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Method Article
Il biarsenical coloranti Flash e ReAsH legano specificamente ai motivi tetracysteine di proteine e in modo selettivo le proteine etichetta in cellule vive. Recentemente questa strategia di etichettatura è stato utilizzato per sviluppare sensori per le diverse conformazioni delle proteine o stati oligomerici. Abbiamo descritto l'approccio di etichettatura e di metodi per analizzare quantitativamente vincolanti.
Proteine fluorescenti e coloranti sono strumenti essenziali per lo studio del traffico di proteine, la localizzazione e la funzione delle cellule. Mentre le proteine fluorescenti come il verde proteina fluorescente (GFP) sono stati ampiamente utilizzati come partner di fusione di proteine per monitorare le proprietà di una proteina di interesse 1, i recenti sviluppi con piccole etichette consentono nuove funzionalità di proteine da esaminare nelle cellule, come il cambiamento conformazionale e proteine-associazione 2, 3. Un sistema di tag piccola comporta un motivo tetracysteine (ccxxcc) geneticamente inserito in una proteina bersaglio, che si lega ai coloranti biarsenical, ReAsH (rosso fluorescente) e Flash (verde fluorescente), con elevata specificità anche nelle cellule vive 2. Il TC / biarsenical sistema colorante offre vincoli molto meno sterico alla proteina ospite di proteine fluorescenti che ha permesso a numerosi nuovi approcci per misurare il cambiamento conformazionale e interazioni proteina-proteina 4-7. Abbiamo recentemente sviluppato una nuova applicazione di tag TC come sensori di oligomerizzazione nelle cellule che esprimono huntingtina mutata, che se mutato aggregati nei neuroni a Huntington malattia 7. Huntingtina era taggati con due coloranti fluorescenti, una una proteina fluorescente per tenere traccia posizione di proteine, e la seconda un tag TC che lega solo coloranti biarsenical in monomeri. Quindi, i cambiamenti colocalizzazione tra proteine e biarsenical reattività colorante abilitato contenuto submicroscopiche oligomero di essere mappate spazialmente all'interno delle cellule. Qui, descriviamo come etichettare TC-tagged proteine fuse ad una proteina fluorescente (Cherry, GFP o CFP) con il flash o ReAsH in vivo le cellule di mammifero e come quantificare i due fluorescenza di colore (ciliegio / Flash, CFP / Flash o GFP / combinazioni ReAsH).
1. Preparazione delle cellule per l'etichettatura con ReAsH / Flash
Nota è importante utilizzare i controlli positivi e negativi per valutare l'entità del legame specifico ai tag TC e per valutare bleedthrough di fluorescenza tra i canali al momento del ritiro microscopio confocale. Quindi, per due colori (per esempio Flash / Cherry o ReAsH / o CFP ReAsH / GFP combinazioni), assicurano i campioni sono preparati per singoli colori (es. proteina fluorescente da soli o, se possibile, una proteina TC-tagged legato a Flash / ReAsH ma senza fluorescente proteine)
E 'importante aggiungere EDT prima di aggiungere Flash / ReAsH e fare il tampone appena prima di aggiungerlo alle cellule. Incubare per esattamente 30 minuti a 37 ° C nel tessuto culturale incubatore. Nella nostra esperienza i tempi di incubazione più lungo aumenta significativamente la fluorescenza di fondo. Nuovi costrutti dovrebbe essere ottimizzato per l'etichettatura di tempo e Flash / ReAsH concentrazione (0.5-2 mM).
Dopo questo lavaggio, le cellule possono essere fissati con paraformaldeide (15 min con il 3,2% di soluzione), anche se abbiamo trovato che questo aumenta la fluorescenza non specifica biarsenical colorante. Quindi di solito l'immagine cellule vive a temperatura ambiente. (Si noti che la fissazione delle cellule prima dell'etichettatura previene il legame biarsenical colorante.)
2. Imaging le cellule su un microscopio confocale
3. Analisi dei dati
4. Rappresentante dei risultati:
Il successo di cellule etichettatura con coloranti biarsenical dipende da alcuni parametri chiave. In primo luogo, i tempi della etichettatura con coloranti è cruciale. Abbiamo scoperto che lunghi periodi di etichettatura (più di 30 minuti) si traduce in un elevato livello di colorazione aspecifica di fondo. Fig. 1 mostra un tipico risultato di una wild-type forma di frammento huntingtina (25Q) unito alla Cerulean PCP derivato contenente un tag TC come descritto in precedenza 7. Questo campione è stato macchiato per 30 minuti con ReAsH e non c'è sfondo minimo nel campione manca il tag di TC. Abbiamo scoperto che la fissazione delle cellule con sfondo paraformaldeide aumenta mentre fissaggio con metanolo abroga la fluorescenza del tag proteina fluorescente. Quindi dove possibile, l'immagine del cellule vive. E 'importante notare inoltre che la fissazione preventival'etichettatura con coloranti biarsenical impedisce loro legame, presumibilmente a causa di modifiche del TC motivo.
Un altro fattore critico per risultati costanti è la densità delle cellule. Abbiamo trovato critiche a celle di immagine che vengono liberamente distribuiti e, inoltre, che ampia aggregazione può portare a colorazione irregolare dei coloranti biarsenical in celle diverse.
Figura 1. Tetracysteine tag e colorazione ReAsH in cellule vive transfettate con huntingtina (exon1-25Q)-Cerulean fusioni. Il tag TC si trova all'incrocio tra la huntingtina Cerulean-fusione (come descritto in 7). Il tracciato di correlazione di intensità dei pixel consente una valutazione delle differenze di ReAsH vincolanti per tutta la cellula e può essere utilizzato per mappare i cambiamenti in ReAsH vincolante a causa di cambiamento conformazionale o interazioni ligando.
L'approccio alla localizzazione etichetta proteina con una proteina fluorescente e le proprietà conformazionali con un colorante secondo offre un grande potenziale per la mappatura in cui diverse conformazioni delle proteine nelle cellule maturano e gli eventi che cambiano le dinamiche della conformazione delle proteine. ReAsH / Flash per la prima volta utilizzato come in-cell sensore per folding delle proteine dei mammiferi cellulari retinoico-binding protein I 4. In questo esempio, il Flash...
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Questo lavoro è stato finanziato da borse di DMH e TDM (NHMRC sovvenzioni per progetti). DMH è membro Grimwade, finanziato dal Trust Miegunyah.
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8-ben μ-slide | Ibidi | 80826 | Troviamo queste camera di diapositive di essere particolarmente utile per le celle di coltura per l'imaging. |
TC-Flash II nella cella di rilevamento Tag Tetracysteine Kit fluorescenza verde * * * per il live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (Flash) o T34562 (ReAsH) | |
Sale Hanks 'soluzione equilibrata | Invitrogen | 14175-103 | |
2,3-Dimercapto-1-propanolo | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
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