Le attività di imaging Odore-Evocati nel bulbo olfattivo del mouse utilizzando riflettanza ottica e segnali autofluorescenza

Riepilogo

Questo articolo presenta i protocolli di intrinseca segnali ottici e flavoproteine ​​autofluorescenza di imaging per mappare segnali odori evocati attività sulla superficie del bulbo olfattivo nel topo.

Abstract

Nel cervello, la stimolazione sensoriale attiva distribuite popolazioni di neuroni tra i moduli funzionali che partecipano alla codifica dello stimolo. Funzionali tecniche di imaging ottico sono vantaggiose per visualizzare l'attivazione di questi moduli in cortecce sensoriali ad alta risoluzione spaziale. In questo contesto, endogene segnali ottici che derivano da meccanismi molecolari legati alla neuroenergetics sono fonti preziose di contrasto per registrare le mappe spaziali degli stimoli sensoriali sui campi largo nel cervello dei roditori.

Qui vi presentiamo due tecniche in base alle modifiche del endogena proprietà ottiche del tessuto cerebrale durante l'attivazione. In primo luogo i segnali intrinseci ottico (IOS) sono prodotte da una alterazione locale di riflessione della luce rossa a causa di: (i) l'assorbimento da cambiamenti nel livello di ossigenazione del sangue e del volume del sangue (ii) scattering fotone. L'uso di IOS in vivo per registrare le mappe spaziali iniziato a metà degli anni 1980 con la observatiin ottica di mappe di barili baffi nel ratto e le colonne orientamento nel gatto corteccia visiva ^1. Immagini IOS della superficie del bulbo olfattivo principale roditori (OB) in risposta alla odori fu poi dimostrato dal gruppo di Larry Katz ^2. Il secondo approccio si basa su segnali di autofluorescenza flavoproteina (FAS) a causa di cambiamenti nello stato redox di questi intermedi del metabolismo mitocondriale. Più precisamente, la tecnica si basa sulla fluorescenza verde a causa dello stato ossidato di flavoproteine ​​quando il tessuto è eccitata con luce blu. Anche se questi segnali erano probabilmente tra le prime molecole fluorescenti registrato per lo studio dell'attività cerebrale dagli studi pioniere della probabilità Britton e colleghi ^3, non è stato fino a poco tempo che sono stati utilizzati per la mappatura di attivazione cerebrale in vivo. FAS di imaging per la prima volta applicato alla corteccia somatosensoriale nei roditori in risposta alla stimolazione hindpaw dal gruppo Katsuei Shibuki ^4.

Il sistema olfattivo è di fondamentale importanza per la sopravvivenza della stragrande maggioranza delle specie viventi perché permette di rilevazione efficiente e l'identificazione delle sostanze chimiche nell'ambiente (cibo, predatori). L'OB è il primo relè di elaborazione delle informazioni olfattivo nel cervello. Riceve proiezioni afferenti dai neuroni olfattivi sensoriali primarie che consentono di rilevare le molecole odoranti volatili. Ogni neurone sensoriale esprime un solo tipo di recettore olfattivo e dei neuroni che trasportano lo stesso tipo di recettore inviano i loro processi nervosi allo stesso ben definito microregioni di ~ 100μm ³ costituito da neuropilo discreto, il glomerulo olfattivo (Fig. 1). Negli ultimi dieci anni, IOS di imaging ha favorito l'esplorazione funzionale del OB ^{5, 6, 7,} che è diventato una delle strutture più studiati sensoriale. La mappatura delle attività di OB con FAS di imaging non è stata ancora eseguita.

Qui, we mostrano i passi successivi di un protocollo efficace per IOS e FAS di imaging per mappare odori evocati attività nel OB mouse.

Protocollo

1. Preparare l'animale per l'imaging (in conformità alle raccomandazioni europee per la cura e l'uso di animali da laboratorio, direttiva 86/609/CEE)

1. 6 a 8 settimane vecchia C57BL6 topi maschi sono anestetizzati con un cocktail di ketamina (10mg/kg) e xilazina (100mg/kg) iniettato intraperitonealy. Chirurgia inizia quando il mouse non risponde più alle hindpaw pizzico. Durante l'esperimento tutto l'animale è collocato su una piastra elettrica. La temperatura corporea viene continuamente monitorata e mantenuta a 37 ° C. Profondità dell'anestesia è mantenuta per tutta la chirurgia e la sessione di imaging, consulta l'assenza di arto ritirarsi. Una iniezione sottocutanea di 20% del cocktail iniziale anestetico somministrato in caso contrario.
2. Utilizzando Clippers, togliere i capelli dal cuoio capelluto. Pulire la pelle esposta dai capelli residui utilizzando una garza sterile imbevuta con soluzione fisiologica.
3. Posizionare il mouse nel frame stereotassico. Il muso deve essere sullo stesso piano, come la parte posteriore della testa,al fine di impostare la superficie del bulbo olfattivo rispetto al piano orizzontale. Fissare saldamente l'orecchio e naso bar al fine di evitare movimenti durante l'imaging.
4. Applicare una pomata oftalmica sugli occhi dell'animale per evitare l'essiccazione e il dolore.
5. Disinfettare tutti gli strumenti chirurgici con 70 etanolo ° e la zona del cuoio capelluto con spazza successivi di Betadine.
6. Per rimuovere la pelle che ricopre il cranio, inizia facendo un'incisione nella pelle con le forbici nella parte posteriore della testa tra le orecchie. Poi tagliate in entrambi i lati verso la base dell'orecchio e in direzione antero-posteriore verso la fronte lungo le palpebre. Completare la rimozione del cuoio capelluto, tagliando la pelle sulla parte superiore del muso vicino al bar naso.
7. Sotto osservazione binoculare, utilizzare un tampone di cotone imbevuto con soluzione salina per staccare delicatamente il periostio sulla parte superiore del cranio. Usare un paio di pinze per rimuovere il tessuto residuo e grattare la superficie del cranio con un bisturi ad avere una preparazione pulita.
8. L'OB è una struttura simmetrica composta da due hemibulbs che si trovano tra le palpebre. Essi sono limitati nel rostrale e nella direzione caudale di un seno venoso, e separato dalla sutura sagittale. Posizionare un pezzo di spugna di gelatina assorbibile imbevuto di acqua distillata con l'osso al di sopra della OB. E 'importante mantenere questa zona dell'osso umida tutto l'esperimento.

2. Preparazione della finestra del cranio

1. Rimuovere la spugna di gelatina e iniziare a raschiare delicatamente l'osso con n ° 10 bisturi. Mantenere un angolo costante di 45 ° tra la lama e l'osso, e spostare la lama dalle palpebre al lato sagittale della zona dei tulipani. Non applicare una pressione verticale sull'osso o graffiare l'osso al di sopra del seno venoso.
2. Durante il processo di assottigliamento, fermano ogni 5 minuti e posto una spugna di gelatina idratata con l'osso per raffreddare la preparazione. Tampone del cranio con la spugna per rimuovere la polvere ossea.
3. Tenere spazzamento eraffreddamento in alternativa fino a visualizzare il trabecole, lo strato di osso spugnoso. La vascolarizzazione fine della OB deve essere visibile in questa fase. Smettere di graffiare l'osso, e iniziare a usare il bisturi di punta perpendicolarmente a "disegnare" un'area rettangolare che racchiude la OB. In questa fase n ° 11 bisturi può essere utilizzato. Mantenere l'intervento entro i limiti dei seni venosi che dovrebbe essere sicuro di ictus bisturi.
4. Scavare la trincea formata a poco a poco rettangolare con movimenti successivi del bisturi. Pulire la punta del bisturi periodicamente per pulirla e mantenerla forte. Prestare estrema attenzione la profondità della punta per evitare di toccare la superficie dura.
5. Per avere un'idea dello spessore dell'osso residuo, spingerlo delicatamente con la punta di un paio di pinze. Se le pieghe lembo osseo sotto pressione, passare alla fase successiva.
6. Sotto una goccia di soluzione salina, utilizzare la punta del bisturi orientata orizzontalmente per sollevare il lembo osseo. La rimozione del lembo deve essere fatto carefully per evitare di strappare fuori l'osso residuo.
7. Una volta che la superficie della OB è esposto, per verificare l'assenza di sanguinamento o di anastomosi vasi sanguigni. Ferendo la durata o la superficie del tessuto ridurrà la possibilità di ottenere segnali ottici. Pulire l'area con una spugna di gelatina imbevute di soluzione salina in modo da mantenere umido il bulbo.
8. Applicare poliacrilato cemento dentale per formare un pozzo con l'osso intorno alla finestra.
9. Mettere una goccia di agarosio a basso punto di fusione (1,2%) rispetto al Dura, e mettere un bicchiere sterile coprire le dimensioni della finestra. Durante la sessione di imaging, una piccola quantità di agarosio possono essere aggiunti al fine di compensare l'essiccazione. Agarosio impedirà l'OB di muoversi con la respirazione e fornirà una superficie piana per l'imaging ottico.

3. L'imaging ottico di configurazione per la mappatura attività olfattiva

1. La stimolazione olfattiva deve essere definita con precisione nel tempo e l'intensità con l'uso di un olfattometro. Noi usiamo una versione personalizzata modificata del sistema di perfusione multivial Valvebank 8II da automatizzare scientifico associato ad una base compressore d'aria (aria compressa respirabile sarebbe adatta pure). Questo sistema consente una accurata e veloce controllo della valvola esterna. Le soluzioni di odorizzante puri sono diluiti in olio minerale alla concentrazione scelto. Per attivare le aldeidi dorsale OB come esanale sono comunemente usati. Un volume preciso di odorizzante diluito (20 a 50μl) viene caricato su una carta da filtro e posto in un serbatoio siringa. Attraverso il sistema di perfusione, l'aria a pressione controllata viene consegnato al sistema, garantendo una velocità costante di consegna odorizzato flusso d'aria al naso degli animali durante l'apertura della valvola. Odorizzante viene fornito attraverso un tubo Tygon R-3603 vuoto (Saint-Gobain Corporation) che trasportano l'aria ad un flusso di ~ 1000ml/min. Evitare la contaminazione tra odoranti e quantità residue di odorizzante nel tubo. Se disponibile, la riproducibilità dello stimolo odorizzante può essere Controriempito attraverso l'utilizzo di un rilevatore a ionizzazione di fiamma (microFID Photovac 2020).
2. La configurazione ottica è acceso. Si tratta di una raffreddata interlacciata 12 bit CCD (ORCA Hamamatsu AG) associato ad un stereomicroscopio a fluorescenza (Leica MZ16), un olfattometro controllato dal computer e le lampade eccitazione stabilizzata con opportuni filtri passa-banda interferenze. Uno schema che descrive la nostra impostazione è fornito in figura 2. Per intrinseca segnali ottici Imaging (IOSI), una lampada alogena da 200W tungsteno (Oriel QTH) accoppiato con un leggero anello in fibra (Schott) inserito intorno all'obiettivo del microscopio sono utilizzati per fornire un'illuminazione stabile e uniforme. Per flavoproteina autofluorescenza Segnali Imaging (FASI), una lampada a ioduri metallici da 150W (Leica) con un 5 millimetri guida luce liquida core forniscono anche l'eccitazione della fluorescenza localizzata attraverso l'epi-illuminazione porta dello stereomicroscopio.

   Acquisizione delle immagini e la sincronizzazione hardware sono realizzati da software personalizzato. L'open source Micromanager software può essere utilizzato anche per controllare la configurazione ottica e l'acquisizione.

4. Imaging ottico

1. Collocare il telaio stereotassico con lo stereomicroscopio, la finestra del cranio centrato nel campo visivo (vedi fig. 2A per uno schema del setup ottico).
2. Tune il microscopio per concentrarsi sui capillari. Prima di prove di stimolazione (vedi descrizione in 5) l'immagine della lampadina è adottata ai sensi 560nm (verde) luce (anello in fibra), che fornisce un buon contrasto per l'imaging dei vasi sanguigni. Questa immagine è usata come controllo anatomico per verificare lo stato della preparazione e viene acquisita più volte durante l'esperimento.
3. IOS per l'imaging, l'intensità della luce riflessa viene registrata dalla telecamera CCD con 630 + / -10 nm (rosso) illuminazione. Le immagini sono acquisite al full frame (senza binning) a 5 fotogrammi al secondo, che corrispondono ad un tempo di esposizione di circa 150ms. Potenza della sorgente luminosa deve essere regolata di nuovo gni livelli di grigio di almeno ~ 3000 sull'area OB, vicino alla saturazione dei pixel del CCD pozzi. In questo modo permette di sfruttare le dinamiche 12bits del CCD per catturare i cambiamenti di intensità debole durante l'attivazione. Massimo IOS raggiungere ampiezze ~ 1%.
4. FAS per imaging di fluorescenza è acquisito in virtù di eccitazione di 480nm + /-20 nm (blu) luce epiflurorescence. Un filtro passa-alto a 515 Nm è impostato per catturare la luce. Le immagini sono acquisite a 5 fotogrammi al secondo con un binning di 4 per 4 per massimizzare la sensibilità. Luce potenza di eccitazione viene regolata in modo simile a IOS con livelli di grigio di 3000 sull'area OB. Massime ampiezze FAS raggiungere ~ 3%.

   Per entrambe le modalità di imaging, la profondità di campo nel piano soggetto è lo stesso ed è stata misurata a 0,5 mm per un ingrandimento di circa 4 volte.

5. La luce deve essere spenta tra le prove di imaging per evitare il riscaldamento e photobleaching della preparazione.

le "> 5. Imaging prove

1. Sessione di imaging standard incluso una base di 5 a 10 secondi in cui viene consegnata solo aria, seguita dalla stimolazione odore per 3 a 10s a seconda della concentrazione di odore scelto, e 70 a 82s sono ulteriormente registrati con un flusso d'aria costante per il recupero di base (Fig. 2A). Al termine della prova, la luce si spegne e l'aria pura viene consegnato per la durata tra l'intervallo di prova (da 1 a 3 minuti) per lavare le molecole degli odori residui ed evitare assuefazione sensoriale. Prove degli odori sono alternate a prove vuoto (portata d'aria).
2. Odori evocati zone attivate sono visualizzati come aree grosso modo sferica sulle mappe e corrispondono alle dimensioni dei singoli glomeruli (80 per 200μm di diametro ^9). L'elaborazione delle immagini è spiegato in figura 2B. Mappe olfattive sono presentati in Figura 3. Contrariamente a qualsiasi altro sistema sensoriale, il rapporto segnale-rumore in OB è stato sufficiente a risolvere odori evocati risposte in studi singoli (Fig. 3B per IOS e fig. 3D per FAS).
3. I topi sono eutanasia immediatamente al termine della sessione di imaging con metodi in accordo alle raccomandazioni europee per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

6. Risultati rappresentante (vedi mappe olfattive in figura 3):

Figura 1 L'organizzazione strutturale del bulbo olfattivo principale nei roditori. Neuroni sensoriali olfattivi, le cellule sensoriali primarie trova nell'epitelio olfattivo principale, esprimono lo stesso recettore olfattivo e convergono sullo stesso glomeruli nel OB. Glomeruli olfattivi, la forma circolare neuropils (cerchi tratteggiata), si trovano sulla superficie della OB. Si noti che una rete molto fitta e complessa vascolare è presente a livello glomerulare. Abbreviazioni (top / down): ONL: strato nervo olfattivo; GL: strato glomerulare, EPL: strato esterno plessiforme; MCL:cellula mitrale strato; GCL: strato di cellule dei granuli.

Figura 2 Riflettanza e segnali di fluorescenza di registrazione in vivo. A. grandangolari configurazione imaging ottico. Il cervello di un topo anestetizzato è esposto a uno rosso (IOS) o blu (FAS), sia la luce attraverso un anello in fibra anulare attaccato alla lente ottica o un epi-illuminazione porta di un microscopio. Gli odori vengono caricati in fiale sigillate e odorizzato aria è consegnato al naso animale (verde chiaro: aprire la valvola). B. Registrazione di protocollo e l'elaborazione dei dati. IOS e FAS vengono registrati come serie di prove individuali (anni 90 di durata). Il grafico mostra la linea temporale di un singolo trial: linea di base varia da 5 a 10 s, la stimolazione da 3 a 10 s, e ritornano ai valori basali da 70 a 82s. Elaborazione di immagini richiede pixel per pixel sottrazione di valori di intensità durante la linea di base di valori di intensità durante i periodi di stimolazione (per il FAS) or stimolazione più ritornano ai valori basali (per IOS). Questa differenza viene poi divisa per valori di base per ottenere una variazione% (vedi immagini risultanti in fig. 3).

Figura 3 Odor-evocata mappe attività nel OB con IOS e FAS imaging. A. vascolarizzazione della dorsale OB visualizzati sotto la luce verde. AC. IOS ripreso (prova unica o tre prove rispettivamente in media) per una presentazione 10s del 20% esanale. Frecce bianche indicano le regioni sferiche di interesse attivati ​​da questo odore. Queste mappe di attivazione sono stati ottenuti utilizzando le cornici media durante il primo secondo dopo la fine della stimolazione odore (massimo di variazione riflettanza -0,63% a -0,52% A e in B). Nota le zone nere dell'assorbanza in cui attivazione odore si è verificato. CD. FAS ha acquisito in modo sequenziale nel topo lo stesso per l'odorizzante stesso (prova unica o tre prove media rispettivaly). Queste mappe di attivazione sono stati ottenuti utilizzando le cornici media durante il primo secondo dopo l'inizio della stimolazione odore (massimo di fluorescenza variazione 0,72% in D e 0,66% di E). Si noti che le zone bianche di emissione autofluorescenza indicato da frecce nere corrispondono alle zone in nero IOS. L'aspetto granuloso visto nella mappa FAS è dovuto alle 4 di 4 binning necessari per il miglioramento della sensibilità. Immagini FAS non sono stati corretti da autofluorescenza sbiancamento. Dimensioni effettive delle immagini ESSERE: 0,7 mm di larghezza x 1,2 mm di lunghezza.

Discussione

In questo articolo presentiamo IOS e FAS per le tecniche di imaging nelle registrazioni in vivo di odori evocati attività nel OB mouse. Per raggiungere questo obiettivo relativamente semplice ed economico a grande campo di impostazione imaging ottico è necessario. L'acquisizione dei dati di imaging richiede una formazione di eseguire le procedure chirurgiche multa ed evitare qualsiasi danno alla dura madre o tessuto cerebrale. In particolare, le emorragie maggiori in grado di assorbire fotoni registrato per l'imaging e alla fine dell'esperimento.

Uno dei vantaggi di IOS e FAS di imaging è quello di evitare l'iniezione di traccianti fluorescenti che potrebbero causare tossicità cellulare o effetti collaterali indesiderati. Essi permettono di affrontare le questioni sulle mappe olfattive così codifica spaziale di stimoli sensoriali. Contrariamente a 2-desossiglucosio imaging, che forniscono la possibilità di odori immagini diverse in un singolo animale. Tuttavia, poiché la penetrazione PM è limitata nel tessuto, IOS e FAS sono limitati alla parte dorsale del OBe non possono essere registrate dalle regioni ventrale.

Endogena di imaging segnale ottico offre un eccellente risoluzione spaziale per imaging in vivo. Tecnico calcoli riguardare il miglioramento quantitativo dei componenti vascolari nella riflettanza segnali ^8,9 così come dinamica di ossigenazione del sangue e del volume durante l'attivazione sensoriale ^10. Lunghezza d'onda multipla di immagini di IOS approcci di imaging sono attualmente sviluppate nel nostro laboratorio per quantificare completamente concentrazione totale di emoglobina e l'ossigenazione nel OB durante l'attivazione sensoriale. Queste misurazioni spettroscopiche ottiche aggiunto al FAS immagini daranno la possibilità di rispondere il rapporto irrisolto tra la dinamica vascolare e intracellulari durante l'attivazione sensoriale ^11,12.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome di The Regent	Azienda	Numero di catalogo
Imalgene	Merial
Rompun	Bayer
Agarosio, tipo III-A	Sigma-Aldrich	A9793-50G
Esanale 98%	Aldrich	115606-100ML