Trasfettando e Nucleofecting umani cellule staminali pluripotenti indotte

Riepilogo

Nonostante i recenti progressi nella modificazione genetica, trasfezione di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimane un processo capriccioso. A nostra conoscenza, metodi sistematici ed efficiente per trasfettare umani cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) non sono stati segnalati. Qui, descriviamo i protocolli affidabili per trasfettare in modo efficiente e nucleofect iPSCs umani.

Abstract

La modificazione genetica continua ad essere uno strumento essenziale per studiare biologia delle cellule staminali e, indicando i potenziali applicazioni cliniche delle cellule staminali embrionali umane (hESC) ^1. Mentre i miglioramenti in diversi metodi di consegna del gene sono state descritte ^2-9, trasfezione resta un processo per hESC capricciosa, e non è ancora stata riportata in cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs). In questo video, dimostriamo come il nostro laboratorio di routine e transfects nucleofects iPSCs umani utilizzando plasmide con un avanzato proteina verde fluorescente (eGFP) giornalista. IPSCs umani sono adattati e mantenuti come alimentatore-libere culture per eliminare la possibilità di trasfezione cellulare alimentatore e consentire efficiente selezione di cloni stabili transgenici IPSC dopo trasfezione. Per nucleofection, iPSCs umani sono pre-trattati con inibitori ROCK ^11, tripsinizzate in piccoli ciuffi di cellule, nucleofected e saltuariamente su linee di alimentazione in cella climatizzatamezzo per migliorare il recupero delle cellule. Transgene-esprimenti iPSCs umani può essere ottenuta dopo 6 ore. Selezione antibiotica è applicato dopo 24 ore e stabili linee transgeniche sembrano entro 1 settimana. Il nostro protocollo è robusto e riproducibile per umani linee IPSC senza alterare pluripotenza di queste cellule.

Protocollo

Il nostro protocollo inizia con un metodo di adattarsi a culture umane iPSCs alimentatore-libera, seguito da protocolli per trasfezione iPSCs umani utilizzando GeneJuice (EMD) e nucleofection di iPSCs umani utilizzando un dispositivo di Amaxa nuclefector.

Nota: Le seguenti procedure sono eseguite in una cappa a flusso laminare sterile. Tutti i mezzi e le soluzioni sono equilibrati a 37 ° C oa temperatura ambiente prima di iniziare se non diversamente specificato.

1. Stabilire iPSCs umani sul sistema privo di alimentatore

IPSCs umani precedentemente detenute nelle cellule di alimentazione possono essere divisi, trasferiti su Geltrex rivestite piatto e mantenuta per due passaggi prima di alimentazione priva di trasfezione.

1. Scongelare Geltrex notte a 4 ° C. Per preparare rivestimento Geltrex, diluire scongelato Geltrex 1:50 in DMEM freddo. Mescolare delicatamente le soluzioni.

Nota: Geltrex, come Matrigel è una forma solubile di matr membrana basaleix purificati da murino Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) cellule tumorali. In alternativa, Matrigel può essere utilizzato come matrice extracellulare stabilire culture umane alimentatore-libere IPSC.

2. Coprire l'intera superficie dei pozzetti di coltura con Geltrex soluzione (1 ml per 35 mm oltre). Cappotto pozzetti con Geltrex a 37 ° C incubatore per 1 ora.
3. Per iPSCs passaggio umano, aggiungere 1 ml di accutase per pozzetto e incubare a 37 ° C per 1 minuto fino a quando la maggior parte delle cellule iniziano a staccarsi.

Per iPSCs passaggio umano, aggiungere 1 ml di accutase per pozzetto e incubare a 37 ° C per 1 minuto fino a quando la maggior parte delle cellule iniziano a staccarsi.

4. Aggiungere 10-15 perle di vetro per le cellule e mescolare delicatamente la piastra. Aggiungere 2 ml di DMEM KnockOut / F12 e delicatamente triturare. Trasferire sospensione cellulare in un tubo da centrifuga da 10 ml.
5. Centrifugare le cellule a 800 rpm per 3 minuti a temperatura ambiente.
6. Aspirare il surnatante dal tubo, lasciando intatta umana iPSC pellet. Delicatamente scatti la provetta perdisperdere pellet.
7. Rimuovere Geltrex dal pozzo rivestito.
8. Risospendere delicatamente umano iPSC pellet in un volume adeguato di STEMPRO. Distribuire tra i pozzetti di alimentatori, a seconda del tasso di proliferazione). IPSCs umani possono essere diversi passaggi in un rapporto di divisione compreso tra 1:2 e 1:6.
9. Con cautela in luogo del 5% CO ₂ incubatore, agitare la piastra con attenzione per garantire una distribuzione uniforme delle cellule in tutto il pozzetto.
10. Le cellule di alimentazione tutti i giorni fino cellule sono pronte per essere dividere di nuovo (quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza).
11. IPSCs passaggio umano sul nuovo pozzo Geltrex rivestita passo (1,3-1,9) in un rapporto di divisione di 1:2. Piccole colonie dovrebbero essere formati e distribuiti uniformemente su Geltrex rivestita bene prima trasfezione.

2. La trasfezione di iPSCs umani con GeneJuice

(Cellule coltivate in piastre da 6 pozzetti) deve essere di circa 40 -50% confluenti nel giorno della trasfezione per ottenere un rendimento ottimale trasfezione. Ènon occorre modificare il mezzo cella fino al giorno successivo.

1. Preparare 100 KO-DMEM/F12 ul in un tubo sterile 1,5 ml Eppendorf. Aggiungere 27 microlitri di reagente di trasfezione GeneJuice. Mescolare bene. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
2. Aggiungere 4 mg DNA plasmidico. Incubare la provetta a temperatura ambiente per 15 minuti. La scelta del plasmide è critico per l'efficienza di trasfezione ottimale. Usiamo un plasmide con una proteina maggiore fluorescenza verde (EGFP) guidato da CAG promotore ⁵ (pCAG-eGFP). CAG promotore è un promotore forte che è trascrizionalmente attivo in iPSCs umani e quindi può essere usato per guidare l'espressione del transgene in queste cellule. Nelle nostre mani, linearizzazione del plasmide non sembra influenzare l'efficienza di trasfezione.
3. Aggiungi GeneJuice-DNA miscela alle cellule e agitare la piastra. Centrifugare la piastra a 1200 rpm per 5 minuti (metodo 'spinoculation') per aumentare il contatto della miscela di trasfezione con iPSCs umani sul pozzo.
4. Incubare le cellule a 37 ° C per una notte.
5. Monitorare l'efficienza di trasfezione il giorno successivo.
6. Per la trasfezione stabile, modificare media il giorno successivo con STEMPRO fresco. Aggiungere appropriata selezione antibiotica dopo 24 - 48 ore.

3. Nucleofection di iPSCs umani

IPSCs umani cresciuti su alimentatori o Geltrex può essere utilizzato per nucleofection. Tuttavia, si consiglia vivamente di replating nucleofected iPSCs umani su fibroblasti embrionali di topo (MEF) o fibroblasti prepuzio umano (HFF) alimentatori per garantire alta vitalità cellulare e di recupero. Almeno 2 milioni di cellule devono essere utilizzati per ottenere la sopravvivenza delle cellule superiore a seguito nucleofection.

1. Preparare alimentatore cellule mezzi condizionati (CM) incubando umana KnockOut iPSC sierici di ricambio (KOSR) supporto con cellule di alimentazione durante la notte. Raccogliere CM ogni 24 ore.

Nota: Qualsiasi ceppo di topi utilizzati per la preparazione di strati alimentatore (come BLK6, CF1 e MF1) è adatto per essere utilizzato for rendendo CM.

2. Il giorno della nucleofection, pre-trattare iPSCs umani con 10 pM ROCK inibitore per almeno 1 ora.
3. Preparare 82 ml di soluzione umana Nucleofector cellule staminali in una sterile 1,5 ml tubo eppendorf. Aggiungere 18 microlitri supplemento 1. Mescolare bene. Incubare la soluzione a 37 ° C per 5 minuti.
4. Preriscaldare alimentatore cella condizionata media (CM) e 0,25% tripsina / EDTA a 37 ° C. Sotto il cofano, prelabel uno sterile da 15 ml tubo conico.
5. Rimuovere con cautela i supporti dal cultura umana iPSC da nucleofected. Lavare delicatamente le cellule con 2 ml di soluzione di fosfato 1X tamponata (PBS) per pozzetto. Aspirare il PBS. Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina per pozzetto. Incubare le cellule a 37 ° C per 3 minuti.
6. Delicatamente triturare le cellule con 1000 ml di punta della pipetta. Lavare il fondo del pozzo per assicurarsi che tutti iPSCs umani sono completamente staccato. Trasferire sospensione cellulare alla provetta etichettata 15 ml.

Nota: tripsinizzazione in singolo cells va rigorosamente evitato. Le cellule devono essere sloggiato in piccoli ciuffi di cellule composto da circa triplette di cellule. Piccoli ciuffi di cellule (cellule triple) sarà dissociato in singole cellule durante la successiva manipolazione delle cellule.

7. Aggiungere 9 ml supporti MEF per inattivare la tripsina. Spin le cellule a 800 rpm per 3 minuti. Aspirare accuratamente il supernatante e lasciare il pellet di cellule intatte.
8. Risospendere le cellule in preriscaldato 100 ul di soluzione di cellule staminali umane Nucleofector dal punto 3.3.
9. Trasferire le cellule a una cuvetta Nucleofector utilizzando un ml 1 puntale.
10. Aggiungere 4 pg di DNA plasmidico in sospensione di cellule nella cuvetta. Mescolare cellule e il DNA agitando delicatamente. Toccare la cuvetta due volte sulla superficie del cofano.
11. Inserire la cuvetta nel porta Nucleofector. Utilizzare programmi B-016. Cellule Nucleofect premendo il pulsante X.

< > Verrà visualizzato quando il processo nucleofection è completed (di solito richiede solo 1-5 secondi). L'uso di altri programmi nucleofection (A-023, A-033 e U-023) prodotto meno del 10% di cellule positive eGFP da iPSCs umane.

12. Recuperare le cellule nucleofected dalla cuvetta utilizzando l'apposita pipetta Pasteur di plastica. Recuperare le cellule da risospensione in CM preriscaldato e inibitore ROCK in una sterile 1,5 ml tubo eppendorf. Incubare le cellule a 37 ° C per 10 minuti per far recuperare cellule.
13. Cellule di trasferimento goccia a goccia su strati alimentazione con 1 ml punta della pipetta. Incubare le cellule a 37 ° C per una notte.
14. Monitorare l'efficienza di trasfezione il giorno successivo. Per derivare cloni stabili di transgenici iPSCs umani che esprimono stabilmente transgene, cambiare mezzo il giorno dopo con CM e inibitore ROCK. Aggiungere appropriata selezione antibiotica dopo 24 - 48 ore.

4. Rappresentante dei risultati:

Figura 1. Microfotografie di Riv1 iPSCs umane trasfettate con pCAG-eGFP. (A) eGFP-esprimenti Riv1 cellule trasfettate con il GeneJuice Geltrex 12 ore dopo la trasfezione. Le colonie di Riv1 iPSCs umani placcato e formato su linee seguenti nucleofection con B-016 (B) e A-023 (C) del programma. (D) che esprimono stabilmente eGFP-colonie umane IPSC con espressione eGFP ubiquitaria derivato da GeneJuice. (E) stabilmente transfettate Riv1 iPSCs umani conservati espressione costitutiva eGFP durante il differenziamento del corpo embryoid.

Discussione

Il nostro risultato protocolli in tecniche semplici, robusti e altamente riproducibile per introdurre transgeni in iPSCs umani senza effetti tossici di rilievo e la morte cellulare. IPSCs umani devono essere diversi passaggi in piccoli grumi di cellule (cellule 5-10) e piastrati su Geltrex ad alta densità (1:2) per garantire la massima efficienza di transfezione in numerose piccole colonie. Per le linee IPSC umani che sono più inclini a differenziazione e morte cellulare, maggior numero di iPSCs umani (fino a 4 x 10 ⁶ cellule) deve essere utilizzato per un esperimento nucleofection unico. Saggio di trasfezione transiente genera un gran numero di transgenici che esprimono iPSCs umani entro 1 giorno. Trasfettate stabilmente cloni IPSC di solito appaiono entro 7 giorni, e queste colonie transgenici dovrebbe essere pronto per essere raccolto entro tre settimane. L'uso di promotore descritto qui CAG assicura espressione ubiquitaria di reporter eGFP. In tali miglioramenti, i nostri protocolli possono essere inseriti in altre applicazioni, tra cui sovraespressione, cinduzione talune condizioni, derivazione di lineage-specifiche linee di giornalista, shRNA o knockdown siRNA, ricombinazione gene targeting e omologhi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% tripsina con EDTA	Invitrogen	25200056
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023
3 biglie di vetro millimetri	Fisher Scientific	11-312A	Perle di vetro deve essere lavato con acido cloridrico (HCl) overnight, risciacquato con idrossido di sodio (NaOH) e acqua distillata e sterilizzato in autoclave prima dell'uso.
Accutase reagente dissociazione cellulare	Invitrogen	A11105-01
Base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF)	Invitrogen	PHG0263
DMEM (glucosio)	Lonza	12-741 F
Siero fetale di vitello	Invitrogen	16000044
Geltrex	Invitrogen	12760013	Fattore di crescita ridotta
GeneJuice trasfezione reagente	EMD Biosciences	70967
Glutamax-I (100X)	Invitrogen	35050061	L-glutammina (Invitrogen, 25.030.081) può anche essere utilizzato.
Umana iPSC KOSR supporti			500 ml umano ES media consiste di 390 KnockOut ml DMEM / F12, 100 ml di siero KnockOut Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 pl 2-mercaptoetanolo (55mm) e completata con 10 ng / ml bFGF .
KnockOut DMEM/F12	Invitrogen	12660-012
KnockOut sostituzione Siero (KOSR)	Invitrogen	10828-028
Fibroblasti embrionali di topo supporti			MEF supporto consiste di 90% FBS, NEAA 1X, 1X Glutamax-I e sodio piruvato in DMEM 1X (glucosio)
Non aminoacido essenziale, NEAA? (100X)	Invitrogen	11140050
Cellule staminali umane soluzione Nucleofector 1 con supplemento	Lonza	VAPH-5012
Soluzione tampone fosfato senza Ca 2 + e Mg 2 +	Invitrogen	10010023
Piruvato di sodio (100X)	Invitrogen	11360070
STEMPRO media kit	Invitrogen	A1000701	500 ml STEMPRO media consiste di 454 ml di KnockOut DMEM / F12, 10 ml STEMPRO privo di siero supplemento di crescita (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml di BSA (albumina sierica bovina, 25%), 909 microlitri 2-mercaptoetanolo (55mm ), integrato con 10 ng / ml bFGF.