FSL Costruisce: un metodo semplice per la modifica di Cell / Virion Superfici con una gamma di marcatori biologici senza compromettere la loro vitalità

Riepilogo

Funzione-Spacer-Lipid (FSL) costruisce permettere le caratteristiche della superficie delle cellule viventi e virioni essere modificate senza perdita di vitalità. Il metodo richiede solo semplice contatto di una soluzione di costruire una cella con FSL / virione e l'incorporazione superficie spontanea e stabile si verifica.

Abstract

La possibilità di modificare / visualizzare superfici biologiche, e quindi studiare la cellula modificata / virione in una serie di in vitro e in vivo ambienti è fondamentale per acquisire una visione più completa della funzione di molecole specifiche o l'intera entità. Studi di modifica della superficie biologica sono in genere limitati a ingegneria genetica dell'organismo o l'attacco covalente di combinazione di sostanze chimiche al ^1,2 superficie cellulare. Tuttavia queste tecniche tradizionali esporre la cellula di reagenti chimici, o richiedono la modifica significativa per ottenere il risultato desiderato, che li rende ingombranti, e possono anche involontariamente influenzare la vitalità / funzionalità della cellula modificata. Un metodo semplice per modificare innocuo superficie delle cellule è necessaria.

Recentemente una nuova tecnologia, tecnologia Kode ha introdotto una serie di costrutti romanzo composto da tre componenti: un gruppo di testa funzionale (F), un distanziale (S) e una coda lipidica (L) e sono conosciuti come funzione-Spacer-Lipid o FSL constructs3. Il distanziatore (S) è stata selezionata per fornire un costrutto che si disperde in acqua, ma spontaneamente e stabilmente incorporare in una membrana.

FSL costruire frazioni funzionale (F) finora includono una vasta gamma di saccaridi compreso il sangue di gruppo ai determinanti, acidi sialico, polisaccaridi acido ialuronico, fluorofori, biotina, radiolabels, e una serie di peptidi ^3-12. Costruisce FSL sono stati utilizzati in embrioni di modificare, spermatozoi, pesce zebra, le cellule epiteliali / endometriali, globuli rossi, e virioni per creare controlli di qualità dei sistemi e pannelli diagnostici, di modificare l'adesione cellulare / interazione / separazione / immobilizzazione, e per in vitro e in imaging in vivo di cellule / virioni ^3-12.

Il processo di modifica di cellule / virioni è generico ed estremamente semplice. La procedura più comune è l'incubazione di cellule (in lipidi media liberi) con una soluzione per FSL costruisce per 1-2 ore a 37 ° C ^4-10. Durante l'incubazione del FSL costruisce spontaneamente incorporare nella membrana, e il processo è completo. Lavaggio è opzionale. Cellule modificate da costrutti FSL sono conosciuti come kodecytes ^6-9, mentre virioni sono kodevirions ^10.

FSL costruisce come infusi diretta e kodecytes / kodevirions sono stati utilizzati in modelli sperimentali animali ^7,8,10. Tutti kodecytes / kodevirions sembrano mantenere la loro vitalità e la funzionalità normale guadagnando la nuova funzione della frazione F ^7,8,10,11.

La combinazione di disperdibilità nei media biocompatibile, incorporazione spontanea nelle membrane cellulari, e apparente bassa tossicità, rende FSL costruisce preziosi strumenti di ricerca per lo studio delle cellule e dei virioni.

Protocollo

Il protocollo che segue descrive la procedura generica per l'inserimento di costrutti FSL (Figura 1) in membrane biologiche. Per semplicità il protocollo solo fare riferimento alle celle (kodecytes), che sono ad una concentrazione del 100%. Tuttavia, le cellule termine è intercambiabile con virioni (kodevirions) o organismi o strutture cellulari e la loro concentrazione nel diluente non è importante, a condizione che sia sempre coerente tra le prove, i controlli e gli esperimenti. Con globuli rossi l'ematocrito è tipicamente l'80%, ma con virioni, embrioni e cellule di altri è in genere inferiore all'1%. Il metodo è molto robusto e produrrà le membrane modificate quando viene utilizzato da una delle sue variazioni, ma la raffinatezza saranno richiesti per ottimizzare e standardizzare il grado di modifica necessaria per applicazioni specifiche.

1. Preparazione del FSL Costruisce

1. Per preparare il brodo FSL costruire ricostituire prima soluzione del prodotto secco FSL (Tabella 1) con l'aggiunta di 1,0 ml di diluente (o come specificato nel foglietto illustrativo) al flaconcino del prodotto. Brevemente ultrasuoni (30 secondi). Questo preparerà una soluzione 1mg/mL, che può essere aliquotati in 100 microlitri contenitori sterili e conservati a 2-8 ° C per un massimo di una settimana, o congelati per un massimo di 3 mesi.
2. Per preparare il lavoro FSL costruire soluzioni per l'inserimento, al momento dell'uso brevemente ultrasuoni (30 secondi) della soluzione di riserva per omogeneizzare le micelle. Diluire il costrutto FSL nel buffer (preferibilmente non contenenti lipidi o materiale altamente idrofobi) alla concentrazione richiesta o in un intervallo se lo si desidera.

Note:

1. Costruisce FSL di solito inserire nelle cellule in mezzi contenenti lipidi, ma in genere richiedono tanto quanto un 50X concentrazioni più elevate FSL di lavoro che se in PBS o altri mezzi di lipidi liberi.
2. Le diluizioni campo di lavoro dipende l'applicazione, la sensibilità del metodo di rilevamento, il tipo di FSL costruire, e il grado di modifica necessaria. Tipicamente la gamma di diluizione sarà tra 10-500 mg di FSL per ml di diluente per carboidrati costruisce FSL e 100-100 mg / ml per altri costrutti FSL come fluorofori e biotina.
3. Se la preparazione diluenti inserimento contenente più FSL costruire, basta aggiungere i costrutti insieme nella stessa diluente alla loro concentrazione normale di lavoro. Se un costrutto è ad una concentrazione molto più alta rispetto ad un altro, qualche aggiustamento (aumento) in concentrazione possono essere richieste per la costruzione di minore. In alternativa i costrutti possono essere aggiunti in sequenza, preferibilmente con la più alta concentrazione di costruire per primo, seguito dai minori.
4. FSL costruire concentrazioni superiori a 1000 mg / ml possono introdurre notevoli quantità di lipidi in una membrana cellulare, e può cambiare la forma della cella o rendono più suscettibili alla lisi.
5. FSL costruire soluzioni di lavoro devono essere conservati a 2-8 ° C e utilizzata entro pochi giorni.
6. Costruisce FSL può essere diluito in acqua, ma hanno ridotto la stabilità e deve essere usato entro poche ore. Se il foglietto illustrativo indica l'acqua come diluente ricostituzione il prodotto nel flacone contiene anche sali (come specificato nel foglietto illustrativo).

2. L'inserimento del FSL Construct (s) in Membrane

1. Lavare le cellule per FSL modifica senza lipidi legati mediante centrifugazione e usare PBS o lipidi mezzi cella libera come soluzione di lavaggio.
2. Pacco o sospendere le cellule in 100 ml di diluente.
3. Contemporaneamente preparare i controlli, che idealmente dovrebbero essere entrambe le celle non modificato (incubati con PBS, piuttosto che la soluzione FSL) e / o cellule modificate con un benigno, ma legati FSL costruire.
4. Aggiungere 100 ml di una diluizione appropriata di FSL soluzione (contenente 1 o più costrutti FSL) alle cellule e incubare per 1-2 ore a 37 ° C. Un risultato simile può essere ottenuto da 6 ore di incubazione a 25 ° C o durante la notte (18 ore) a 4 ° C - miscelazione è consigliato ogni poche ore se sospensioni cellulari pesanti vengono utilizzati.
5. Lavaggio (opzionale) due volte con PBS o supporto di togliere qualunque costruisce libero FSL e preparare una sospensione appropriato.

Note:

1. Il diluente utilizzato per sospendere le cellule possono essere terreni di coltura cellulare, PBS, soluzioni di storage cellulare, etc, ma preferibilmente senza lipidi (es. siero fetale di vitello) o detergenti (ad es TWEEN).
2. Diversi volumi (oltre 100 mL) rapporti (a 1:1 cellule / soluzione FSL) o condizioni di incubazione di tempo e temperatura possono essere utilizzati, purché lo stesso rapporto, la concentrazione, e il volume vengono utilizzati per ottenere risultati riproducibili.

3. Gestione e visualizzazione

1. Una volta che il processo di modifica FSL è stato completato il kodecytes può essere conservata a 4-8 ° C in lipidi media liberi o utilizzato.
2. Kodecytes e kodevirions generalmente comportano allo stesso modo le cellule non modificate / virioni e può essere Handled e visualizzati con i sistemi di test normale (microscopia, sierologia, citometria a flusso, ecc.) Di solito non hanno esigenze particolari, tranne per evitare di solventi / detergenti / lipidi che possono eluire i costrutti lipidi dalle membrane.

Note:

1. Costruisce rimarrà nella membrana delle cellule inattive, come i globuli rossi, se conservato in lipidi media liberi per la vita della cellula. Nelle cellule con membrane attivi i costrutti verrà interiorizzato e metabolizzato, ad un tasso dipendente l'attività della membrana cellulare.
2. Le cellule morte di solito contengono alti livelli di costrutti FSL, questo può essere usato per separare le cellule non vitali da cellule vitali.
3. Se kodecytes sono conservati (o utilizzati in vivo) in lipidi contenenti media / gli ambienti, come ad esempio siero / plasma il costrutto lentamente eluire dalla membrana in un periodo di ore o giorni, a seconda della temperatura e le concentrazioni di lipidi / composizioni.

4. Rappresentante dei risultati:

1. I risultati rappresentativi seguenti dipendono dal costrutto usato (Tabella 1), la sua concentrazione inserito e la sensibilità e specificità del sistema di rilevazione (s). In generale tutti i costrutti FSL inserisce nelle cellule dopo 1 ora, ma le condizioni ottimali dovrà essere stabilito per ogni situazione.
2. Costruisce FSL può essere usato per etichettare l'esterno di una varietà di cellule vive ^3-9,11,14. Negli esempi mostrati in figura 2 embrioni a diversi stadi sono stati utilizzati (in quanto sono una cellula fragile), ma altre cellule (Figura 3) o virioni avvolto (Figura 4) possono anche essere etichettati. FSL-fluoresceina permette di etichettatura diretta delle superfici (Figure 2-4), mentre FSL-biotina e altri costrutti FSL può richiedere l'uso di un sistema di rilevamento secondario (di solito avidina / anticorpi / lectine) per mostrare la loro presenza (Fig. 5) .
3. Markers del gruppo sanguigno della specificità umana o animale può essere collegato alle cellule, comprese le cellule rosse ^4-9 (Figura 6). Poiché la quantità di FSL costruire su un kodecyte è controllabile e riproducibile ^4-6, kodecytes per la quantificazione degli anticorpi possono essere effettuate (Tabella 2 e Figura 6). La fonte reale di cellule non è importante, che può essere di qualsiasi specie, o addirittura della stessa origine come fonte di anticorpi, garantendo così il solo antigene incompatibili è quello adottato dalla FSL ^7,8 (Figura 6).

Tabella 2. Rappresentante reazioni sierologiche di tre diversi FSL-A (tri) kodecytes globuli rossi testati contro diluizioni di anticorpi monoclonali anti-A. La soluzione al 50 mM di FSL-A (tri) quando incubato con un uguale volume di gruppo O globuli rossi prodotta una forte cellule antigene positivo, che potrebbe essere rilevato da una diluizione 1:512 di anticorpi monoclonali anti-A. Il 5 - e 10 volte inferiore FSL-A (tri) soluzioni prodotte kodecytes con gruppo sanguigno A meno espressione dell'antigene.

Figura 1. FSL costruire panoramica. Come un fiore costruisce FSL è costituito da tre componenti principali. La testa funzionale (F) nel caso del costrutto FSL può essere una varietà di diversi gruppi biologicamente funzionali, un distanziale (S) per indurre una distanza di F dalla membrana, migliorare disperdibilità acqua e non reattivi con il siero, mentre i lipidi diacyl permette la costruzione di incorporare spontaneamente in superficie. (I) FSL-GB3 con un gruppo sanguigno Gb ₃ (o P ^k) trisaccaride Galα4Galβ4Glcβ epitopo. (II) FSL-A (tri) con un gruppo sanguigno A trisaccaride epitopo GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-fluoresceina. (IV) FSL-biotina con una singola porzione F biotina. Il gruppo funzionale di strutture in I-III sono coniugati con un derivato adipato attivata di dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), mentre il distanziale della struttura IV è carboxymethylglycine-adipato base.

Figura 2. FSL-fluoresceina etichettati embrioni murini. Tutte le immagini sono di embrioni vivi che sono stati etichettati quando la loro zona pellucida (ZP) era intatto (cioè la FSL costruire passato attraverso il ZP di etichettare l'embrione all'interno). Immagini I-IV sono di ZP-free embrioni liberati dalla loro ZP con etichettatura acido messaggio tyrodes con FSL-fluoresceina. Colorazione identica si verifica indipendentemente dal fatto che gli embrioni sono stati modificati con FSL ZP intatti o ZP libero. Gli embrioni sono direttamente etichettati con FSL-fluorescina, a ore 2 37 ° C Metodo di mezzi di comunicazione cellulare i livelli di free cultura, lavati e quindi visualizzati al microscopio a fluorescenza. (I) ZP libero due cellule embrionali murine, anche mostrando classica colorazione intensa globulo polare. (II-III) ZP libero quattro celle e otto embrioni di cellule murine, che mostra sia le macchie d'ombra delle cellule che sono outide microscopio il piano di messa a fuoco. (IV) ZP libero 16 embrionale delle cellule murine. (V) ZP embrioni intatto blastocisti murine (D4-D5), dove sono etichettati sia l'embrione e la zona.

Figura 3. FSL-fluoresceina e zebrafish ^14. (I) Microangiography su un HPF 52 (ore dopo la fecondazione) larve di zebrafish iniettato direttamente in circolo con FSL-fluoresceina. La vascolarizzazione zebrafish è macchiato. (II) FSL-fluoresceina eterogeneo Zebrafish cellule del tessuto renale (ZK kodecytes) sono stati creati ex vivo allora micro-iniettati nella circolazione di un Zebrafish 52 hpf destinatario. Nelle osservazioni in vivo del kodecytes ZK sono state fatte due ore dopo l'iniezione di imaging del vascolarizzazione in fluorescenza con microscopia time-lapse. Mostrato è un fotogramma video singola con grandi cellule si muovono lentamente o immobile (indicato con frecce arancioni) e le cellule in movimento veloce (immagini sfocate dovute al movimento - indicato con frecce verdi). Etichettatura permette in tempo reale in osservazione in vivo del comportamento e la biodistribuzione kodecytes ZK. (III) l'assorbimento orale di FSL-fluoresceina ottiene immergendo in embrioni di zebrafish FSL-fluoresceina contenente i media per un massimo di 5 giorni. Lavaggio è stato ottenuto con il trasferimento di embrioni in mezzi non contenenti costruisce FSL (almeno 6 ore è necessario ma può essere per alcuni giorni). (IIIa) microscopia a campo luminoso della FSL-fluoresceina zebrafish trattati corrispondente all'immagine adiacente fluorescenza (IIIb). Il fluoresence era preferenzialmente trova nel tratto intestinale. Nessuna colorazione è stata osservata negli embrioni di controllo non trattati (IVA e IVB).

Figura 4. FSL-fluoresceina etichettatura dei virioni ¹⁰ VSV e H1N1. (I) del virus stomatite vescicolare (VSV) era direttamente marcato con 10 mcg / ml FSL-fluoresceina per 2 ore a 37 ° C, seguita da fissare con il 4% paraformaldeide e poi citometria a flusso. Nessun purificazione del kodevirion VSV messaggio FSL etichettatura è stato richiesto. (II) La citometria a flusso delle cellule testicolari suini infettati da A / Puerto Rico/8/1934 (H1N1) kodevirions etichettati utilizzando FSL-fluoresceina. Cellule non infettate sono visti come la linea nera, mentre la fusione del kodevirion H1N1 con i risultati ST celle in una cella a fluorescenza (linea rossa).

Figura 5. FSL-biotina cellule marcate e successiva visualizzazione tramite l'etichetta avidina ^7,8. Tutte le cellule sono stati etichettati con FSL-biotina per 1 ora a 37 ° C, lavate poi reagito con fluoroforo etichettati avidina, lavato e bagnato montate per la microscopia a fluorescenza. (I) Compilato immagine confocale di una blastocisti dell'embrione murino. (II) Centrale fetta confocale dell'embrione dall'immagine precedente. (III) dal vivo mobili spermatozoi umani - sfocatura si verifica come conseguenza del loro moto. (IV) Fisso (4% inserimento post paraformaldeide) spermatozoi umani. (V) degli eritrociti umani. (VI) fisso (4% paraformaldeide pre-inserimento) RL95 carcinoma dell'endometrio umano. (VII) non fissato RL95 umane di carcinoma endometriale linea cellulare. (VIII) Biotina RBC kodecytes osservato in un campione di sangue prelevato 2 ore dopo l'infusione endovenosa di kodecytes con (VIII) che rappresenta un campo viste al microscopio ottico, mentre (VIII ter) è lo stesso campo visto in fluorescenza, identificando i due kodecytes presenti nel campo di vista. Calcolo del rapporto tra kodecytes alle cellule senza etichetta può essere utilizzata come un indicatore di sopravvivenza. (IX) dal vivo umano kodecytes biotina endometriale visualizzati legandosi a microsfere avidinylated.

Figura 6. FSL-carboidrati per aggiungere marcatori gruppo sanguigno per il profiling sierologici. (I) di globuli rossi umani kodecytes Galili sono stati creati con una concentrazione serie di FSL-Galili (500 mg / mL) e testato contro le diluizioni di siero umano. Eritrociti umani non si presentano in natura con l'antigene xenoantigen Galili. Kodecytes tale può essere usato per livelli quantitativi di anticorpi nel siero. In questo esempio, il donatore è stato determinato per avere un anti-Galili titolo di 1:32. (II) Con la creazione di kodecytes con livelli decrescenti di FSL ("titoli antigenici"), un livello ottimale di rilevare l'antigene anticorpo può essere determinato (in questo esempio Le ^a). Le celle possono essere creati per dare solo un risultato positivo quando supera il livello di anticorpi un titolo specifico. Il livello di antigene FSL necessario per fornire un risultato positivo dipende dalla qualità e il livello di anticorpi essere rilevato. Per gli antigeni carboidrati, una soluzione FSL di 100 mg / ml avrà come risultato una forte reazione positiva. (III) Umani gruppo O globuli rossi sono stati modificati per avere un livello specifico di una formicaigen (standardizzato A kodecytes), e utilizzato per quantificare con precisione e riproducibile anti-A nel siero umano. In questo esempio l'anti-A titolo nel gruppo O siero testato è 1:32 e le kodecytes sono stati preparati dalle stesse cellule rossi del donatore. (IV) Gruppo sanguigno antigeni A e B contemporaneamente inserita in un unico gruppo cella campione O rosso sono utilizzati per creare un kodecytes B _{debole debole.} Questi kodecytes possono essere utilizzate per scopi ABO controllo della qualità. Questo risultato mostra l'analisi di un specificamente formulato A kodecyte B _{debole debole} testato contro i reagenti anti-A e anti-B e dà previsto reazioni deboli.

Discussione

Cellule modifica e virioni con costrutti FSL è una tecnica molto semplice e robusto ^3-11. Per descrivere e distinguere FSL costruire cellule modificate e virioni dalle cellule non modificate, sono chiamati kodecytes e kodevirions rispettivamente ^6-10, ma solo quando il gruppo ha introdotto funzionale può dimostrare di essere presenti sulla loro membrana. Quando kodecytes sono realizzati con diverse concentrazioni di costrutti FSL, possono essere a cui si riferisce la concentrazione della soluzione FSL costrutto usato per crearli, ad esempio 15 mg / ml A kodecytes, o se più di un FSL è un termine usato poi combinati, ad esempio A + biotina kodecytes ^7,8. Quando le cellule sono diverse da confrontare, tra cui il tipo di cellula nella descrizione si consiglia, per esempio globuli rossi kodecytes biotina o kodecytes biotina endometriale ^7,8.

Sebbene il processo di inserimento è molto robusto e l'inserimento (anche se con tassi differenti) si verifica in un intervallo di temperatura 4-37 ° C e in pochi minuti ad ore, per ottenere il controllo riproducibile inserimento stretto tempo di contatto, temperatura, concentrazione FSL ( compresa la formulazione diluente) e, in misura minore concentrazione di cellule sono obbligatori. Ad oggi, tutti i costrutti FSL può essere usato per modificare le cellule con la stessa tecnica ^4-11, tuttavia si prevede che alcune condizioni saranno più favorevoli per flusso di lavoro e / o le esigenze di gestione ottimale delle cellule / dei virioni da modificare . La concentrazione esatta FSL per ottenere l'effetto desiderato deve essere determinato dal ⁴ utente. La risultante FSL costruire cellule modificate / virioni di solito può essere utilizzato nello stesso modo come una cellula non modificato / virione nei sistemi biologici o analitica ^4-11. Come i costrutti FSL lentamente eluire dalle superfici modificate, a contatto con soluzioni di lipidi ^7,8, o essere consumati da cellule attive ^11, questi temi devono essere considerati in relazione al livello di segnale o attività ottenuti in periodi di tempo. Kodecytes può essere fisso (es. glutaraldeide / formalina) dopo l'inserimento a condizione che il fissativo non contiene lipidi a eluizione di solventi e il gruppo funzionale è compatibile con il fissativo. Cellule in alternativa fissa possono essere modificati con costrutti FSL.

Oltre alla modifica della superficie delle cellule e virione costruisce FSL può essere infuso direttamente nella circolazione degli animali da laboratorio causando una modificazione in vivo di cellule circolanti ⁷ e per inibire virus ^12, tossine, ¹² e gli anticorpi ^7. Costruisce FLS sono stati utilizzati anche per decorare liposomi e possono essere stampati su superfici di carta ^13, dove si immobilizzano, e può quindi essere utilizzato in test diagnostici.

La possibilità di modificare facilmente le cellule vive con una gamma crescente di costrutti FSL deve dimostrare di essere una ricerca utile e tool di sviluppo per lo studio della biologia cellulare di superficie.

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