di controllo e di ippocampo-lesionati topi. Quest'ultimo penetrato significativamente inferiore rispetto ai controlli (P = 0,0001).

Figura 3. Pesopellet cibo (mezzi) scavato tutta la notte per il controllo e la scrapie topi infettati. Burrowing aumenta (con la pratica) in entrambi i gruppi di settimana 7-10 post-iniezione, ma dalla 12 ° settimana declina scavano nel gruppo scrapie e la differenza tra i gruppi diventa statisticamente significativa (superiore a due errori standard della media).

3. Discussione

Abbiamo testato scavando in altre specie di roditori - ratti, gerbilli, criceti e topi spinosi egiziano ^8. Tutti, ma quest'ultimo potrebbe essere indotta a quantità considerevoli di substrati tana terrestre, come ghiaia o sabbia, ma scavando di pellet cibo era molto meno, anche dopo una lunga esperienza con i materiali terrestri. La ragione di questa differenza dai topi non è noto. Dopo questo lavoro era stato fatto, si è scoperto che i topi spinosi egiziano di fatto non fanno tane in libertà, ma possono occupare tane fatta da gerbilli, anche la superficie della loro naturale habitat spesso è hard rock. Recente osservazione di Nairobi ha dimostrato che, all'interno del Acomys genere, il mouse spinosa Wilson (Acomys wilsoni) e Percival spinosi del mouse (Acomys percivali), che fanno tana in natura, anche rintanata in laboratorio.

4. Annidamento

1. Apparato

Il test viene effettuato in gabbie individuali, gli stessi che utilizzate per scavare sono adatti. Biancheria da letto normale dovrebbe coprire il pavimento fino ad una profondità di 0,5 cm. (Variazione in profondità, e biancheria da letto molto profondo, potrebbe influenzare la costruzione nido). Ogni gabbia è fornita con un "Nestlet", un quadrato 5 cm di ovatta pressata (Ancare).

2. Procedura

I topi sono posti singolarmente in gabbie di nidificazione circa un'ora prima della fase di buio, ei risultati sono valutati il ​​mattino successivo. Come con scavatori, e per ragioni analoghe, la tempistica non è critico.

3.Punteggio

I nidi sono valutate su una scala a 5 punti (Figure 4-8), e la quantità di untorn Nestlet è anche pesato ^5.

1. Il Nestlet è in gran parte incontaminata (> 90% intatte).
2. Il Nestlet è parzialmente strappato (50-90% rimasta intatta).
3. Il Nestlet è in gran parte triturati, ma spesso non c'è posto nido identificabili: <50% del Nestlet rimane intatto, ma <90% si trova a un quarto della superficie della gabbia, cioè il cotone che non sono raccolte in un nido, ma diffuso in tutto il gabbia . Nota: il materiale può essere a volte in una zona nido in senso lato, ma la definizione critica è che il 50-90% è stato tagliuzzato.
4. Un nido identificabili, ma piatto:> 90% della Nestlet è strappato, il materiale viene raccolto in un nido all'interno di un quarto della superficie della gabbia, ma il nido è piatto, con pareti che superino in altezza il corpo del mouse (rannicchiata sul suo lato) con meno del 50% della sua circonferenza.
5. A (quasi) perfetto nest:> 90% della Nestlet è strappato, il nido è un cratere, con pareti che superino in altezza il corpo del mouse su oltre il 50% della sua circonferenza.

Nei casi in cui criteri non sono d'accordo dividere la differenza. Per esempio un nido perfetto con un pezzo unshredded 0,7 g sarebbe punteggio 4.5.

Figura 4. Score Nest 1

Figura 5. Nest punteggio 2

Figura 6. Nest punteggio 3

Figura 7. Score Nido 4

Figura 8. SCOR Neste 5

4. I risultati attesi

Maschi e femmine fare il nido, in quanto il loro scopo è termoregolazione, oltre ad essere associati alla riproduzione. Per i topi C57BL / 6, i punteggi nido per i maschi e le femmine sono nella stessa gamma, anche se non abbiamo fatto un confronto controllato in un singolo esperimento. La maggior parte dei topi C57BL / 6 punteggio 4-5 sulla costruzione nido, ma quando l'ippocampo è leso il punteggio medio sarebbe di circa 1-2; un punteggio di 3 è improbabile il superamento (Figura 9). Nidificazione anche dimostrato di essere sensibili alle malattie da prioni circa 10-12 settimane ^1,2,16.

Figura 9. Punteggi Nest (mediane e range interquartile) per i topi di controllo e di topi con lesioni del dorsale, ippocampo ventrale e completa. Solo i topi mostrano lesione completa inibizione di nidificazione, per cui gli effetti della dorsale selettiva e ventrregioni al appaiono sotto-soglia, ma additivo.

5. Tesaurizzazione

1. Apparato

Una serie di "basi casa" sono collegati ai tubi in rete metallica, chiusa definitivamente alla fine distale dove si trovano i pellet cibo e temporaneamente alla fine prossimale da un tappo di legno. Questo è utilizzato per evitare i topi entrano i tubi prima di adattamento alla casa base è occurred7.

L'apparato (Figura 10) può essere effettuato in vari modi, a patto che i principi fondamentali sono rispettati. Il nostro è costituito da una fila di 8 scatole di legno, ogni 30 x 13 x 15 cm con coperchio in plexiglass trasparente. Ognuno di essi è fornito con una bottiglia d'acqua, e ha un foro nella parte posteriore in cui il tubo è accaparramento push-montato. I tubi sono realizzati in plastica nera, 10 cm di lunghezza, 40 mm di diametro, unito a un tubo di rete metallica, 45 cm di lunghezza, 4 cm di diametro, per formare una lunghezza totale di 50 cm. La rete si compone di 13 millimetri quadrati,ed è un rotolo doppio con le maglie disallineate per fare i buchi nelle maglie più piccole e prevenire pellet cibo attraverso caduta. Se sei millimetri a maglia quadrata è disponibile questo è un materiale migliore, come un rotolo sarebbe sufficiente. L'estremità distale del tubo, dove si trovano i pellet cibo, è chiuso. L'estremità prossimale è sigillata con un tappo di legno.

Topi figura 10. Accaparramento nei tubi

2. Procedura

1. Tipicamente, l'accaparramento è molto variabile la prima volta e alcuni topi non può accumulare a tutti. Accaparramento, come scavare, migliora con la pratica. Pertanto, quando disegno sperimentale consente, sessioni baselining avvengono per lo più prima di un trattamento viene somministrato. Chiaramente, questo non è pratico se la variabile indipendente è innata, come con un (non condizionale) mutante del mouse o quando si verifica differenti ceppi di topi.
2. Un mouse è messo inogni casella all'inizio della giornata per abituare ad esso. La scatola è dotata di un tunnel di cartone che è stato nella gabbia vera casa famiglia per almeno una notte, anche una generosa porzione di biancheria sporca, per farlo sentire come "casa". L'accesso al tubo di accaparramento è impedito fino a sera con un tappo di legno. 100 g pellet cibo (un misto di piccoli e grandi) è posto alla fine distale del tubo di accaparramento (versando in all'altra estremità con il tubo in posizione verticale). Per assicurarsi che il mouse è leggermente fame prima del test ha inizio, la finestra di casa non è fornita con il cibo.
3. Poco prima dell'inizio della fase di buio, rimuovere il tappo di legno per consentire l'accesso del mouse al tubo accaparramento. La mattina seguente (di nuovo, il tempo non è fondamentale) raccogliere e valutare tutte le palline alimenti che sono stati accumulati nella scatola base di origine.

6. I risultati attesi

Utilizzando C57BL femmina / 6 topi, l'importo medio accumulato sarebbe di circa50-70 g. Lesioni dell'ippocampo fortemente sopprimere hoarding11, mentre le lesioni della corteccia prefrontale hanno solo un debole effetto ¹² (Figura 11).

Figura 11. Peso del pellet cibo accumulato dal controllo e corteccia prefrontale mediale, lesione topi (mediane e range interquartile). Anche se le mediane differiscono notevolmente, l'elevata variabilità nei controlli: il risultato è ben lungi dall'essere statisticamente significativa (p = 0,3).

Discussione

Questi test sono estremamente semplici da eseguire ma le dimensioni degli effetti sono molto grandi, che li rende estremamente sensibili ai trattamenti, le differenze ceppo, ecc Sono conformi alle aspetto "raffinatezza" di Russell e Burch 3 R ^"18. Infatti, buone prestazioni nei test, come scavando sembra essere indicativo di una buona salute generale degli animali. Quindi questo potrebbe essere un buon test per la valutazione del benessere degli animali.

L'importanza di arricchimento ambientale per i roditori di laboratorio è ben riconosciuto in questi giorni. Fornitura di materiale di nidificazione è ormai una pratica standard nelle case molti animali, e questo è facile da fare. L'entusiasmo con cui scavano i topi fa scavare un arricchimento potenzialmente eccellente, ma purtroppo una tana "auto-ricarica", che sarebbe un modo pratico di fornire questo non è stato ancora sviluppato. Se i topi trovare accaparramento arricchendo non è ancora stata determinata.

_content "> Uno svantaggio è che i dati generati da questi test è generalmente non parametrico (non gaussiana in distribuzione), in modo appropriato non parametrica statistiche sono necessari per analizzarli, per esempio il Mann-Whitney U test per confronti a coppie, Kruskal- Wallis ANOVA per il multi-gruppo di dati. Se si verificano ripetuti disegni misure vengono utilizzate, in quanto non esiste un test ANOVA adatto per non parametrica di dati, i risultati possono essere trasformati, ad esempio la radice quadrata o procedure di log per renderlo conforme ad una distribuzione più normale .

Le misure del dispositivo possono essere leggermente diverse da quelle specificate nel testo (utile per gli sperimentatori USA), ma grandi differenze dovrebbero essere evitati. Tuttavia, in alcuni casi, altri sperimentatori possono trovare diverse costruzioni funzionano meglio di quelle descritte qui.

Come per tutte le misure comportamentali, i topi dovrebbero essere testati per vedere se i loro livelli di attività sono normali, come l'inattività ovviamente avere un detrimental effetto sulle specie tipiche comportamenti. Quando scrapie topi infettati mostravano scavando compromessa e la nidificazione, i loro livelli di attività erano normali (testato in un apparato campo aperto). In effetti, un periodo di iperattività si verifica circa 2-4 settimane dopo queste specie tipiche comportamenti vengono prima alterata ^2.

La forte riduzione di valore prodotta da lesioni dell'ippocampo in tana, nidificazione e accaparramento, che sono tutti comportamenti tipici della specie, integra il deficit nell'apprendimento spaziale e memory9 che sono così ben consolidata effetti di queste lesioni. Sembrano essere equivalente alla disabilità nelle attività della vita quotidiana così caratteristico di AD ^14.

Queste specie, tipiche test potrebbe rivelarsi di grande utilità nello screening pre-clinici per i trattamenti per l'Alzheimer e altre malattie neurodegenerative ^14. In molti disturbi cerebrali umani una capacità perdita o ridotta per effettuare vigilia normalecompiti ryday è importante quanto le altre caratteristiche della malattia come deficit cognitivo. In particolare, questa perdita può richiedere il coinvolgimento di assistenti e il grande peso socio-economico così spesso impone.