Un dispositivo a microfluidi con pattern Groove per studiare il comportamento cellulare

Riepilogo

Abbiamo descritto un protocollo per la fabbricazione di dispositivi microfluidici che può consentire la cattura delle cellule e della cultura. In questo approccio microstrutture modellata come scanalature all'interno dei canali microfluidica sono utilizzati per creare le regioni a basso sforzo di taglio all'interno del quale cellula possono attraccare.

Abstract

Descriviamo un dispositivo a microfluidi con modelli microgrooved per studiare il comportamento cellulare. Questa piattaforma microfluidica consiste in un canale superiore fluidico e un substrato di fondo microgrooved. Per fabbricare i canali microgrooved, un top poli (dimetilsiloxano) (PDMS) muffa contenente l'impressione dei canali microfluidica era allineato e legato ad un substrato microgrooved. Utilizzando questo dispositivo, le cellule di fibroblasti del mouse sono stati immobilizzati e fantasia all'interno di substrati microgrooved (25, 50, 75 e 100 micron di larghezza). Per studiare l'apoptosi in un dispositivo a microfluidi, supporti contenenti perossido di idrogeno, annessina V e ioduro di propidio è stato perfuso nel canale fluidico per 2 ore. Abbiamo trovato che le cellule esposte a stress ossidativo è diventato apoptotico. Queste cellule apoptotiche sono state confermate da annessina V che si lega alla fosfatidilserina al foglietto esterno della membrana plasmatica durante il processo di apoptosi. L'utilizzo di questo dispositivo a microfluidi con motivi microgrooved, il processo di apoptosi è stata osservata in tempo reale e analizzati utilizzando un microscopio invertito che contiene una camera di incubazione (37 ° C, 5% CO _2). Pertanto, questo dispositivo a microfluidi incorporato con substrati microgrooved potrebbe essere utile per studiare il comportamento cellulare e l'esecuzione di high-throughput screening di stupefacenti.

Protocollo

Microfabrication A. del dispositivo a microfluidi

1. 4-pollici wafer Si è trattata con plasma di ossigeno reattivo (5 min a 30 W, Harrick scientifico, NY).
2. Photoresist negativo (SU-8 2015, MicroChem, MA) è spin-rivestito a 900 rpm per 1 minuto su un wafer di silicio.
3. Il wafer è morbido al forno a 95 ° C per 6 minuti su una piastra ed è esposto alla luce UV (200W) per 4 minuti attraverso un film maschera contenente microcanali.
4. Il wafer è post forno a 95 ° C per 6 minuti ed è stato sviluppato utilizzando SU-8 sviluppatore photoresist.
5. Il wafer photoresist fantasia contenente microcanali è posto in un piatto di Petri-.
6. Stampi poli (dimetilsiloxano) (PDMS) (Sylgard 184) sono fabbricati da elastomero di silicone di miscelazione e catalizzatore (10:1 ratio).
7. La miscela PDMS si versa nello stampo e maestro Si è posto su un essiccatore a vuoto per rimuovere le bolle.
8. PDMS è curata a 70 ° C per 1 ~ 2 ore.
9. Stampi PDMS sono poi staccate dallo stampo maestro Si.

B. Montaggio del dispositivo

1. 40 micron di spessore superiore canali fluidici e 40 micron di spessore inferiore canali microgrooved (25, 50, 75 e 100 μ m di larghezza) sono ottenuti da due diversi stampi Si maestro.
2. Canale di ingresso e uscita del dispositivo fluidici sono perforate.
3. Fluidico canali e canali microsolco sono irreversibilmente legati dal plasma di ossigeno reattivo (5 min a 30 W, Harrick scientifico, NY).
4. Matrice extracellulare (ECM) (ossia fibronectina) è rivestito all'interno di dispositivo a microfluidi per 1 ora in incubatore (37 ° C).

C. semina cellulare e sperimentale

1. NIH-3T3 fibroblasti di topo sono coltivate in un pallone di coltura di tessuti utilizzando Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM) contenente 10% siero fetale bovino (FBS).
2. Le cellule sono trypsinized e dissociato.
3. Cellule dissociate vengono caricati nei canali microsolco alla densità cellulare di 3 × 10 ⁶ cellule / ml (Figura 1).
   
   
   Figura 1
   
   
4. 2 media ml, 100 mm H ₂ O _2, e il dosaggio apoptosi (20 microlitri annessina V e ioduro di propidio 40 microlitri, Invitrogen, CA) sono infuso in un canale utilizzando una pompa a siringa (1 ml / min).
5. Le cellule sono monitorate in tempo reale utilizzando un microscopio invertito (Nikon TE 2000).

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Discussione

Le cellule sono state immobilizzate e fantasia all'interno di substrati microgrooved in un dispositivo a microfluidi. Il processo di apoptosi delle cellule esposte al perossido di idrogeno è stata osservata in tempo reale e analizzato utilizzando annessina V e ioduro di propidio. Quindi, questo dispositivo a microfluidi contenenti canali microsolco potrebbe essere utile per high-throughput screening di stupefacenti.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Reagent	K.R. Anderson Co.	2065622	Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)
DMEM	medium	Invitrogen	11965	Dulbecco’s Modified Eagle’s Media
FBS	serum	Invitrogen	10082-147	Fetal Bovine Serum
Hydrogen peroxide	Reagent	Sigma-Aldrich	H1009
Apoptosis assay		Invitrogen	V13242	Annexin A, propidium iodide
Negative photoresist		MicroChem Corp.	SU-8 2015
Si wafer	Tool			4 inch silicone wafer
Reactive oxygen plasma	Reagent	Harrick Scientific Products, Inc.		treat wafer 5 min at 30W
inverted microscope	Tool	Nikon Instruments	TE 2000