Forno a microonde Assist diagnosi rapida di malattie virali piante da microscopia elettronica a trasmissione

Riepilogo

Questo studio descrive un metodo che permette la diagnosi rapida e chiara delle malattie delle piante virus in circa mezza giornata, utilizzando una combinazione di preparazione dell'impianto assistita campione microonde per microscopia elettronica a trasmissione e metodi di colorazione negativa.

Abstract

Le indagini sulle alterazioni ultrastrutturali indotte dal virus sono spesso necessario individuare chiaramente malattie virali nelle piante. Con la preparazione del campione convenzionale per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) che tali indagini può richiedere diversi giorni ^1,2 e non sono quindi adatti per una rapida diagnosi di malattie virali delle piante. Fissazione microonde può essere utilizzata per ridurre drasticamente il tempo di preparazione del campione per TEM con risultati simili ultrastrutturali come osservato dopo convenzionalmente preparazione del campione ^3-5. Molti diversi dispositivi a microonde su misura disponibile, che può essere impiegata per il fissaggio successo e incorporamento di campioni biologici per TEM ^5-8. In questo studio abbiamo dimostrato il virus del mosaico del tabacco (TMV) piante infettate Nicotiana tabacum che è possibile diagnosticare alterazioni ultrastrutturali in foglie in circa mezza giornata utilizzando preparazione del campione assistita microonde per TEM. Abbiamo scelto di compiere questo studio con un dispositivo a microonde disponibile in commercio come effettua la preparazione del campione quasi completamente automatico ⁵ in contrasto con gli altri dispositivi disponibili dove molti passi devono essere ancora eseguite manualmente ^6-8 e sono quindi più tempo e consumare manodopera. Come preparazione del campione è eseguita in modo completamente automatico la colorazione negativa di particelle virali nel linfa dei restanti TMV-foglie infette e l'esame del seguente ultrastruttura e le dimensioni possono essere eseguite durante la fissazione e l'inclusione.

Protocollo

Microonde preparazione del campione assistita

1. Prima dell'inizio di preparazione del campione bisogna programmare il processore automatico per tessuti microonde microscopia elettronica (EM Leica AMW; Microsystems Leica, Vienna, Austria) con i seguenti protocolli (Tabella 1) per la preparazione del campione per microonde assistita TEM:
   
   Tabella 1. Protocollo per la preparazione del campione mediante irradiazione a microonde. Le colonne mostrano differenti (da sinistra a destra):
   
   1. Numero flaconcino (nr Vial.) Rappresenta l'ordine in cui è caricato il flacone nel carosello del processore.
   2. Fase del processo vero e proprio.
   3. Reagenti nelle fiale.
   4. Durata della fase attuale.
   5. Temperatura massima che si raggiunge nella fiala prima irradiazione con microonde è spento.
   6. Forno a microonde impostazione irradiazione: continua = incrementi di temperatura rapidaase, tenendo la temperatura impostata; Slope = aumento di temperatura moderata, temperatura finale raggiunta al termine; Pulsed = rapido aumento di temperatura, alimentazione spento finché la temperatura è scesa a 5 ° C, potenza ripreso a temperatura.
   7. Potenza massima della radiazione a microonde.
2. Fresco preparare le soluzioni per le diverse fasi descritte nel protocollo di preparazione del campione (per Agar 100 resina epossidica vedi 1.7), riempirle nei flaconi designati secondo il protocollo programmato (Tabella 1), caricare le fiale sulla giostra, quindi inserire il giostra nel processore tessuto microonde, e infine caricare il primo flaconcino in modo mono-camera.
3. Tagliare piccole sezioni di foglie (1mm ²⁾ di Nicotiana tabacum infettati con virus del mosaico del tabacco (TMV), con una lama di rasoio in un piatto ceroplastica in un calo del 3% glutaraldeide (Agar Scientific Ltd., Stansted, Inghilterra) in 60mm Sørensen tampone fosfato (pH 7,2) a temperatura ambienteteratura.
4. Trasferire le sezioni con le pinzette sottili immediatamente nei cesti designati con una larghezza delle maglie di circa 200μm. Stack i cestelli uno sopra l'altro e inserirle nella modalità mono-camera. Bisogna fare attenzione che i campioni sono costantemente ricoperti di soluzione fissativa durante il carico e accatastamento dei cestelli in modo che non si secchino.
5. Avviare il programmato in precedenza microonde assistita protocollo di preparazione del campione per la fissazione, la disidratazione e l'infiltrazione.
6. Durante la preparazione del campione viene eseguita automaticamente dal processore tessuto microonde continuare con colorazione negativa con il materiale vegetale residuo come descritto nella sezione 3 (colorazione negativa).
7. Preparata fresca Agar 100 resina epossidica miscelando i seguenti componenti come descritto: riempimento 24g Agar 100, 16g dodecenyl anidride succinica, e 10 g di anidride metil nadic (per tutti i componenti vedere Agar Scientific Ltd., Stansted, Inghilterra) in una tazza di plastica, di calore a40 ° C e mescolare bene. Aggiungere 1,2 g di benzile dimetilammina e mescolare accuratamente. Riempire Agar 100 resina epossidica nella polimerizzazione designato forma appena prima del protocollo di preparazione del campione giunge al termine (ad esempio durante la fase 22 in tabella 1).
8. Dopo che il protocollo è terminata (dopo passo 22 nella tabella 1) rilasciare i cestelli sovrapposti contenenti i campioni infiltrate dalla modalità mono-camera nel flaconcino ultimo della giostra. Rimuovere la giostra dal dispositivo a microonde, Affianca i cestelli e caricarle utilizzando pinzette sottili nelle forme di polimerizzazione designati. Bisogna fare attenzione che i campioni sono sempre ricoperti di Agar 100 resina epossidica durante disimpilamento e il caricamento in modo che non si secchino.
9. Impilare le forme di polimerizzazione sopra l'altro. Bisogna fare attenzione che i campioni sono sempre ricoperti di Agar 100 resina epossidica durante accatastamento e carico in modo che non si secchino.
10. Rimuovere le fiale precedentemente utilizzati dalla giostra del Tiss microondeue processore, caricarlo con i cesti impilati e inserire la giostra nel processore tessuto forno a microonde.
11. Avviare il protocollo di polimerizzazione programmato in precedenza (tabella 1).
12. Mentre polimerizzazione viene effettuata automaticamente dal processore tessuto microonde, esaminare griglie negativamente colorati con un microscopio elettronico a trasmissione [per esempio Philips CM10 TEM, FEI (ex Philips), Eindhoven, Paesi Bassi] ed eseguire analisi di immagine come descritto nel capitolo 3 e 4 ( colorazione negativa e analisi d'immagine).
13. Dopo che il protocollo è terminata rimuovere le forme di polimerizzazione dal mono-modalità camera, Unstack le forme di polimerizzazione e polimerizzate rimuovere i blocchi contenenti i campioni. Essi sono ora pronti per essere sezionato con un microtomo.

2. Taglio e sezionamento

1. Inserisci uno o più blocchi in porta-campioni separati per ultrasottile sezionamento con il campione di incollaggio superiore a circa 1 cm dal supporto.
2. Tagliare il blocco con un trimmer campione per TEM (ad esempio Leica Reichert Ultratrim, Leica Microsystems) in modo che una faccia blocco di max. 1 mm in lunghezza e in larghezza 200μm che contiene materiale fogliare quanto possibile si ottiene (Block Size faccia potrebbe dover essere adattato alle dimensioni del coltello diamante).
3. Sezione del blocco con un ultramicrotomo (es. Reichert Leica Ultracut S; Microsystems Leica) utilizzando un coltello di diamante con un angolo di 45 ° coltello (es. DIATOME Ultra 45, Gröpl, Tulln, Austria). Spessore della sezione deve essere regolato a circa 70 a 90 nm e la velocità di taglio dovrebbe essere di circa 1 mm / s. Raccogliere più sezioni con un (Agar Scientific Ltd.) di rame ricoperto di nichel o formvar 200 griglia a maglie quadrate.
4. Post-macchia le sezioni sulla griglia di partenza con citrato di piombo (Agar Scientific Ltd., citrato di piombo 1,1 g sciolti in 42 ml di acqua bidistillata e 8ml 1N NaOH) per 5 minuti in una capsula di Petri parzialmente pieni di NaOH per creare un senza CO ₂ ambiente e per 15 minuti con acetato di uranile 1% (Agar Scientific Ltd.) disciolto in acqua distillata a temperatura ambiente. Lavare le griglie con acqua distillata per 1 minuto tra ogni fase post-colorazione. Far asciugare le griglie in una casella della griglia.
5. Esaminare le sezioni con un microscopio elettronico a trasmissione (es. Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Paesi Bassi).

3. Colorazione negativa

1. Raccolto circa 100mg di TMV materiale infetto foglia e preparare linfa grezzo mediante omogeneizzazione del materiale per 2 minuti con una lama di rasoio in un vetrino in 100 microlitri di 60mm Søfrensen tampone fosfato (pH 7,2).
2. Trasferire 20μl di omogenato risultante sul primo pozzetto di un vetrino rivestito teflon con 4 o più pozzetti (in alternativa è anche possibile trasferire l'omogeneizzato su un pezzo di parafilm).
3. Inserire una griglia formvar rivestito sopra l'omogenato con l'(Agar Scientific Ltd.) formvar lato patinato rivolto verso la caduta e incubate per 5 minuti.
4. Lavare la griglia 2 volte per 2 minuti ciascuno disponendo la griglia sopra due gocce di 200μl 60mm Sørensen tampone fosfato (pH 7,2).
5. Incubare la griglia per 1 minuto con una appena preparata di acido fosfotungstico al 2% (Agar Scientific Ltd.) in soluzione 60mm Sørensen tampone fosfato (pH 6,5).
6. Rimuovere la griglia e lasciare asciugare in una scatola griglia.
7. Esaminare la griglia con un microscopio elettronico a trasmissione (es. Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Paesi Bassi). Prendere almeno 10 immagini scelte a caso virioni colorazione negativa (almeno 10 o più virioni dovrebbero essere visibili su ogni immagine) con il microscopio elettronico a trasmissione ad un ingrandimento di primaria 21000X o superiore. Bisogna fare attenzione che tutte le immagini hanno lo stesso ingrandimento.

4. Analisi delle immagini

1. Misurare la lunghezza e la larghezza di almeno 100 particelle scelte a caso singolo virus sulle micrografie prese dai campioni di colorazione negativa utilizzando qualsiasi software di analisi immagine del computer [per esempio cellule D (Olympus, Vita e Scienza dei Materiali Europe GmbH, Hamburg, Germania) con lo strumento di analisi di particelle o Optimas 6.5.1-(Media Cybernetics Inc., Bethesda, Maryland, USA)].
2. Calcolare medie e deviazioni standard per ottenere una lunghezza e la larghezza media delle particelle virali individuate tramite metodi di colorazione negativa e TEM.
3. Confronta lunghezza e caratteristiche ultrastrutturali (ottenuta in 2.5) con dimensioni di virus e alterazioni ultrastrutturali indotte da malattie virali noti in letteratura per identificare chiaramente le malattie virali.

5. Rappresentante dei risultati:

Dopo assistite campione microonde preparazione tipica alterazioni ultrastrutturali TMV indotte quali grandi aree contenenti virioni allineati in forma parallela potrebbe essere osservato con il microscopio elettronico a trasmissione nel citosol di infetto Nicotiana cellule tabacum (Fig. 1A). Inoltre, nella linfa grezza di TMV-infetta lascia particelle di TMV potrebbe essere osservata come flessuosi, astiformi strutture dopo colorazione negativa (Fig. 1B). L'analisi delle immagini di 100 particelle virali ha rivelato una dimensione media di TMV di 280 nm di lunghezza e 17Nm di larghezza (Fig. 2). L'ultrastruttura in TMV cellule infettate e le dimensioni dei virioni in questo studio sono risultati in accordo con proprietà ultrastrutturali TMV-indotte nel tabacco e l'intervallo di dimensioni delle particelle di TMV precedentemente riportato in letteratura ^9-15.

Figura 1. Micrografie elettroniche di trasmissione di TMV-cellule infettate da foglia e virioni. A) L'immagine mostra l'ultrastruttura delle cellule del mesofillo TMV-infettati foglie di Nicotiana tabacum dopo la preparazione del campione centrale assistita a microonde. Si noti la grande area di virioni allineate parallele che hanno accumulato nel citosol.C = cloroplasto con amido (St), M = mitocondrio, N = nucleo, V = vacuolo, Bar = 2μm. B) L'immagine mostra virioni che sono stati individuati mediante colorazione negativa la linfa delle foglie infette.

Figura 2. Dimensione relativa di virioni. Distribuzione relativa della lunghezza e della larghezza del TMV-particelle dopo colorazione negativa la linfa delle foglie infette come apparivano al microscopio elettronico. I valori medi (media lunghezza / larghezza ± deviazione standard) sono stati calcolati da 100 virioni.

Discussione

Forno a microonde assistita preparazione del campione impianto per TEM ha dimostrato di fornire i dati ultrastrutturali veloci e affidabili nel giro di poche ore ^3,4,16. La conservazione multa strutturale di organelli e membrane ottenuti con il metodo utilizzato in questo studio era simile a campioni convenzionali e cryofixed ^5,15 con il vantaggio di una drastica riduzione fissazione campione e l'incorporamento di tempo da 3 giorni o più per circa 2 ore. Questo rappresenta il protocollo più veloce preparazione del campione per TEM attualmente disponibili in letteratura. Il metodo descritto in questo studio combinato microonde assistita impianto per la preparazione del campione TEM con metodi di colorazione negativa che ha consentito una identificazione chiara e rapida delle alterazioni ultrastrutturali TMV indotte e l'agente virale stessa. TMV alterazioni indotte ultrastrutturali poteva essere analizzata dopo il taglio, sezionamento e post-colorazione entro circa 4 ore dopo l'inizio del fissaggio nella trasmissione elettron microscopio. Utilizzando la modalità completamente automatica preparazione del provino liberato il ricercatore di condurre colorazione negativa nel frattempo, al fine di determinare le dimensioni e la larghezza del agente virale. Quindi, possiamo concludere che questo metodo permette una diagnosi chiara e rapida delle malattie delle piante virus in circa mezza giornata, che è di grande importanza per un uso futuro in esperimenti di agricoltura e scientifico in impianti fitopatologia. Poiché questo metodo potrebbe anche essere utilizzato per la diagnosi rapida di malattie umane e animali ha un grande potenziale per la futura applicazione in medicina veterinaria e patologia.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / attrezzature	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Glutaraldeide	Agar Scientific Ltd.	R1312
Osmio tetrossido	Agar Scientific Ltd.	R1022
Agar resina 100	Agar Scientific Ltd.	R1043
Dodecenyl anidride succinica	Agar Scientific Ltd.	R1051
Metile anidride nadic	Agar Scientific Ltd.	R1081
Benzyl dimetilammina	Agar Scientific Ltd.	R1060
Citrato di piombo	Agar Scientific Ltd.	R1210
Acetato di uranile	Agar Scientific Ltd.	R1260A
Acido fosfotungstico	Agar Scientific Ltd.	R1213
Formvar	Agar Scientific Ltd.	R1202
Leica EM AMW	Leica Microsystems
Leica (Reichert) Ultratrim	Leica Microsystems		Post più recente modello è disponibile
Leica (Reichert) Ultracut S	Leica Microsystems		Post più recente modello è disponibile
DIATOME Ultra 45	Gröpl
Philips CM10 TEM	FEI (ex Philips)		Post più recente modello è disponibile
Cella D	Olympus Inc.
Optimas 6.5.1	Media Cybernetics Inc.		Post più recente versione è disponibile