Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Riepilogo

Una panoramica completa delle tecniche coinvolte nella generazione di un modello murino di cancro orale e monitoraggio quantitativo di invasione tumorale all'interno della lingua attraverso multi-fotone microscopia di cellule marcate è presentato. Questo sistema può essere utilizzato come piattaforma utile per la valutazione molecolare e di efficacia dei farmaci anti-invasiva composti.

Abstract

Loco-regionale invasione della testa e del collo è legato al rischio di metastasi e presenta una sfida difficile nella progettazione e attuazione delle strategie di gestione del paziente. Ortotopico modelli murini di cancro orale sono state sviluppate per facilitare lo studio dei fattori di impatto che l'invasione e fungere da sistema modello per la valutazione delle terapie anti-tumorali. In questi sistemi, la visualizzazione di cellule tumorali disseminate all'interno dei tessuti del cavo orale è stato generalmente effettuato da istologia convenzionale o con metodi in vivo bioluminescenti. Un inconveniente principale di queste tecniche è l'incapacità intrinseca di visualizzare e quantificare con precisione presto l'invasione delle cellule tumorali che derivano dal sito primario in tre dimensioni. Qui si descrive un protocollo che combina un modello stabilito per il carcinoma a cellule squamose della lingua (SCOT) con immagini a due fotoni per consentire la visualizzazione multi-vettoriale di diffusione del tumore linguale. La OSC-19 testa e collo, tumori linea cellulare è stata stabilmente progettato per esprimere la F-actina LifeAct legame peptidico fuso con la proteina fluorescente mCherry (LifeAct-mCherry). Fox1 ^{nu / nu} topi iniettati con queste cellule affidabile formare tumori che permettono la lingua per essere visualizzate da ex-vivo applicazione della microscopia a due fotoni. Questa tecnica permette di visualizzare ortotopico della massa tumorale e localmente invadere le cellule in lingue asportato senza interruzioni del microambiente tumorale regionale. Inoltre, questo sistema consente la quantificazione di invasione delle cellule tumorali dal calcolo delle distanze che muovono le cellule invase dal sito primario del tumore. Nel complesso questa procedura prevede un sistema potenziato modello per l'analisi dei fattori che contribuiscono all'invasione SCOT e trattamenti terapeutici su misura per prevenire l'invasione locale ea distanza diffusione metastatica. Questo metodo ha anche il potenziale per essere in ultima analisi, in combinazione con altre modalità di imaging in un ambiente nel vivo.

Protocollo

1. Linee cellulari, costruzione del vettore e Produzione lentivirali

1. Testa umana e del collo cellule tumorali linee (OSC19 o UMSCC1) sono state coltivate in mezzi di comunicazione completo, composto di DMEM (cat Cellgro # 50-003-PB) supplementato con 10% siero fetale bovino FBS (Hyclone cat # SH30070.03), 1% penicillina / streptomicina (cat Cellgro # 30-002-CI), e 1% di aminoacidi non essenziali (cat Cellgro # 25-025-CI).
2. Per trasferire il LifeAct-mCherry sequenza codificante nel vettore pLL7.0 lentivirale, il Sbf1 sito di riconoscimento del genitore mCherry cDNA è stato modificato con l'introduzione di tre mutazioni in silenzio nella sequenza di riconoscimento mediante mutagenesi sito-diretta (cat Stratagene # 200518-5). La risultante modificato LifeAct-mCherry sequenza è stato poi amplificato mediante PCR con accompagnamento EcoR1/Sbf1 siti e subcloned in pLL7.0 per generare il pLL7.0-LifeAct-mCherry costruire.

2. pLL7.0-LifeAct mCherry-Virus Production

1. Produzione virale è stata condotta secondo l'espressione lentivirali sistemi manuali (versione del sistema Bioscience 2-051018).
2. La linea cellulare di packaging 293T/17 cellule (cat ATCC # CRL-11268) è cresciuta al 40% confluenza nei media stesso completo utilizzato per linee HNSCC.
3. Le cellule sono state transfettate con il pLL7.0-LifeAct-mCherry, psPAX2 e pVSV-G vettori in un rapporto di 3:02:01, rispettivamente con CalPhos (cat Clontech # 631312).
4. Dopo 24 ore, i media iniziale della transfezione è stata sostituita con mezzi freschi.
5. Media è stata poi raccolti e rifornito ogni 12 ore per 72 ore e conservati a 4 ° C.

3. Produzione di testa e linee di cellule del collo con Stabile LifeAct-mCherry Espressione

1. I mezzi raccolti è stato girato a 2000 rpm per 10 minuti a 4 ° C.
2. Un ml di supporti contenenti virus è stato chiarito direttamente aggiunto al OSC19 o UMSCC1 celle per 12 ore. Le cellule sono state poi risciacquate, e un ulteriore ml di virus e 'stato aggiunto per un altro periodo di 12 ore.
3. Le cellule sono state trattate con supporti contenenti 200mg/ml puromicina per due settimane per selezionare le colonie resistenti.
4. Cloni sopravvissuti sono stati esaminati visivamente per LifeAct-mCherry espressione al microscopio a fluorescenza. Singole colonie positive sono state typsinized sterile utilizzando dischi clonazione 3 mm (cat Fisher # 0790710A).
5. Cellule positive sono state mantenute in un mezzo contenente puromicina 200mg/ml congelati fino alla schiena o utilizzato per l'iniezione ortotopico.

4. Ortotopico di formazione del tumore dello xenotrapianto

1. Tutte le procedure di animali sono state condotte in conformità con un protocollo (09-0821), approvato dalla cura degli animali West Virginia University e Comitato Usa.
2. LifeAct-mCherry cellule tumorali che esprimono stati trypsinized, centrifugati e 2,5 x 10 ⁴ cellule sono state risospese in 50 microlitri mezzi di comunicazione completo.
3. Le cellule tumorali sono stati caricati in una siringa da un ml collegata ad un 27 ½ gauge.
4. Femmina atimici Fox1 ^{nu / nu} topi 8 settimane di età (Harlan Laboratories) sono stati anestetizzati con una combinazione di 80mg/kg xylazina ketamina e 10mg/kg. Topi anestetizzati sono stati mantenuti tra i 37-40 ° C su una piastra elettrica.
5. Utilizzando pinza sterile, la punta della lingua è stato afferrato delicatamente e con attenzione tirato fuori dalla cavità orale.
6. Le cellule sono state iniettate lentamente in un lato di ogni lingua per creare una massa bulbosa nel centro della lingua, evitando le arterie linguale.
7. I topi sono stati iniettati con yohimbina 2.1mg/kg e restituito al pad di riscaldamento, dove sono stati monitorati hanno per 2-3 ore durante il recupero dall'anestesia.
8. Una volta rianimato, i topi sono stati collocati in gabbie sterili contenenti una dieta morbida pasta transgenici (cat BioServe # S3472).
9. I topi sono stati pesati ogni 2-3 giorni e monitorato visivamente per l'insorgenza del tumore.

5. Preparazione delle Lingue del mouse per ex-vivo Imaging

1. I topi ospitare tumori in diversi momenti (di solito 2-4 settimane post-iniezione) sono stati sottoposti ad eutanasia per inalazione di anidride carbonica.
2. Lingue sono stati estratti, sciacquati con PBS 1X e fissato su un lato di una cassetta convenzionale incorporare tessuto paraffina (Cat StatLab # H104,) utilizzando filati per cucire monofilamento da un negozio locale hobby e un 8 ago per cucire dimensioni.
3. Una volta che le lingue sono stati immobilizzati, l'assemblea intera cassetta è stata posta in un piatto 30 millimetri colture di tessuti e immerso in PBS 1X.
4. Lingue trattati sono stati immediatamente utilizzati per la microscopia a due fotoni di eccitazione.

6. Imaging dei Tumori Lingua con microscopia a due fotoni

1. Cassette lingua sono stati immersi in un piatto 60 millimetri contenente PBS 1X fissato in un supporto progettato su un braccio a sbalzo a scomparsa (Camera di Shuttle, Siskiyou strumenti) posizionato sotto l'obiettivo di un microscopio in posizione verticale (Microscopio mobile (MOM); Sutter Instruments).
2. Un'acqua 40X/0.8NA immersione lente dell'obiettivo è stata posta direttamente su od oltre tum visibileo lesioni. Lingue sono ripreso al microscopio a due fotoni con il laser Ti: zaffiro (Mira, Coherent) intensità a 60 mW e la lunghezza d'onda di ingresso di 755 nm per ottimizzare il segnale mCherry.
3. 1 millimetro di serie immagini di scansione laser sono stati raccolti a 1 micron profondità incrementale su una profondità totale del tessuto tra i 15 ei 100 micron (a seconda del volume del tumore). Le immagini sono state catturate con scanimage, un programma open source basato sulla piattaforma MATLAB che è stato sviluppato dal laboratorio di Karel Svoboda (Janelia Farms, HHMI). Scanimage genera un due canali di uscita raster pattern di scansione per controllare il x / y galvanometrico specchi di scansione, e allo stesso tempo, cattura un massimo di quattro canali di ingresso segnale contemporaneamente da tubi fotomoltiplicatori (PMT) attraverso una scheda di acquisizione dati (PCI-6610S , National Instruments). La PMT segnali sono amplificati da preamplificatori a basso rumore di corrente (SR570, Stanford sistema di ricerca) prima che in NI-DAQ per la visualizzazione sullo schermo del monitor. Scanimage raccoglie z-stack immagini controllando l'asse z dello scopo e raccoglie time-lapse immagini in modalità singola o in bicicletta. Le immagini sono state salvate in un file TIFF a 16 bit di profondità.

7. Immagine Analisi mediante software Amira

1. Amira di imaging per la quantificazione del tumore: Nel software Aimra, aprire il file TIFF che contiene l'insieme di z-stack immagini.
2. Evidenziare il nome del file, selezionare e applicare la funzione Voltex per generare un rendering tridimensionale. Una grande immagine primaria del tumore con i più piccoli diversi gruppi dissociato invasiva (IG) di cellule collettivamente invaso è di solito evidente nell'immagine di rendering (vedi Figura 6A).
3. Per selezionare la massa tumorale primaria, scegliere "Open Data", poi "etichettatura", allora "Campo Label".
4. Della soglia del tumore primitivo-selezionare tutte le z-stack di immagini e scorrere le immagini nel piano z per garantire l'integrazione della sola massa tumorale primaria entro tre dimensioni. Questo è in genere l'immagine più grande imprese del settore e spesso appare segmentato come fotografato è attraversato attraverso il piano z.
5. Utilizzare la bacchetta magica / soglia funzione per correggere fluorescenza di fondo ed eliminare dall'immagine senza scartare nessuna delle segnale tumore. Evidenziare il "File Inside" etichetta e fare clic sul pulsante ⊕. Selezionare la casella "Tutte le sezioni" check. Questo produce un bordo colorato intorno alla zona thresholded tumore primario in ogni z-stack incremento.
6. Per selezionare IG, scegliere la funzione "Nuovo". Selezionare un singolo IG e assicurare che non è associato al tumore primario scorrendo il piano z.
7. Selezionare "Tutte le sezioni" e fare clic sul pulsante ⊕. Rinominare il file (es: IG 1)
8. Ripetere la procedura soglia di 7.4 e il passo evidenziando in 7,5 per il determinato IG. Selezionare un colore di contorno diverso il colore utilizzato per indicare la massa del tumore primario.
9. Ripetere se necessario per ogni ulteriore IG tutta l'immagine, la scansione attraverso il piano z per garantire che tutti IG sono indicati. Utilizzando colori diversi per ciascuno identificato IG aiuta nella identificazione futura sull'immagine.
10. Una volta che il tumore primario e tutti IG sono selezionati, selezionare "Segmentazione" dal menu a discesa, quindi selezionare "Statistiche Materiale". Ciò fornisce la misura del volume e la X, Y e X nucleo tumorale coordinate per il tumore primario al fine di calcolare le distanze di IG dal punto centrale del tumore.
11. Con il volume calcolato, determinare la distanza di ogni IG dal nucleo centrale del tumore primario. Selezionare "segmentazione", poi "Statistiche Materiale". Questo passo calcola tutte le misure in pixel. Convertire i pixel micrometri in base alla calibrazione del microscopio obiettivo ed ogni aumento ulteriore ingrandimento (ad esempio, funzioni di zoom). Per il microscopio e le impostazioni utilizzate in questi esperimenti, l'obiettivo 40X è stato utilizzato senza zoom, dando una calibrazione di 1 pixel = 0,298 micron. Importazione di dati in un foglio Excel, che dà i parametri per il tumore primario in tre dimensioni (X1, Y1, Z1) e per ogni IG (ex: X2, Y2, Z2 per la prima IG).
12. La distanza invaso in micron per ogni IG dal centro del tumore primario è calcolato usando la formula √ ((X1-X2) ² + (Y2-Y1) ² + (Z2-Z1) ^2).
13. L'indice di tumore invasivo (T _I) viene calcolato utilizzando la formula T _I = N _T V x _T x D _T, dove N _T = numero totale di IGS nell'immagine, V _T = il volume totale di tutte le IG, D _T = distanza totale percorsa di tutti i gruppi invasiva dal centro del tumore primario.

8. Tre rendering tridimensionale con Nikon Software NIS-Elements

1. Tre rendering tridimensionale con maggiore dettaglio topografico può essere generato da importare l'originale a 16-bit dei file TIFF in bianco e nero dell'immagine intero tumore nel NIS-Elements software Nikonpacchetto (Nikon, Melville, NY). Selezionare "File", poi "ND", quindi "Crea file ND da sequenza File". Selezionare la serie Z serie di immagini TIFF e specificare la dimensione appropriata passo.
2. Calibrare il documento ND nel piano xy. Specificare la dimensione di un pixel con una calibrazione manuale.
3. Scegliere il "View Volume". Utilizzare la funzione "HQ" per calcolare fette aggiuntive nel piano z per una maggiore qualità. Nella sezione "Impostazioni 3D Renderer", utilizzare la "Advanced Renderer" con una qualità di "Dettagli Ultra High" e "Risoluzione Full". Scegliere "Alpha Blending" per accentuare le superfici tumore.
4. Ottimizzare l'immagine tridimensionale per la presentazione. Ingrandire il tumore e IG associati e delle colture, se necessario. Ruotare l'immagine nei piani xyz e regolare la LUT.
5. Catturare l'immagine per la presentazione. Selezionare "Edit-Create View Snapshot (8 bit RGB)". Nome e salvare il file di conseguenza.

9. Rappresentante Risultati

Figura 1. Schema generale che illustra le fasi principali della produzione ortotopico tumore della lingua e in situ due immagini fotone.

Figura 2. Iniezione di LifeAct-mCherry OSC19 cellule che esprimono nella lingua del mouse.

Figura 3 resezione del tumore che contengono la lingua del mouse preparato per due immagini fotone.

Figura 4. Orientamento di un tumore contenente lingua in posizione su un microscopio a due fotoni pronto per l'imaging.

Figura 5. Rappresentante schermo girato da scanimage dimostrando grezzi di acquisizione dati del periodo iniziale di due fotoni immagine.

Figura 6. Analisi delle immagini e quantificazione di invasione tumorale in un tumore OSC19 ortotopico. Rappresentante immagini schermata di rendering Amira Voltex (A) e un singolo thresholded z-sezione (B) con il tumore primario primario delineato in viola, gruppo invasiva 1 (IG-1) delineate nel blu, IG-2 delineato in rosso e IG -3 delineate nel verde come un esempio della procedura di identificazione. Punte di freccia indicano IG in (A) e (B). Parcelle C. di volume rispetto invaso distanza per otto IG individuale utilizzato per calcolare l'indice di invasione del tumore (Ti).

Immagini rappresentative Figura 7. Dei tumori e invase da gruppi di tumore questo protocollo confronto con le immagini da un approccio tradizionale IHC. Paraffina sezione A. di una lingua topo intero asilo ad un tumore UMSCC1 ortotopico. La colorazione immunoistochimica è stata condotta utilizzando le procedure tradizionali con un anticorpo primario contro il HNSCC specifici marker delle cellule emmprin (Zymed; cat # 34-5600) alla diluizione 1:1000 e visualizzati utilizzando il OmniMap DAB anti-Rb rilevamento kit (Ventana cat # 760 -149), seguita dalla colorazione ematossilina di ferro. Immagini che comprende l'area totale della lingua sono stati raccolti individualmente con ingrandimento 4x su un microscopio Olympus ZX70 Provis con una telecamera CCD MicroFire Optronics e ricostruita utilizzando il pacchetto di imaging StereoINvestigator (Bioscience MBF). Il tumore è evidente la punta della lingua. Una regione che mostra la parte anteriore allargata invasivo e singoli gruppi di cellule tumorali (punte di freccia) è mostrato in (B). C. Nikon NIS-Elements rendering di un tumore OSC19 rappresentante. Dettaglio contorno avanzata e visualizzazione chiara delle IG (punte di freccia) è evidente. Bar a tutte le immagini = 100 micron.

Discussione

Modelli murini ortotopico si sono dimostrati utili per studiare molti aspetti della testa e del collo ^1,2. Abbiamo combinato un sistema ben stabilito ortotopico di SCOT ³ con immagini di microscopia a due fotoni di cellule mCherry-etichettato come un sistema per studiare gli eventi iniziali della testa e del collo, l'invasione delle cellule tumorali. In questa procedura, abbiamo notato che le cellule possono fuoriuscire dal sito di iniezione del tumore, specialmente nei topi sei settimane o più giovani a causa delle dimensioni della lingua insufficiente. Noi usiamo topi più anziani per evitare questo problema. La dimensione lingua più grandi con i topi aiuta anche a evitare la rottura di una arteria linguale e le emorragie eccessive dalla lingua. Prendere tumore è notevolmente migliorata quando la lingua si gonfia notevolmente nel sito di iniezione iniziale. Questo attenua il gonfiore entro 1-2 ore, come il liquido iniettato viene assorbita. La crescita del tumore appare evidente 1-2 settimane dopo l'iniezione con il numero indicato di cellule iniettate come un piccolo urto bianco sulla superficie della lingua. Notiamo anche che l'obiettivo a 40X utilizzati nei nostri studi qui presentati, non possiamo distinguere le cellule tumorali individuale, ma si identificano IG come gruppi di cellule invasive che ricapitolano la modalità tipica di invasione HNSCC.

Ad oggi questo modello è stato ampiamente utilizzato per testare il ruolo di molecole specifiche così come molti farmaci antitumorali sulla crescita SCOT un'invasione, con efficacia misurato con metastasi linfonodali cervicali determinati con IHC o bioluminescenti ^4-7. Tumori formati in questo manifesto sistema vicino alla superficie della lingua (Figura 7), che consente l'applicazione della microscopia a due fotoni ai tumori intera immagine in situ, come invasiva multicellulari cluster. La procedura può anche essere utilizzato per visualizzare l'invasione tumorale con risoluzione cellulare. Microscopia a due fotoni è stato precedentemente utilizzato per studiare trattamenti sperimentali per la testa e del collo in ^8,9 ortotopica e xenotrapianto ^8,10 modelli. Tuttavia, ci sono due differenze sostanziali tra queste relazioni e il nostro protocollo. In primo luogo, questi studi utilizzare le etichette extracellulare per target / identificare le cellule tumorali della testa e del collo, possibilmente limitando il rilevamento solo alle cellule tumorali con ampio accesso alla circolazione. In secondo luogo, l'invasione delle cellule tumorali nei pressi del sito principale che racchiude in sintesi l'attività probabilmente all'inizio del metastatico non è stato valutato come un parametro sperimentale. Il nostro protocollo prevede la possibilità di quantificare direttamente l'invasione delle cellule tumorali in qualsiasi momento durante la progressione del tumore in lingue mouse. Mentre il metodo descritto qui descrive la procedura con lingue sezionato, siamo attualmente in fase di adattare questo metodo per invasione immagine del tumore nei topi dal vivo per l'uso in combinazione con bioluminescenza di monitorare contemporaneamente l'invasione iniziale, locali di coinvolgimento dei linfonodi e metastasi a distanza nel stesso animale. Modifiche al protocollo di imaging in vivo richiede la progettazione di un adeguato livello per il posizionamento e il mantenimento di topi durante l'imaging, così come un pratico sistema per irrigare adeguatamente la cavità orale di topi anestetizzati durante la procedura di imaging. Una volta ottimizzato, questi adattamenti offrirà la possibilità di studiare il ruolo di potenziali molecole pro-invasiva e invasiva di composti anti-test su invasione locale e più distante coinvolgimento metastatico in animali per periodi di tempo prolungati.