La chiusura del tubo neurale in Cultura embrione di topo intero

Riepilogo

Un metodo che consente la manipolazione diretta farmacologica di embrioni di topo durante neurulazione che aggira il metabolismo materno è descritto. La tecnica può essere adattata per studiare diversi aspetti della neurulazione variando il punto di tempo e agente farmacologico.

Abstract

Modelli murini genetiche sono uno strumento importante per lo studio dei mammiferi chiusura del tubo neurale (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Tuttavia, lo studio di embrioni di topo in utero è limitata dalla nostra incapacità di farmacologicamente direttamente manipolare gli embrioni in modo isolato dagli effetti del metabolismo materno sul reagente di interesse. Sia che si utilizzi una piccola molecola, proteine ​​ricombinanti, o siRNA, la consegna di queste sostanze alla madre, attraverso la dieta o per iniezione saranno oggetto questi composti instabili ad una varietà di difese corporee che potrebbero impedire loro di raggiungere l'embrione. Studi effettuati su colture di embrioni intero può essere usato per separare materna da intrinseca effetti sullo sviluppo fetale.

Qui vi presentiamo un metodo per la coltura embrioni di topo usando sostanze altamente arricchito in un apparecchio rotante incubatore che consente di normale chiusura del tubo neurale dopo la dissezione (Crockett, 1990). Una volta in coltura, gli embrioni possonoessere manipolato con tradizionali tecniche in vitro, che altrimenti non sarebbero possibili se gli embrioni erano ancora in utero. Fratelli embrione può essere raccolte in vari momenti per studiare diversi aspetti del neurulazione, che si verificano da E7-7.5 (formazione di placca neurale, appena prima l'inizio della neurulazione) per E9.5-10 (al termine del cranio neuropore piega e caudale chiusura, Kaufman, 1992). In questo protocollo, dimostriamo il nostro metodo per sezionare embrioni a timepoints che sono ottimali per lo studio del neurulazione cranica. Embrioni saranno sezionati a E8.5 (circa 10-12 somities), dopo l'inizio della chiusura del tubo neurale, ma prima di accendere embrione e la chiusura del cranio neurale piega, e mantenute in coltura fino a E10 (26-28 somities), quando cranico neurulazione dovrebbe essere completa.

Protocollo

1. Preparazione di terreni di coltura - tutti i reagenti sono elencati nella tabella 1

1. Scongelare siero ratto maschio a 37 ° C.
2. Calore Disattiva siero di ratto per 30 minuti a 55 ° C
3. Centrifugare siero ratto a 10K per 5 minuti a temperatura ambiente
4. Rimuovere il surnatante 50:50 e mescolare con fenolo-rosso senza DMEM w / glucosio
5. Sterilizzare i media usando un filtro da 0,45 um siringa
6. Almeno 1 ml di media / embrione deve essere preparato

2. Isolamento dell'utero dalla diga incinta

1. Utilizzando le procedure approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC), la diga incinta viene prima anestetizzato e poi sacrificati per dislocazione cervicale
2. Sterilizzare l'addome con il 70% EtOH
3. Pinch un piccolo sentiero di pelle lungo la linea mediana, appena sopra la linea capezzolo, con una pinza grande e aperto l'addome sotto il tuo pinze con le forbici di grandi dimensioni. Fare attenzione a non danneggiare le strutture internes
4. Usa la tua forbici per tagliare lateralmente dalla apertura iniziale verso entrambi i lati del mouse in modo che l'intero addome è aperto
5. Intestini e cuscinetti di grasso in eccesso possono spesso oscurare l'utero e questi dovrebbero essere spostati da parte in modo che la parte superiore dell'utero e delle ovaie può essere osservato da ogni lato
6. Pizzicare la parte superiore dell'utero sotto le ovaie e utilizzare le forbici per separare l'utero dal grasso, il taglio da un capo dell 'utero all'ovaio altri
7. Estrarre l'utero con il forcipe e posto in una capsula di Petri con soluzione salina

3. Rimozione di embrioni dall'utero

1. Risciacquare l'utero con soluzione fisiologica per rimuovere il sangue in eccesso e tagliare il grasso in eccesso dall'esterno
2. Trasferire su un piatto pulito, con temperatura ambiente. Tyrodes salina per migliorare la visualizzazione
3. Utilizzando uno stereomicroscopio, separare ogni embrione utilizzando piccole forbici o, se necessario, sottile (# 5) pinze a cura sbucciare l'utero a parte.
4. Inserire una pinza sottile nello spazio tra la parete uterina e la decidua e staccare la parete uterina, facendo attenzione a non forare l'embrione

4. Rimozione di decidua da embrioni

1. Orientare la decidua modo che la parte più scura (placenta) è rivolto verso di voi
2. Fare un'incisione con il forcipe, lungo la linea che separa la parte oscura della decidua dalla parte più leggera, facendo attenzione a non tagliare troppo in profondità
3. Completa la separazione della placenta dalla parte superiore del sacco vitellino, facendo attenzione a non strappare la ectoplacental cono (EPC). A questo punto dovreste essere in grado di visualizzare la membrana REICHERTS sul sacco vitellino
4. Continuare a rimuovere l'intero decidua (più leggero porzione) facendo attenzione a non forare il sacco vitellino
5. Premere leggermente e rimuovere il REICHERTS da peeling lontano dalla EPC. Se l'EPC è danneggiato o separato dal sacco vitellino, gli embrioni non riuscirà a girare normalmente da E8.5-E9.5
6. Con il REICHERTS rimosso l'embrione deve essere facilmente visibile attraverso il sacco vitellino e può essere messo in scena da somities conteggio.

5. Configurazione del sistema cultura

1. Tagliare l'estremità di una pipetta di trasferimento di plastica con le forbici per aumentare il diametro dell'apertura in modo che un embrione può essere pipettati senza danneggiare il sacco vitellino
2. Riempimento di bottiglie rullo pulito con 1 ml di supporti per embrione. A seconda del tipo di bottiglie a rulli utilizzati un massimo di 3-6 embrioni possono essere caricati in ogni bottiglia.
3. Trasferire gli embrioni usando il tuo pipetta taglio ai media pieni di bottiglie rullo, riporto quanto Tyrodes meno possibile per non diluire i media
4. Fissare il tappo di gomma (tappo) per la parte superiore della bottiglia di vetro rullo
5. Inserire il rullo di bottiglie nel tamburo cultura rullo in modo che una tenuta stagna è formata tra la spina e il tamburo
6. Una volta che tutte le bottiglie sono stati attaccati, e qualsiasi slot vuoti nel tamburo sono stati sigillati wtappi in gomma esima, attivare il rullo
7. Aperto di CO ₂ e O ₂ serbatoi e regolare a circa 2 bar, in modo che la valvola di scarico sta rilasciando una bolla al secondo. Per E8.5-E10 embrioni, il 20% O ₂ e il 5% di CO ₂ dovrebbe essere usato.
8. Assicurarsi che l'incubatore è impostato a 37 ° C e coprire o chiudere l'incubatore in modo che gli embrioni siano al riparo dalla luce.
9. Gli embrioni devono essere controllati periodicamente per valutare il loro sviluppo con l'aggiunta di somities, la progressione della svolta, e l'estensione della chiusura del tubo neurale
10. Dopo 2-3 ore di cultura, gli inibitori farmacologici o altri trattamenti possono essere aggiunti ai media
11. Il disegno dello studio dovrebbe comprendere i controlli, come veicolo o analoghi inattivi di reagente studio.

6. Valutare lo sviluppo dopo la coltura degli embrioni intero

1. Spegnere il gas, arresto a rullo e rimuovere bottiglie da incubatore
2. Embrioni trasferimento a Tyrodes o PBS in una capsula di Petri per la valutazione sotto stereomicroscopio
3. Il sacco vitellino dovrebbe apparire simili a palloncini, un battito cardiaco dovrebbe essere visibile e la frequenza cardiaca deve essere> 120 battiti al minuto, e la circolazione dovrebbe essere evidente
4. Embrioni fotografia prima della rimozione sacco vitellino, se necessario,
5. Rimuovere sacco vitellino da embrione, tagliando un foro vicino l'EPC e lanciando il sacco vitellino e amnios sopra la testa e groppa dell'embrione.
6. Il cordone ombelicale può essere tagliato per separare il sacco vitellino dall'embrione, e il sacco vitellino può essere utilizzata per la genotipizzazione l'embrione, se necessario.
7. Esaminate l'embrione per numero somite e difetti del tubo neurale, come pieghe del cranio aperto, chiusura incompleta del viso e / o un neuropore aperto caudale. Gli embrioni possono essere allestita secondo la classificazione Theiler di cambiamenti morfogenetici multiple ( http://www.emouseatlas.org/ Emap / home.html ) Ancora una volta, un archivio fotografico disviluppo embrionale è utile.

7. Note

1. Una dissezione di alta qualità è essenziale, perché ogni nick o lacrime nel sacco vitellino impedirà di svolta e di successo inibire il normale sviluppo. L'EPC possono essere danneggiati durante la rimozione della membrana di Reichert (RM), e se l'EPC è anche parzialmente separato dal sacco vitellino, gli embrioni non si sviluppano normalmente. Tuttavia, la rimozione incompleta della RM può causare embrioni per stare insieme e / o RM possono invadere le cellule in coltura e restringono l'espansione sacco vitellino, entrambi che impedirebbe il normale sviluppo.
2. Pinze pulite e nitide sono il segreto per ottenere una dissezione bene, perché forcipe opaco o piegato rendere la procedura molto più difficile. Depositi di proteine ​​su strumenti porterà a danni ai tessuti.
3. Pulito, bottiglie di vetro sterile sono essenziali anche per evitare che gli embrioni di attaccarsi alla parete laterale e di essere danneggiati. Prima di iniziare l'esperimento, le bottiglie devono essere scrubbed con acqua e sapone, risciacquati in dH ₂ O, microonde e con una piccola quantità di acqua in ogni bottiglia fino a quando l'acqua bolle. Bottiglie vengono poi risciacquati con il 70% EtOH e lasciato asciugare all'aria.
4. Lavorare il più velocemente possibile, perché la prima l'embrione può essere trasferito ai media cultura e riscaldato di nuovo a 37 ° C la sopravvivenza migliore.
5. Dissezione completa l'intera cucciolata prima di trasferire tutti gli embrioni alle bottiglie rullo in modo che ogni embrione è a temperatura ambiente per la stessa quantità di tempo per evitare di creare qualsiasi discrepanza nella crescita dell'embrione
6. Mantenere un ambiente sterile, per evitare la contaminazione batterica delle culture. I nostri esperimenti cultura sono stati effettuati senza antibiotici, ma molti laboratori aggiungere antibiotici alla loro mezzi di comunicazione per prevenire la crescita batterica. Il mezzo dovrebbe apparire più chiaro alla fine dell'esperimento come era all'inizio dell'esperimento. Se il supporto è diventato nuvoloso o c'è un precipitato visibile, è probabile una truffacontaminazione che ha infettato la vostra cultura.
7. Lo scambio di gas inefficaci può anche ritardare lo sviluppo degli embrioni, in modo da essere sicuri di avere un regolatore affidabile che garantisce la consegna continua.
8. Gli embrioni si sviluppano circa il 50% più lento nella cultura ex vivo, quindi è indispensabile contare somiti per assicurarsi di aver raggiunto l'adeguato livello di sviluppo per il completamento della sperimentazione.

8. Rappresentante dei risultati:

La comparsa degli embrioni pre-e post-roller cultura è illustrato nella figura 1. Al momento della dissezione, degli embrioni dovrebbe essere in una configurazione intentato (Fig. 1 A, D), dove la coda si trova dietro le pieghe testa. Dopo 36 ore di cultura, gli embrioni devono aver completato girando in modo che siano in C-curva, posizione fetale, in cui la coda è di fronte al capo (Fig. 1B, C, E, F). Manipolazione farmacologica con RhoA inibitore della chinasi (Y-27632), un noto inibitore di estensione convergente duranteneurulazione (Ybot-Gonzalez, 2007), si traduce in un accorciamento degli embrioni lungo il loro asse rostro-caudale (Fig. 1E, F) e inibisce la chiusura del cranio neurale volte. I nostri dati mostrano che dosi crescenti di Y-27632 compromette progressivamente cranica chiusura volte (Figura 2A) e riduce l'asse del corpo (Fig. 2B), in coerenza con il ruolo di valle RhoA segnalazione in neurulazione cranico ed estensione convergente.

Figura 1. Aspetto di embrioni culture e di manipolazione con l'inibitore farmacologico Y-27632. (A, D) embrioni Dissected a E8.5 prima della coltura degli embrioni interi (B, E) Gli embrioni in E10 con il sacco vitellino ancora intatto, a seguito 36hrs della cultura rullo. (C, F) Il sacco vitellino è stato rimosso per illustrare il successo di svolta e la chiusura del tubo neurale. Embrioni che sono stati trattati con l'inibitore della chinasi Rho Y-27632 (E, F) non è riuscito a sottoporsi corretta estensione convergente e illustrareun asse del corpo ridotto.

Figura 2. Effetto inibitore della chinasi RhoA sul cranio di chiusura del tubo neurale e di allungamento dell'asse. (A) La percentuale di embrioni che sono stati in grado di chiudere con successo la loro pieghe cranica (NTC% = percentuale di chiusura del tubo neurale) viene confrontato con la dose di Y-27632 aggiunto al mezzo di coltura. (B) La distanza tra vescicola otica e arti anteriori è stato notevolmente ridotto a dosi crescenti di Y-27632 (p <.05).

Discussione

La possibilità di separare materno, i fattori intrauterina da quelli che sono intrinseci all'embrione durante il suo sviluppo è uno strumento importante per studiare tutte le fasi della embriogenesi. Qui abbiamo analizzato gli effetti di un inibitore della chinasi piccola molecola RhoA in utero cranica ex neurulazione, eliminando così la variabile del metabolismo materno del farmaco. Questa manipolazione farmacologica ha un profondo effetto sulla neurulazione cranica ed estensione convergente. Sensibilità a questo composto può essere confrontato fra i differenti mutanti di topo genetica. Il metodo qui presentato può essere applicato anche agli studi di altre vie molecolari in fase di sviluppo, permettendo la manipolazione diretta della funzione cellulare in embrioni usando una varietà di reagenti.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Stereomicroscopio per dissezione	Leica	M165
Incubatore di precisione	BTC Ingegneria (UK)	BTC 001
Rotazione Bottiglia dell'Unità Cultura	BTC	BTC 003
Bottiglie di vetro per rotante Unità	BTC	BTC 005
Silicone Rubber Bung	BTC	BTC 007
Silicone Rubber Cork	BTC	BTC 008
Gas Bubbler ingresso	BTC	BTC 012
Bubbler gas in ingresso trappola	BTC	BTC 013
Gas Bubbler uscita	BTC	BTC 014
Bombola di gas	TechAir		20% di O 2, 5% CO 2
Regolatore del gas	TechAir
Rat Serum maschio	Harlan Labs	4520
DMEM w / o rosso fenolo	Invitrogen	31053
Siringa da 10 ml	BD	309604
Filtro siringa	Nalgene	190-2545
Grande Forbici dissezione (Blunt punta)	VWR	82027-594
Extra Fine Bonn Forbici	Belle Strumenti Scientifici (FST)	14084-08
Dumot # 5 pinze	FST	11252-50
Tyrode di Saline			Come descritto in Cockroft 1990
Piatto 10 centimetri Petri monouso	BD	351029