Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

Riepilogo

La Biblioteca ID di destinazione è un plasmide-based, genome-wide collezione di cDNA clonati utilizzati per identificare gli obiettivi miRNA. Qui mostriamo il suo utilizzo ed applicazione.

Abstract

La Biblioteca ID di destinazione è stato progettato per aiutare a obiettivi di individuazione e identificazione dei microRNA (miRNA). La Biblioteca ID di destinazione è un plasmide-based, genome-wide libreria di cDNA clonato nei 3'UTR valle del dual-selezione proteina di fusione, la timidina chinasi-zeocin (TKzeo). Il primo turno di selezione è per trasformanti stabili, seguita con l'introduzione di un miRNA di interesse, e, infine, selezionando per cDNA contenenti obiettivo del Mirna. CDNA selezionati sono identificati mediante sequenziamento (si veda la Figura 1-3 per flusso di lavoro Biblioteca ID Target e dettagli).

Per garantire un'ampia copertura del trascrittoma umano, Target ID Biblioteca cDNA sono stati generati tramite oligo-dT priming con un pool di RNA totale preparati da diversi tessuti umani e linee cellulari. CDNA risultante intervallo da 0,5 a 4 kb, con una dimensione media di 1,2 kb, e sono stati clonati nel dual-selezione p3TKzeo plasmide (vedi figura 4 per la mappa del plasmide). Gli obiettivi gene rappresentati nel library si possono trovare sul sito Sigma-Aldrich. I risultati di sequenziamento Illumina (Tabella 3), mostra che la biblioteca comprende 16.922 dei 21,518 geni unici in UCSC RefGene (79%), o 14.000 geni con 10 o più letture (66%).

Protocollo

1. Trasfezione con libreria di destinazione ID e di selezione per linee cellulari stabili

1. Zeocin uccisione Curve

Zeocin viene utilizzato per selezionare per cellule transfettate stabilmente. Tuttavia, zeocin eccesso provoca indesiderati risposte fenotipici in maggior parte dei tipi di cellule. Pertanto, una analisi della curva di uccisione deve essere eseguito per stabilire la minima dose letale.

1. Piastra 1,6 x 10 ⁴ cellule in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti in 120 pl di supporto.
2. Il giorno successivo aggiungere zeocin ascendente concentrazioni che vanno da 50 pg / ml a 1 mg / ml nei pozzetti appropriati.
3. Verificare la vitalità ogni 2 giorni.
4. Sostituire supporti contenenti zeocin ogni 3 giorni. La concentrazione minima di reagente selezione che provoca la morte cellulare completa dopo il tempo desiderato dovrebbe essere utilizzato per tale tipo di cellula e esperimento. I nostri risultati mostrano che 500 mg / ml zeocin è ottimale per la A549, HeLa e MCF7 cellule.

2.Transfection Biblioteca via Nucleofection e Selezione

1. Selezionare una linea cellulare che esprime o non esprime o bassi livelli di vostra miRNA di interesse. Il miRNA sarà introdotto nella sezione B per la selezione del target, dopo espressione stabile della Biblioteca ID obiettivo è stato raggiunto.
2. Cultura / espandere cellule. Abbiamo ottenuto ottimi risultati con 2 x 10 ⁷ cellule per trasfezione biblioteca.
3. Tripsinizzare le cellule che si trovano in> 80% di confluenza, e trasferire 2 x 10 ⁷ cellule ad un tubo da 15 ml a vite sterili ripiano.
4. Pellet cellule tripsinizzate a 200 xg per 5 min.
5. Rimuovere medie e lavare il pellet cellulare con HBSS o PBS 1X.
6. Centrifugare a 200 xg per 5 minuti e aspirare lavaggio.
7. Ripetere la fase di lavaggio della cella pellet.
8. Pre-6-caldi pozzetti con 2 ml di mezzo completo a 37 ° C.
9. Aggiungere 2 microgrammi di libreria target ID (non superiore a 10 pl) per 0,5 ml tubetto per ogni trasfezione.
10. Risospendere le cellule del tubo 15 ml dall'alto con 100 pl di soluzione Nucleofection Amaxa (cella specifica) a 2 x 10 ⁶ cellule. Ad esempio, per 10 Nucleofections aggiungere 1 ml di reagente.
11. Una reazione alla volta, aggiungere 100 microlitri di cellule al 2 pg di plasmide. Mescolare con pipetta.
12. Trasferire miscela in una cuvetta Nucleofector.
13. Inserire la cuvetta nello strumento Nucleofector ed eseguire il programma ottimizzato appropriato per la linea cellulare (High Efficiency preferito su La vitalità cellulare).
14. Riempire la pipetta di trasferimento con mezzo di pre-riscaldata. Raccogliere cellule in stessa pipetta e trasferimento piastra da 6 pozzetti. Ripetere per ogni Nucleofection, uno per bene.
15. Rientro in camera di crescita per l'incubazione durante la notte.
16. Il giorno successivo, sostituire medie e permettere alle cellule di recuperare per 3-5 giorni.
17. Sostituire media con terreno completo contenente il livello adeguato di zeocin, come determinato dall'analisi della curva kill.
18. Momentocellule nitor per la selezione zeocin (cellule morte).
19. Sostituire il mezzo con zeocin ogni 2-3 giorni.
20. Una volta confluenti in piastra da 6 pozzetti, passaggio, piscina ed espandere cellule in più grandi fiaschi.
21. Periodo di tempo per l'espansione delle cellule è facile e la linea di cella dipendente, ma è altamente raccomandato per espandere zeocin cellule resistenti a generare cryo-stock future per lo screening (circa 2-3 settimane; linea cellulare dipendente).

2. Celle Biblioteca trasfezione con miRNA-Expression Construct, selezionate per la linea cellulare stabile e selezionare gli obiettivi miRNA

Nota: selezione Zeocin non è più necessario o desiderato. L'esposizione delle cellule di zeocin durante l'espressione miRNA e ganciclovir (target) di selezione può causare la perdita di obiettivi miRNA.

3. Puromicina, G418, e ganciclovir Curve kill

1. Effettuare una curva di uccidere per ganciclovir con le cellule che esprimono stabilmente la Biblioteca ID di destinazione e con puromicina o G418 per il tipo selvaticocellule.
2. Piastra 1,6 x 10 ⁴ cellule in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con 120 pl mezzi freschi. Il giorno successivo aggiungere 0,1-10 ug / ml di puromycin/G418, o da 2 a 32 pM ganciclovir a pozzetti selezionati.
3. Verificare la vitalità ogni 2 giorni. Sostituire i supporti contenenti reagenti selezione ogni 3 giorni. La concentrazione minima di reagente selezione che consente una completa * morte cellulare dopo il tempo desiderato, devono essere utilizzati per tale tipo di cellula e esperimento. I risultati mostrano che 0,25-1 ug / ml puromicina è ottimale per A549, HeLa, cellule, e MCF7 0,3 mcg / ml G418 per MCF7 e 8-16 pM ganciclovir sono ottimali per A549, HeLa e MCF7.
   
   * Nota: Con la selezione ganciclovir, la crescita cellulare lenta o non può essere osservato senza morte cellulare completo. Osservare le cellule rispetto al trattamento di diversi giorni per verificare che non sono attivamente dividendo. Se questo è il caso, allora rosso fenolo nel mezzo rimane rosso. Può anche essere necessario eseguire un kianalisi della curva LL della biblioteca ID di destinazione transfettate cellule se un cambiamento di sensibilità si osserva. Tuttavia, questo dovrà essere determinata su base specifico tipo di cellula.

4. miRNA Transfection via Nucleofection e Target Selection

1. Grow / espandere cellule bersaglio l'ID della libreria per raggiungere 2 x 10 ⁷ cellule, e Tripsinizzare quando le cellule sono in> 80% di confluenza.
2. Transfer 2 x 10 ⁷ cellule ad una vite 15 ml sterile sormontata provetta e pellet a 200 xg per 5 minuti.
3. Rimuovere medie e lavare il pellet cellulare con HBSS o PBS 1X.
4. Centrifugare a 200 xg per 5 minuti e aspirare lavaggio.
5. Ripetere la fase di lavaggio della cella pellet.
6. Pre-6-caldi pozzetti con 2 ml di mezzo completo per pozzetto a 37 ° C.
7. Aggiungere 2 microgrammi di plasmide di espressione di miRNA (non superiore a 10 pl) per provetta ml 0,5 per ogni trasfezione. Origene MicroRNA plasmidi di espressione (neomicina - G418 selezione) o geni miRNA self-clonati in pBABE-Puro (plasmide 1764; Addgene) sono stati utilizzati con successo. Per questi ultimi, il tornante miRNA con ~ 200 bp su entrambi i lati PCR è stato clonato dal DNA umano.
8. Risospendere le cellule del tubo 15 ml dall'alto con 100 pl di soluzione Nucleofection Amaxa (cella specifica) a 2 x 10 ⁶ cellule. Ad esempio: Per 10 Nucleofections, aggiungere 1 ml di reagente.
9. Una reazione alla volta, aggiungere 100 microlitri di cellule al 2 pg di plasmide. Mescolare con pipetta.
10. Trasferire miscela in una cuvetta Nucleofector.
11. Inserire la cuvetta nello strumento Nucleofector ed eseguire il programma ottimizzato appropriato per la linea cellulare (ad alta efficienza preferito su vitalità cellulare).
12. Riempire la pipetta di trasferimento con mezzo di pre-riscaldata. Raccogliere cellule in stessa pipetta e trasferimento piastra da 6 pozzetti. Ripetere per ogni Nucleofection, uno per bene.
13. Rientro in camera di crescita per l'incubazione durante la notte.
14. Sostituire media e consentono alle cellule di recuperare per 3-5 giorni.
15. Sostituire media con terreno completo contenente un adeguato livello di puromicina o G418 come determinato dal test eseguito prima curva di uccidere trasfezione con il miRNA costrutto.
16. Monitorare cellule per puromicina / G418 selezione (cellule morte).
17. Sostituire il mezzo con puromicina / G418 ogni 2-3 giorni.
18. Una volta confluenti in piastra da 6 pozzetti, passaggio, piscina ed espandere cellule in più grandi fiaschi.
19. Periodo di tempo per l'espansione delle cellule è facile da dipendente, ma è altamente raccomandato per espandere puromicina / G418 cellule resistenti a generare cryo-stock future per lo screening (circa 2-3 settimane; linea cellulare dipendente).
20. Sostituire media con gli adeguati livelli di ganciclovir (GCV) e puromicina / G418, come stabilito dal test eseguito prima curva di uccidere trasfezione con il miRNA costrutto.
21. Monitorare le cellule per la selezione (cellule dying, Mirna targeting e atterramento di TK-ZEO).
22. Espandere cellule in presenza di GCV e puromicina / G418.
23. Preparare DNA genomico dalle cellule GCV selezionate.
24. PCR amplifica inserti con primer kit (vedi Amplificazione PCR).
25. Clone nel vettore TOPOTA (Invitrogen) per il sequenziamento standard o presentare prodotti di PCR per il sequenziamento profondo.

3. PCR-Amplifica libreria inserisce selezionati e sequenza

Nota: Questa procedura viene eseguita per PCR-amplificare gli obiettivi delle biblioteche che sono sopravvissuti alla selezione ganciclovir.

5. Raccogliere ganciclovir celle selezionate per preparare il DNA cromosomico con un GenElute mammiferi Miniprep Genomic DNA Kit (Numero di catalogo G1N10) o equivalente. Si consiglia preparando il DNA dalla linea cellulare genitore che non contiene ID libreria target da usare come controllo negativo per il confronto con il DNA dalle cellule bersaglio-PCR selezionati.

1. PCR Amplify il DNA genomico con primer 1 e 2 primer di amplificazione. Amplificazione di successo è stato ottenuto con reazione JumpStart REDTaq Mix Readymix - per PCR (Numero di catalogo P0982). Ottimizzazione delle condizioni può essere necessario se si utilizza un'altra polimerasi. Fare riferimento alla Tabella 1 per un setup campione PCR e la Tabella 2 per le condizioni di ciclismo PCR.
2. Risolvere 2-5 pl del prodotto di PCR su un gel di agarosio all'1%. Il prodotto dovrebbe essere previsto uno striscio con un po 'del DNA visibile strisce. Confronta con controllo del prodotto PCR del DNA genomico da cellule senza la Libreria ID Target.
3. Procedere con clonazione e / o sequenziamento profondo di prodotto PCR. Se nessun prodotto di amplificazione viene rilevato oppure è identico a controllare DNA, ottimizzare le condizioni di amplificazione PCR (cioè, concentrazione dei primer, temperatura di ricottura, e cicli).

6. Clonazione e il sequenziamento

Nota: Si consiglia la clonazione del prodotto di PCRs e quindi eseguendo sequenziamento standard da almeno 96 dei cloni usando i primer di amplificazione forniti nel kit. Questa procedura è stata eseguita con successo da 96 e culture a vista e sistemi di depurazione plasmide. Anche se sequenziamento profondo si desidera, i risultati preliminari clonazione e il sequenziamento standard può essere usato come un controllo di qualità per determinare se il costo supplementare di sequenziamento profondo è garantito.

1. Seguire protocollo clonazione TA kit fabbricazione per clonazione prodotti di amplificazione PCR (sopra).
2. Trasforma cloni competenti nelle cellule batteriche e selezionare una notte su terreno contenente antibiotici.
3. Isolare le singole colonie e far crescere in coltura liquida contenenti antibiotico appropriato.
4. Purifica DNA plasmidico. 6,5. Eseguire reazioni di sequenziamento con primer di amplificazione.
5. Identificare i geni bersaglio di allineamento di sequenze con BLAST trascrittoma umano (per trascrizioni note) e genoma umano (per il romanzo transcripts) *.

* Clonazione risoluzione dei problemi: Se un numero elevato di inserti di sequenziamento sono sequenza di plasmide, ottimizzare i clonazione / sequenziamento condizioni in quanto tale:

• PCR Amplification prodotto (insert) qualità e quantità
• Legatura di reazione
• Preparazione di plasmidi (qualità e quantità)
• Sequencing condizioni di reazione

4. Risultati rappresentativi

Schermata Catalogo per miR-373 obiettivi
Per valutare le prestazioni della Biblioteca destinazione Mission ID, miR-373 obiettivi sono stati selezionati da cellule MCF-7 biblioteche che esprimono. MCF-7 è stato scelto perché esprime poco o non rilevabile miR-373 (dati non mostrati). miR-373 è stato scelto per il suo interesse biologico. miR-373 espressione promuove invasione tumorale e metastasi in MCF-7, normalmente un non-metastatica linea cellulare [2]. Inoltre, miR-373 orthologues dal mouse del cluster miR-290 sono coinvolti nel topo staminali embrionalila manutenzione delle cellule [3], e il miR-373 membro della famiglia, miR-372, promuove la riprogrammazione dei fibroblasti alle cellule staminali pluripotenti indotte [4]. Infine, abbiamo utilizzato zinc finger nucleasi per inserire un promotore PGK-miR-373 costrutto di espressione nel sito AAVS1 in cellule MCF-7, e generato un elenco di possibili bersagli miR-373 mediante analisi RNA microarray (dati non mostrati).

L'ID della libreria target è stato transfettato in cellule MCF-7, e una popolazione stabile di cellule è stato selezionato e amplificato in zeocin mezzo contenente. Le cellule risultanti (MCF-7 Library) sono state stabilmente transfettate con un costrutto miR-373 esprime e selezionati in ganciclovir mezzo contenente per arricchire per cellule esprimenti miR-373 bersagli. Abbiamo osservato che il controllo negativo cellule MCF-7 libreria (senza miR-373) non staccare e diventare arrotondato come previsto per cellule morte. Tuttavia, hanno fatto smettere di crescere, che è stato prontamente rilevato perchè il rosso fenolo contenente mezzo non diventa arancione-giallo come osservato for cellule che esprimono miR-373 (Fig. 5). Le cellule sono state espanse in ganciclovir mezzo contenente, e sequenze bersaglio sono stati isolati mediante PCR con inneschi fiancheggianti degli inserti ID libreria di cDNA bersaglio e DNA preparato dalle cellule sopravvissute. I prodotti di PCR sono stati sequenziati Illumina.

Come mostrato in Tabella 4, abbiamo ottenuto 17.740.719 letture cDNA, che mappato a 11.076 geni unici. Di questi geni unici, 2.898 sono stati rilevati con più di 40 letture, e quindi sono stati considerati risultati affidabili. Il vettore 13.106.469 legge erano attesi perché i primer PCR usati per amplificare inserti di cDNA sono 40 e 300 basi di distanza dal sito di inserimento. Come tale, si prevede che le sequenze più deriverebbero dal vettore differenza di sequenziamento più tradizionale profonda di materiale genomico. Quattordici per cento non ha il mapping a uno vettoriale o cDNA, ma non allinearsi con NCBI non-base di dati ridondanti nucleotide (vale a dire, con hit NR), e solo l'1% non ha avuto inserto di cDNA.

Un primo confronto ha rilevato che 10 dei geni unici identificati con la Biblioteca ID di destinazione sono anche nella lista dei precedentemente identificati miR-373 obiettivi in TarBase (tabella 5). Questi 10 miR-373 obiettivi sono stati precedentemente identificato da microarray con RNA da cellule HeLa trasfettate in maniera transiente con un sintetico miR-373 imitare [5]. Inoltre, abbiamo rilevato questi stessi 10 geni down-regolati in cellule MCF-7 che esprimono miR-373 dal sito AAVS1 (dati non mostrati). Pertanto, questi 10 sono probabili bersagli validi di miR-373. Il lavoro è in corso per caratterizzare l'elenco dei potenziali bersagli e tenta di validare sperimentalmente colpi selezionati mediante RT-qPCR, Western blot, e il dosaggio reporter della luciferasi.

Figura 1. Flusso di lavoro per la libreria di destinazione ID. Sezioni AC: fare riferimento alle varie sezioni della procedura. Ogni passo è illustrato e descritto in dettaglio in figure 2 e 3.

Figura 2. Trasfezione e selezione Zeocin. L'ID della libreria di destinazione è un pool di plasmidi (A), ciascuno con un cDNA umano inserito nel 3'-UTR dopo una chinasi-zeocin proteina di fusione timidina (TKzeo; Fig. 4). Le cellule sono trasfettate con Target ID Library (B) e ha permesso di recuperare per 3-5 giorni. I costrutti possono integrarsi nel genoma durante questo periodo di recupero (C), ed esprimere la trascrizione codificato (D). Dopo il recupero, le cellule sono esposte a zeocin (E). Le cellule che esprimono la proteina di fusione TKzeo dai costrutti di destinazione stabilmente integrato ID sopravvivere zeocin selezione (F). Le cellule non trasfettate die (G). Inoltre, qualsiasi cellula contenente un costrutto che è un bersaglio per un miRNA endogeno o tutte le altre,fattore er espresso nella cellula che inibisce l'espressione di TKzeo dal ID destinazione costrutto moriranno (H).

Cellule Figura 3. Trasfezione miRNA e selezione ganciclovir. Contenenti la libreria target ID (cioè, zeocin selezionate cellule) sono trasfettate con un costrutto di espressione microRNA selezionabile (A). Durante il recupero, il costrutto di espressione miRNA può integrare (B) ed esprimono il marcatore selezionabile codificato sul miRNA costrutto. Dopo la selezione per l'integrazione stabile (C) e l'espansione delle cellule, le cellule vengono trattate con ganciclovir (D). Le cellule che producono timidina chinasi (TK) in presenza di ganciclovir (ossia, cellule che esprimono costrutti TKzeo non interessato dal miRNA) morirà (E) D'altro canto, le cellule contenenti costrutti libreria con s bersaglio miRNA iti non produrrà TK, e quindi, sopravviverà selezione ganciclovir (F). Cellule sopravvissute può essere coltivata, gDNA isolato, e il cDNA contenenti siti di destinazione miRNA PCR-amplificato utilizzando i primer ID amplificazione di destinazione. I prodotti della PCR possono essere sequenziati e allineato con il genoma umano per identificare bersagli miRNA.

Figura 4. Map plasmide e del percorso del primer di amplificazione. I Sfi sono i siti di clonazione cDNA.

Primer Sequenze

MISSION target di amplificazione Primer ID 1

5 ACGACGTGACCCTGTTCATC 3

MISSION target di amplificazione Primer ID 2

5 TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3

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Figura 5. Ganciclovir effetti sulla crescita cellulare. Ventiquattro pozzetti sono stati seminati con 2-100.000 cellule MCF-7 e MCF-7 cellule contenenti la Biblioteca ID Target. Ventiquattro ore dopo, il mezzo è stato sostituito con terreno contenente 0, 8, o 16 pM ganciclovir. Dopo 15 giorni, la piastra è stata fotografata (6 pozzetti superiori), poi i pozzetti lavati con HBSS e colorati con la colorazione blu brillante soluzione R (B6529) (6 pozzetti inferiori). Si noti che ganciclovir ha alcun effetto sulla cellule MCF-7 senza libreria perché non esprimono timidina chinasi (TK). D'altra parte, cellule MCF-7 libreria fare esprimono TK ma non sono completamente uccisi da ganciclovir a 8 o 16 pM, come mostrato dalle cellule vive che occupano Brillinat blu. Tuttavia, le cellule Libreria si fermano crescere in ganciclovir, come evidenziato dal colore del colorante rosso fenolo in mezzo loro. Le cellule arrestate non acidificare loro mezzo, e il colore rimane rosso, invece di cambiare oange-giallo.

Reagente	Volume / Reazione
Jumpstart REDTaq Readymix mix di reazione	10 pl
Primer di amplificazione 1 (25 pM)	0,2 pl
Primer di amplificazione 2 (25 pM)	0,2 pl
Il DNA genomico	50-200 ng
Acqua, Grade molecolare	a 20 pl

Tabella 1.

Passo	Temp.	Tempo	Cicli
Denaturazione iniziale	95 ° C	5 min.	1
Denaturazione	95 ° C	30 sec.	pan = "3"> 40 cicli
Ricottura *	62 ° C	30 sec.
Estensione	68 ° C	2 min.
Estensione finale	68 ° C	5 min.	1
Tenere	4 ° C	Tenere

Tabella 2.

* Le temperature di ricottura può variare, ma abbiamo osservato i migliori prodotti di amplificazione con temperature di ricottura comprese tra 53 e 64 ° C.

Tabella 3. Destinazione libreria di contenuti ID mediante sequenziamento Illumina.

Tabella 4. MiR-373 target selezionati di sequenziamento Illumina.

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Tabella 5. A 10 obiettivi precedentemente individuati dalla RNA microarray.

Discussione

microRNA sono 20-24 nucleotidi RNA che regolano l'espressione genica post-trascrizionale di mRNA inibendo traduzione, e spesso, destabilizzando l'mRNA bersaglio (recensione in [6]). Un singolo miRNA può regolare centinaia di mRNA per controllare la risposta di una cellula di segnali di sviluppo e ambientali. Identificazione e validazione mRNA bersaglio è essenziale per determinare il ruolo di un miRNA e la funzione in queste vie. Tuttavia, l'identificazione di destinazione non è semplice perché, negli animali, i miRNA ei loro siti bersaglio non sono del tutto complementari. La regione "seme", si basa da 2 a 7 dalla 5'-end del miRNA, di solito è complementare ai suoi obiettivi. Tuttavia, ci sono molte eccezioni alla regola seme, ed a valle di base di accoppiamento in grado di compensare per una partita di semi imperfetta. Un certo numero di algoritmi informatici sono stati sviluppati per prevedere obiettivi miRNA basate sulla corrispondenza dei semi e la compensazione a valle, struttura di destinazione unoposizione d, conservazione della sequenza, e vari altri parametri che sono stati osservati per i target validati sperimentalmente (recensione in [7]). Mentre in silico previsioni sono convenienti e fare identificare numerosi obiettivi miRNA validi, la maggior parte dei geni non prevede test di validazione sperimentale, e molti obiettivi reali non sono previsti. Inoltre, poiché gli algoritmi informatici sono basate su bersaglio precedentemente determinate, non consentono scoperta di bersagli che si discostano da ciò che è già noto.

Un certo numero di sistemi sperimentali sono stati utilizzati con successo per identificare o scoprire bersagli funzionali miRNA nelle cellule viventi. Questi metodi di screening globali includono microarray e sequenziamento RNA, RNA co-immunoprecipitazione (RIP), all'imballaggio e all'etichettatura isotopi stabili di aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC), un metodo proteomico (recensione in [7]). Ogni metodo ha vantaggi e svantaggi. Dal momento che miRNA di mira spesso destabilizza un mRNA e porta alla sua degradazione, perdita ogain r in livello di mRNA, dopo l'introduzione di un miRNA imitare o inibitore, rispettivamente, in grado di identificare bersagli miRNA. Questa perdita di guadagno o mRNA viene prontamente rilevata da microarray o sequenziamento profondo. Mentre i metodi di rilevazione di mRNA sono più semplici e più sensibili rispetto ai metodi di rilevazione delle proteine, rilevamento mRNA mancherà tutti gli obiettivi miRNA che non sono degradati. Recenti rapporti dal laboratorio Bartell confrontando i risultati bersaglio miRNA dal rilevamento RNA con quelli provenienti da SILAC [8] o profiling ribosoma [9] indicano che i microRNA di mammifero prevalentemente agiscono riducendo i livelli di mRNA bersaglio. Tuttavia, molti altri laboratori che lavorano con gli obiettivi di miRNA individuali hanno rilevato cambiamento di proteine, ma nessun cambiamento nel livello di mRNA. Rapporti di quelli che sembrano essere regolazione traduzionale senza perdita di mRNA rilevabile comprendono: miR-10b su HOXD10 [10], il miR221/222 p27Kip1 [11], miR-21 in Pdcd4 [12], miR-126 su p85β [13] , miR-34 in SIRT1 [14], miR-21 in PTEN [15], miR-302d su Arid4b [16], miR-200c su JAG1 [17], e miR-299, 297, 567, unond 609 sulla VEGFA [18]. Inoltre, Clancy et al [19] ha recentemente riferito che la regolamentazione traslazionale dal let-7 è stato rilevato solo quando i singoli isoforme di mRNA che contengono il sito di let-7 di destinazione sono stati rilevati in modo selettivo. Quest'ultimo suggerisce che, almeno in alcuni casi, regolazione traduzionale può essere trascurata in un profilo composito - cioè, quando tutte le isoforme di mRNA vengono rilevati come un mRNA - come ottenuta con microarray molti e analisi della sequenza. Co-immunoprecipitazione di complessi miRNA-mRNA tramite Argonaute (di solito Ago2) o un'altra proteina associata (RNA immunoprecipitazione, o RIP) isolerà obiettivi miRNA indipendentemente dal meccanismo di regolazione. Inoltre, rileva RIP endogena, e presumibilmente biologicamente rilevanti, interazioni. Tuttavia, non è noto se tutti i miRNA-mRNA interazioni sono funzionali, e RIP avrebbe perso tutti gli obiettivi di mRNA che associano solo transitoriamente o sono rapidamente degradato. Inoltre, specifici miRNA-mRNA partner deve essere dedotto bioinformatimente perché tutti i miRNA-mRNA coppie di co-precipitato insieme. Infine, SILAC identifica direttamente il prodotto finale della regolamentazione miRNA, la stessa proteina, ma è insensibile e manca quindi proteine ​​rare e piccole modifiche volte dei livelli di proteine.

Alla luce delle limitazioni con i metodi attuali miRNA bersaglio di identificazione, ci siamo sentiti un test aggiuntivo globale per identificare gli obiettivi miRNA funzionali da un meccanismo alternativo era necessario. Per soddisfare questa esigenza, abbiamo concesso in licenza una tecnologia inventata da Joop Gaken e Azim Mohamedali di King College di Londra. La loro invenzione è un doppio proteina di fusione di selezione, in particolare, una chinasi-timidina zeocin fusione, regolata da una libreria di cDNA di sequenze bersaglio potenziali miRNA nella sua 3'UTR. Cellule stabilmente trasfettate con esprimendo TKzeo-cDNA costrutti possono essere selezionati con zeocin, come illustrato in Figura 2. Dopo aver espresso uno miRNA di interesse, obiettivi che miRNA possono essere selezionati with ganciclovir, come illustrato in Fig. 3. Ganciclovir uccide le cellule che esprimono timidina chinasi, che è, le cellule che esprimono TKzeo-cDNA mancanza di un obiettivo per il miRNA di interesse. Mirato cDNA può essere isolato mediante amplificazione PCR di DNA da cellule che sopravvivono ganciclovir utilizzando primer che fiancheggiano i prodotti di cDNA, e PCR possono essere sequenziati per identificare bersagli.

Abbiamo sviluppato una tecnologia Collegio del Re in un nuovo strumento per l'identificazione globale e la scoperta di obiettivi funzionali miRNA umani - il Target Biblioteca MISSIONE ID. Con l'ID della libreria di destinazione, gli utenti possono isolare bersagli miRNA da una serie di transfezione mammiferi coltura cellulare e fasi di selezione di droga. La Biblioteca è completo, e contiene 66-79% dei geni umani. I primi risultati indicano che sia già scoperto così come nuovi obiettivi può essere isolato dalla libreria ID MISSIONE Target.

Sebbene il protocollo sia di una certa lunghezza,l'utilizzo della Libreria ID di destinazione richiede tecniche standard di laboratorio molecolari - colture cellulari di mammifero, trasfezione, la selezione dei farmaci, PCR, e il sequenziamento - e quindi, dovrebbe essere ampiamente nelle possibilità della maggior parte dei biologi. Suggeriamo che l'attenzione sufficiente attenzione alla corretta progettazione sperimentale, ottimizzando le condizioni di coltura, e, soprattutto, pre-test di ogni tipo di nuova cella per determinare i livelli di farmaco ottimali per fasi di selezione (kill-curve) per assicurare il successo con la Libreria ID Target.

Come con tutti i metodi di miRNA bersaglio di identificazione, è altamente raccomandato che gli obiettivi individuati dalla screening della Biblioteca ID di destinazione essere convalidato con un secondo metodo, come ad esempio microarray, qRT-PCR, test reporter (cioè, luciferasi), o analisi occidentale.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
JumpStart REDTaq Readymix	Sigma-Aldrich	P0982
Ganciclovir	Sigma-Aldrich	G2536
G418	Sigma-Aldrich	G8168
Puromicina	Sigma-Aldrich	P9620
Topo TA	Invitrogen	KNM4500-01
GenElute mammiferi Genomic DNA Kit Miniprep	Sigma-Aldrich	G1N10
Cella k Nucleofection specificoessa	Lonza
Nucleofector	Lonza	AAD-1001
Zeocin	Invitrogen	R250-01
Obiettivo ID Biblioteca	Sigma-Aldrich	MREH01