LentiPlex MISSIONE pool di screening Biblioteca shRNA in cellule di mammifero

Riepilogo

Qui usiamo una libreria umano LentiPlex raggruppati e tradizionali metodi di sequenziamento per identificare gli obiettivi gene promuovere la sopravvivenza delle cellule. Dimostriamo come impostare e deconvolute uno schermo LentiPlex e convalidare i risultati.

Abstract

RNA interference (RNAi) è un meccanismo intrinseco cellulare per la regolazione dell'espressione genica. Sfruttando la potenza innata di questo sistema ci permette di livelli di espressione genica knockdown la perdita di studi la funzione del gene.

Ci sono due metodi principali per l'esecuzione di RNAi. Il primo è l'uso di piccoli RNA interferenti (siRNA) che sono sintetizzati chimicamente, e il secondo utilizza breve hairpin RNA (shRNAs) codificato all'interno plasmidi ^1. Quest'ultimo può essere trasfettate in cellule direttamente o confezionato in replica particelle lentivirali incompetenti. I principali vantaggi dell'utilizzo di shRNAs lentivirali è la facilità di introduzione in una grande varietà di tipi di cellule, la loro capacità di integrarsi stabilmente nel genoma di knockdown lungo termine e la selezione genetica, e la loro efficacia nella conduzione di high-throughput perdita di schermi funzione. Per facilitare questo abbiamo creato il pool LentiPlex biblioteca shRNA.

Il MISLentiPlex SION umani shRNA Biblioteca pool è un genome-wide piscina lentivirale prodotto utilizzando un processo brevettato. La biblioteca è costituito da oltre 75.000 costrutti shRNA dalla collezione TRC targeting 15.000 geni umani ^2. Ogni libreria è testato per la rappresentanza shRNA prima del rilascio del prodotto per garantire una copertura robusta biblioteca. La biblioteca è fornita in un pronto per l'uso-lentivirale formato a titolazioni di almeno 5 x 10 ⁸ TU / ml tramite test p24 ed è già diviso in dieci subpools di circa 8.000 shRNA costruisce ciascuno. Primer di amplificazione e sequenziamento sono forniti anche per l'identificazione del bersaglio a valle.

Precedenti studi istituito una attività sinergica antitumorale di TRAIL in combinazione con Paclitaxel in cellule A549, un essere umano carcinoma polmonare a cellule linea ^{3, 4.} In questo studio dimostriamo l'applicazione di una biblioteca LentiPlex pool shRNA per condurre rapidamente una schermata di selezione positiva per i geni coinvolti nella citotossicità of A549 cellule quando esposte a TRAIL e Paclitaxel. Uno degli ostacoli spesso incontrato con high-throughput schermi è il costo e la difficoltà di deconvoluzione, abbiamo anche dettaglio un costo-efficace approccio policlonali che utilizza il sequenziamento tradizionali.

Protocollo

LentiPlex schermata di configurazione pool

Per identificare le sequenze shRNA di interesse, è fondamentale per impostare lo schermo in modo tale che la maggior parte delle cellule ricevono un solo shRNA costruire. Utilizzando un basso MOI (molteplicità di infezione), la probabilità di integrants multipli per cella è notevolmente diminuita. Tuttavia, l'efficienza di trasduzione, e per questo vuol MOIS, dipendono fortemente dal tipo di cellula bersaglio. Pertanto, è imperativo che la determinazione del MOI ottimale si effettua prima di iniziare lo schermo in un nuovo tipo di cellula.

1. Trasduzione delle cellule bersaglio con la LentiPlex Missione Pooled shRNA Biblioteca

1. L'attuale MOI utilizzati variano per diversi tipi di cellule. Se si replica desiderata, quindi il numero dei piatti deve essere aumentato di conseguenza. Inoltre, di solito non sarà vantaggioso per combinare i subpools diversi. Mantenere la subpools separato sarà di aiuto nel processo di deconvoluzione. Garantire proper l'etichettatura di ogni piatto di coltura con il numero di lotto secondario che viene applicato durante la trasduzione. Un basso MOI si consiglia di ridurre la probabilità di integrants multipli per cella.
2. Giorno 1 - Seed il numero appropriato di 60 mm, piatti a base di cellule sufficiente per ottenere circa il 70% confluenza il giorno successivo (10 piscine in totale, ciascuno eseguito in triplice copia = 30 piatti in totale). Per il nostro studio, 60 mm sono stati seminati i piatti con 6 x 105 cellule A549 per ottenere una confluenza del 70% prima di trasduzione. Questo assicura che le cellule sono ancora nella fase di crescita esponenziale. I tassi di crescita variano in base al tipo di cellula e deve essere determinato prima di iniziare lo schermo.
3. Consentono alle cellule di aderire incubando overnight a 37 ° C in un incubatore umidificato in una atmosfera di 5% CO _2.
4. (Facoltativo) Includere altri due di 60 mm piatti per la trasduzione con shRNAs controllo negativo. Etichetta i piatti "Controllo A" per SHC001H e "Controllo B" per SHC002H.
5. Giorno 2 - ° trasdurrele cellule e con le particelle LentiPlex virali. Il giorno della trasduzione, scongelare le particelle lentivirali sul ghiaccio.
6. Trasferire le particelle scongelati ad una cappa a flusso laminare e tenere sul ghiaccio, se non utilizzati immediatamente.
7. Calcolare la quantità di ogni singolo sub-virale piscina per aggiungere alle cellule per ottenere il MOI di 1 in tutti i piatti della cultura delle cellule.
   1. Esempio: 1 x 10 ⁶ cellule / piatto; titolo virale = 5 x 10 ⁸ TU / ml, un MOI desiderato di 1. i.) 1 x 10 ⁶ cellule / piatto x (MOI di 1) = 1 x 10 ⁶ unità di trasduzione (TU) necessari ii.) 1 x 10 ⁶ TU / (5,0 x 10 ⁸ TU / ml) ottenuto dalla C A 2 = microlitri di soluzione madre lentivirali deve essere aggiunto al piatto appropriato. Diluire l'importo calcolato del virus in 100-300 ml di mezzi di comunicazione completo in modo da garantire una migliore distribuzione del virus se aggiunto al piatto di coltura cellulare.
8. Rimuovere i supporti dal pre-seminato cellule. Aggiungi multimediale completo Contaesaminando la soluzione di bromuro di hexadimethrine per ogni piatto. La concentrazione finale che si raccomanda di bromuro hexadimethrine nei media è di 8 mg / ml. Utilizzare meno bromuro hexadimethrine se lo trovate ad essere tossico per le cellule bersaglio.
9. Aggiungi particelle shRNA lentivirali ai piatti appropriati secondo il prestabilito disegno sperimentale. Mescolare delicatamente i piatti per distribuire uniformemente il virus attraverso le cellule.
10. Incubare per 18-20 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato in un clima di 5% di CO _2.
11. (Facoltativo) Ripetere 3-8 al identico MOI con SHC001H (vuoto vettore shRNA di controllo) nel Piatto di controllo A e SHC002H (strapazzate shRNA di controllo) nel Piatto B. Controllo Trattare questi piatti in modo identico ai piatti sperimentale per tutto l'esperimento.
12. Giorno 3 - Modifica i media. Aspirare il virus contenente i media e aggiungere nuovi mezzi di comunicazione completo (senza bromuro hexadimethrine). Incubare le cellule a 37 ° C durante la notte.

2. Trattare placcatocellule con componente terapeutico / reagente

1. Giorno 4 - supporti Aspirare da pozzi e aggiungere mezzi freschi contenenti componente terapeutica alla concentrazione ottimale. Come nel caso di condizioni di coltura, i trattamenti e le concentrazioni variano corretta e la durata dovrebbe essere determinata in anticipo. Nel nostro studio, abbiamo utilizzato 100 ng / ml di TRAIL e 1 microM di Paclitaxel. Le cellule sono state trattate per 48 ore.
2. Cellule sopravvissute devono essere ri-seminate in fiasche T75 e ha permesso di espandersi fino a quasi il 100% confluenti.
3. (Opzionale) Al termine della selezione, ispezione e controllo Dish Un Piatto Piatto di controllo B. A e B Piatto dovrebbero avere un minor numero di colonie di almeno uno dei piatti biblioteca pool. Se ci sono un numero inaspettatamente alto di colonie in un piatto, rispetto al processo di trasduzione ha colpito un percorso legati al fenotipo desiderato o la pressione selettiva non è sufficientemente forte e ri-ottimizzazione del dosaggio può essere richiesto. Se B Piatto contiene troppi colonie, Allora espressione di shRNA e di impegno della via RNAi può avere un effetto sul fenotipo di interesse. Se questo è il caso di ripetere SHC001H, per garantire che l'effetto non è specifico per SHC002H.

3. Deconvoluzione da una popolazione di cellule policlonali

1. Raccolta la popolazione eterogenea di cellule di ogni pool secondario e isolare DNA genomico. Nel nostro studio, le cellule sono state lavate in PBS e brevemente trypsinized prima di DNA genomico è stato isolato utilizzando il GenElute mammiferi Genomic Miniprep kit e fornito protocollo (Sigma-Aldrich, G1N70). In alternativa, tutti gli altri kit di purificazione genomiche che sono attualmente disponibili sul mercato possono essere utilizzati per l'isolamento del DNA. E 'importante seguire le raccomandazioni del protocollo per l'importo iniziale di cellule in coltura.
2. Amplificazione degli obiettivi. La procedura di shRNA modello di recupero consente l'amplificazione del l'intero pool di inserti shRNA dalla popolazione cella selezionata, o il recupero delle persone fisichedue modelli shRNA da colonie che sono state raccolte individualmente e ampliato. Dopo l'amplificazione di inserti shRNA dal controllo e le cellule bersaglio selezionato, i prodotti PCR può essere sequenziato.
3. Questo passo di amplificazione è stato ottimizzato utilizzando Sigma Readymix, n. di catalogo P2893. Altri reagenti possono essere utilizzati per l'amplificazione, ma le condizioni in bicicletta e / o concentrazione di magnesio può essere necessario modificare per l'amplificazione di successo. Primer di amplificazione alla concentrazione mM 20 sono inclusi nel kit LentiPlex.
4. Impostare la reazione PCR come descritto nella Tabella 1. Aggiungere i componenti nell'ordine elencato. Gli importi descritti sono per una reazione di 50 microlitri. Per ulteriori reazioni, scala i componenti master mix dal numero desiderato di reazioni e comprendono il 10% eccedenza. La quantità di DNA consigliato è di 50-100 ng.
5. E 'fortemente raccomandato che per una reazione del modello è costituito dalla Vector missione umana shRNA controllo positivo diluito al approprIATE concentrazione. Amplificazione di successo con questo modello indica che i componenti PCR e le condizioni di ciclismo sono adeguate. NOTA: Per prevenire la contaminazione riporto di campioni sperimentali e reagenti, si suggerisce che il controllo positivo essere diluito in un luogo diverso da dove successive reazioni di PCR sono impostati.
6. Salvare il programma PCR elencati nella tabella 2 nel termociclatore.
7. Per ogni campione, combinare 3 microlitri di reazione PCR con 1 ml di colorante e elettroforesi accanto a 5 ml di DirectLoad ™ PCR 100 bp Low Ladder, numero di catalogo D3687 su un 1% gel per confermare la presenza di un amplicone 309 bp.
8. Subcloning ampliconi della PCR: prodotti di PCR sono stati clonati utilizzando il TOPO TOPO-TA kit di clonazione, seguendo il protocollo del produttore (Invitrogen, K4575-01). Il risultato è che un prodotto di PCR è contenuto in ciascun vettore.
9. 250 colonie batteriche individuali (contenenti ognuno un individuo amplicone PCR) sono stati isolati e cresceren in 2 ml di LB culture con 100 mg / ml di ampicillina. DNA plasmidico è stato poi estratto utilizzando il GenElute plasmidi Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, PLN70).
10. Purificato il DNA plasmide è stato digerito con EcoRI e elettroforesi per confermare la presenza dell'inserto.
11. Campioni di DNA plasmidico sono stati poi sequenziati e l'inserto shRNA identificati utilizzando la banca dati LentiPlex shRNA sequenza di ricerca fornita con la libreria LentiPlex.

4. Obiettivo Identificazione e validazione

1. La sequenza inizia con shRNA-GAAACACCGG 5'-3 '. Inserire almeno i prossimi 10 ma meno di 21 nucleotidi come la sequenza query nella casella di ricerca sul modulo allegato sequenza shRNA database di ricerca di accesso.
2. Selezionare le specie del shRNA pool. Facoltativamente, selezionare il pool secondario da cui è stata trovata la sequenza.
3. Ora clicca sul pulsante "Trova Hits potenzialità" per eseguire la ricerca. Questo dovrebbe individuare le corrispondenti sequenze shRNA TRC (s) che corrispondono °e la sequenza dei dati. Ulteriori informazioni sulla sequenza TRC shRNA (s) identificati e gli obiettivi gene corrispondente possono essere facilmente trovati a Sigma-Aldrich è il tuo Gene preferito: http://www.sigma.com/yfg
4. Geni bersaglio individuata dovrebbe essere convalidata ripetendo il test di screening originale con il clone originale TRC, più almeno due shRNAs aggiuntive che colpiscono lo stesso gene con un 1 a 1 shRNA formato bene. Colpisce vero visualizza lo stesso fenotipo nella maggior parte dei pozzi.

5. Rappresentante Risultati

Un esempio di un flusso di lavoro in pool LentiPlex schermo è illustrato dalla Figura 1. Cellule trasdotte che proliferano in presenza di TRAIL e Paclitaxel è stato permesso di espandersi fino fiaschi erano confluenti. Il DNA genomico è stato raccolto e sottoposto alle amplificazione PCR e la clonazione, come illustrato nella figura 1 A, prima di essere presentato per l'identificazione e shRNA sequenza come descritto nella Figure 1 c. 250 cloni sono stati sequenziati, di questi 25 erano rappresentate da più cloni ed i restanti 225 sono rappresentati da 1 solo clone e non sono stati perseguiti in questo momento.

Come mostrato nella Figura 2, tra cui diversi geni candidati TBX3, PPP2CA e AKT2 erano rappresentate da cloni diversi. Il T-box fattore di trascrizione, TBX3 apparso in un totale di quattro cloni ed è stato implicato nel tumore della migrazione ^5. Downregulation PPP2CA ha dimostrato di mantenere la crescita delle cellule LNCaP androgeno coltivate in condizioni carenti dal alleviare i androgeno-privazione indotta arresto del ciclo cellulare e prevenire l'apoptosi ^6. AKT2 è un RAC-beta serina / treonina chinasi-proteina e oncogene putativo dimostrato di giocare diversi ruoli nel cancro dello sviluppo ^{7, 8.}

* Concentrazione finale di Mg ^{2 +} in soluzione sarà 3 mm;1,5 mm contributo del Readymix Taq e 1,5 mm di soluzione di cloruro di magnesio.
Tabella 1. Lentiplex PCR Reazione Condizioni

Tabella 2. Lentiplex PCR di amplificazione del programma

Figura 1. (A) LentiPlex pool schermo, (B) del flusso di lavoro deconvoluzione policlonale, e (C) individuazione di obiettivi shRNA.

LentiPlex A. pool schermo. In primo luogo, le cellule di semi, quindi aggiungere subpools shRNA, (10 piscine in totale, ciascuno eseguito in triplice copia, per 30 piatti in totale). Quindi, trattare con componente terapeutico / reagente (nel nostro caso, TRAIL e Paclitaxel, rispettivamente). Poi, reseed cellule sopravvissute in fiaschi e permettere ad espandersi. Harvest popolazione eterogenea di cellule di ogni pool secondario e isolare DNA genomico.

Deconvoluzione B. policlonali. Eseguire la PCR per amplificare il DNA che contiene l'inserto shRNA. Il prodotto di PCR è uniforme nelle dimensioni, ma policlonali in sequenza in quanto il modello è stato anche gDNA policlonali. Prodotto di PCR è clonato in un vettore e poi trasformato in batteri competenti.

C. Identificazione di bersagli shRNA. Individuali sono colonie isolate e DNA plasmidico viene estratto. Ogni clone contiene il vettore di clonazione con un frammento particolare PCR. DNA plasmidico è digerito per confermare la presenza dell'inserto e sequenziato. L'inserto shRNA viene identificato con il shRNA LentiPlex database di sequenza di ricerca.

Figura 2. Può identificatoI geni didati. 25 geni candidati sono stati identificati che erano colpi multipli. 225 geni candidati aveva solo 1 colpo e non sono stati perseguiti. Vedere tabella di complemento 1 per la ripartizione dei cloni individuali per gene candidato.

Supplementare Tabella 1. Individuale TRC cloni Biblioteca identificato da ID policlonali Gene Sequencing Hits cloni rilevato.

Discussione

In questo studio, presentiamo un genoma a livello di schermo per identificare i geni coinvolti nella citotossicità delle cellule A549 seguenti paclitaxel / TRAIL trattamento. L'uso di un approccio raggruppati in una genome-wide a schermo riduce il tempo, costi e investimenti in attrezzature normalmente associati ai tradizionali schermi disposti. Fondamentale per il successo dello schermo ci sono esperimenti di ottimizzazione eseguiti in anticipo. Condizioni di trasduzione e MOI devono essere empiricamente determinato.

Il metodo di selezione dovrebbe permettere una selezione solida di cellule visualizzazione del fenotipo desiderato (ad esempio, la sopravvivenza, l'espressione della proteina di superficie, ecc.) Ottimizzazione di questi parametri ridurrà il numero di falsi positivi rilevati.

Qui, gDNA è stato raccolto dalla maggior parte della popolazione di cellule selezionate e poi TOPO clonato per identificare inserti shRNA individuali. Un possibile miglioramento per questo esperimento sarebbe stato quello di selezionare per le cellule vive usando FACS per assicurareche solo le cellule vive sono raccolti. Gli obiettivi individuati saranno convalidati da trasduzione con mirate ad un shRNAs in un test di screening. Colpisce vero mostrerà il fenotipo nella maggior parte dei pozzi.

La Biblioteca LentiPlex pool è flessibile nella sua applicazione. È compatibile con una vasta gamma di applicazioni a valle e può essere utilizzato con le strategie di selezione sia positiva che negativa. A seconda delle condizioni di screening, deconvoluzione degli inserti shRNA avviene tramite PCR / clonazione, microarray, o sequenziamento di prossima generazione ^{9, 10.} Mentre la potenza e la velocità di queste tecniche per deconvolute schermi RNAi è ben definito, una preoccupazione con microarray e metodi di sequenziamento di nuova generazione è la disponibilità di risorse bioinformatica e le conoscenze necessarie per analizzare e interpretare correttamente i risultati sperimentali. I costi associati a queste tecniche possono essere spesso un ostacolo per l'impresa di schermi genoma di larghezza. APCR / clonazione approccio, anche se non potente come microarray e sequenziamento di prossima generazione è un'alternativa conveniente e più bassi.

Agilent offre ora una gamma personalizzata basata sulla libreria TRC shRNA di ulteriori aiuti nelle schermate LentiPlex. Queste opzioni consentono ai ricercatori di utilizzare LentiPlex per studiare una vasta gamma di funzioni cellulari.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
LentiPlex Array pool	Sigma-Aldrich	SHPH01
Le cellule A549	ATCC	CCL-185
TRAIL	Sigma-Aldrich	oductDetail.do? lang = it & N4 = T5694% 7CSIGMA & N5 =% SEARCH_CONCAT_PNO 7CBRAND_KEY & F SPEC = "> T5694
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T7402
Topo TA Cloning Kit	Invitrogen	K4575-01
JumpStart Taq Readymix	Sigma-Aldrich	ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY & F SPEC = "> P2893
GenElute kit Miniprep plasmidi	Sigma-Aldrich	PLN70
EcoR1	New England Biolabs	R0101
hexadimethrine bromuro	Sigma-Aldrich	H9268