Una tecnica semplificata per produrre un modello di lesione ischemica

Riepilogo

Abbiamo sviluppato una tecnica minimamente invasiva per creare un modello di lesione ischemica coniglio orecchio dividendo l'arteria centrale, nervi e il fascio neurovascolare cranica. Un tunnel sottocutaneo quindi taglia tutti i tessuti sottocutanei. Questa procedura provoca un'interruzione minima pelle e può essere tranquillamente utilizzato in animali diabetici.

Abstract

Uno dei principali ostacoli nel corso della ricerca ferita diabetica è la mancanza di un modello di ferita ischemica che può essere tranquillamente utilizzato in animali diabetici. I farmaci che funzionano bene in non-ischemici ferite potrebbero non funzionare in ulcere diabetiche umani perché vasculopatia è uno dei principali fattori che ostacolano la guarigione di queste ferite. Abbiamo pubblicato un articolo nel 2007 che descrive un orecchio ischemico coniglio modello ferita creata da una tecnica chirurgica minimamente invasiva. Da allora, abbiamo ulteriormente semplificato la procedura per facilitare le operazioni. Su un orecchio, tre piccole incisioni cutanee sono state fatte sui peduncoli vascolari, 1-2 cm dalla base dell'orecchio. L'arteria centrale è stato ligato e tagliato lungo il nervo. Il bundle intera cranica è stato tagliato e legato, lasciando solo il ramo caudale intatto. Un tunnel sottocutaneo circonferenziale è stata fatta attraverso le incisioni, per tagliare i tessuti sottocutanei, i muscoli, nervi e piccoli vasi. L'altro orecchio è stato usato come controllo non-ischemica. Quattro le ferite sono state fatte sul lato ventrale of ogni orecchio. Questa tecnica produce 4 ferite ischemici e non ischemici 4 ferite in un animale per confronti a coppie. Dopo l'intervento chirurgico, l'orecchio ischemica era fredda e cianotica, e ha mostrato il movimento ridotto e una mancanza di polso dell'arteria orecchio. Temperatura della pelle dell'orecchio ischemica era 1-10 ° C inferiore a quello sull'orecchio normale e questa differenza è stata mantenuta per più di un mese. Auricolari dei tessuti ad alta energia contenuti di fosfato sono stati inferiori nell'orecchio ischemico che l'orecchio di controllo. Volte cicatrizzazione di ferite sono più nell'orecchio ischemica rispetto al non-ischemica orecchio quando lo stesso trattamento è stato usato. La tecnica è stato utilizzato su più di 80 conigli in cui 23 erano diabetici (diabete di tempo che va da 2 settimane a 2 anni). Nessun coniglio singolo ha sviluppato tutte le complicazioni chirurgiche, quali emorragie, infezioni, o rottura nelle incisioni cutanee. Il modello ha molti vantaggi, come la distruzione po 'di pelle, più tempo ischemico, e il tasso di successo superiore, rispetto a molti altri modelli. E 'can essere tranquillamente utilizzato in animali con ridotta resistenza, e può anche essere modificato per soddisfare i requisiti di test diversi.

Protocollo

1. Base anatomica

L'orecchio di coniglio è stato un materiale di studio privilegiato per la cura delle ferite fin dai primi anni del 20 ^° secolo. L'orecchio è alimentato da tre fasci vascolari (centrale, craniale e caudale), il pacchetto centrale è la più grande, mentre le navi nei fasci craniali e caudali sono di dimensioni variabili. Occasionalmente, l'arteria caudale può essere assente. ¹ Tutti questi recipienti sono facilmente identificabili dal lato dorsale dopo l'orecchio viene rasato (Fig. 1). Sul lato ventrale, la pelle distale non riceve apporto di sangue dai vasi prossimali. I tre fasci vaso sull'orecchio dorsale hanno numerosi rami che penetrano attraverso la cartilagine di fornire apporto di sangue alla pelle distale ventrale (Fig. 2). In alcuni conigli, un vaso molto piccolo sottocutanea verifica anche sul lato ventrale, che fornisce il sangue a non più di 1/3 della pelle ventrale. In una incisione cutanea circonferenziale aperta, vi è Essenzialmente nessun sanguinamento da una incisione ventrale.

2. Procedura chirurgica

1. Il coniglio viene pesato e le orecchie sono rasate, insieme con la parte posteriore del collo.
2. Una premedicazione di Buprenorfina (0,01 mg / kg) è dato IM un'ora prima dell'intervento.
3. L'anestesia è indotta da una miscela di ketamina (50 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) IM.
4. Il coniglio è protetta da una piastra elettrica durante l'intervento, gli occhi sono protetti con unguento, e dei suoi segni vitali sono monitorate durante l'intervento chirurgico.
5. Il campo chirurgico viene preparata in condizioni asettiche con uno scrub chirurgico e avvolto in modo che le due orecchie sono esposti.
6. Un orecchio è reso ischemico, mentre l'altro orecchio serve come coppia non-ischemica di controllo.
7. I tre peduncoli vascolari sono identificati con le arterie e le vene.
8. Utilizzando una lama # 15, tre piccole incisioni verticali (1-1,5 cm) sono realizzati sulle peduncoli vascolari, circa 1-2 cm dalla base dell'orecchio.
9. La vena centrale èisolato dai tessuti circostanti e una sutura viene utilizzata per circondare per retrazione. L'arteria centrale è legato con punti di sutura 4-0 e divisa.
10. Il nervo di accompagnamento centrale è anche tagliare.
11. Il peduncolo intero cranica è legata e sezionata.
12. Il peduncolo caudale è conservato.
13. Un tunnel sottocutaneo è fatto attraverso i 3 incisioni. Ciò avviene per via smussa con un morsetto e dissezioni taglienti con un coltello e forbici. Tutti i tessuti sottocutanei, i muscoli, nervi, e piccoli rami vascolari sono sospesi. Le piccole vasculatures sotto il derma sono completamente divisa. Tutti i tessuti sottocutanei vengono tagliati a livello della cartilagine con la lama.
14. Dissezioni ulteriore, forte e schietto vengono utilizzati per pulire la base, lasciando una cartilagine nuda su 5-10 mm di larghezza.
15. Questa procedura interrompe tutti i rami vascolari sottocutanee per impedire loro di stabilire rapidamente collaterali.
16. Il sanguinamento èminima. Se c'è, è facilmente controllato dalla compressione garza, senza la necessità di elettrocauterizzazione.
17. La pelle all'interno dell'orecchio non porta di alimentazione molto sangue e quindi non è incisa.
18. I 3 incisioni cutanee sono chiusi con suture 4-0 o 5-0, e coperto con una garza sterile.
19. I risultati della procedura in 3 piccole incisioni cutanee e sostiene i danni della pelle molto meno di un intervento chirurgico.
20. Quattro circolari a tutto spessore ferite della pelle vengono creati sul lato ventrale di ciascun orecchio con un 6 mm in acciaio inox punch. La distanza tra le ferite è almeno 20-30 mm. La pelle all'interno della ferita punzone viene rimosso dalla cartilagine. Il pericondrio è anche rimosso, con la pelle o separatamente. La base su cui la granulazione e la epitelizzazione avvengono è la cartilagine, ma la cartilagine non è perforato (Fig. 3).
21. Quando le ferite su entrambe le orecchie sono completate, farmaco test viene applicato su un lato dei due ferite mentre il farmaco di controllo è applied per le ferite sull'altro lato. Un bendaggio occlusivo (Tegaderm, 3M) viene utilizzato per coprire la ferita. Ciò impedisce le ferite di diventare essiccato.
22. Le ferite alla porzione di fondo dell'orecchio normalmente guarire più velocemente delle ferite nella parte superiore dell'orecchio. Per studio comparativo guarigione della ferita, si raccomanda di confrontare le due ferite da un lato con le due ferite sull'altro lato, o per confrontare la parte superiore e inferiore ferite separatamente.

3. Cura postoperatoria

1. Una patch Duragesic è attaccato alla pelle torna a rilasciare Fentanyl (25 mcg / ora) per 2-3 giorni per ridurre il dolore possibile.
2. I conigli sono libero accesso al cibo e bevande.
3. Cambi di medicazione vengono effettuate tutti i giorni. Le medicazioni vecchi vengono rimossi e le ferite vengono puliti con tamponi di cotone sterili. Le foto digitali sono prese per il confronto. Le nuove medicazioni vengono applicate, e le ferite sono coperti ancora da Tegaderm. No anestetico è necessario durante la medicazione changes.
4. La temperatura cutanea è misurata ogni giorno su ogni orecchio per il confronto.
5. Ulteriori circolazione sanguigna orecchio può essere misurata con un misuratore di tensione di ossigeno transcutaneo o un flussimetro laser Doppler.
6. Le suture possono essere rimosse dopo una settimana.
7. Per animali non diabetici, la maggior parte delle ferite auricolari solitamente guariscono in 2-3 settimane.

4. Potenziali complicazioni e come evitarli

Questa chirurgia mini-invasiva è sicuro e le complicanze sono rare. Fatta eccezione per un periodo transitorio di edema postoperatorio orecchio delicato, nessuno dei nostri conigli ha avuto gravi complicazioni chirurgiche. Tuttavia, ci sono diversi potenziali complicazioni per questa procedura:

1. Bleeding. Il sanguinamento si può verificare nelle incisioni se emostasi è incompleta o se un vaso sanguigno grande (come uno dei vasi principali peduncolari) è danneggiato. Questo è facilmente evitato con un'attenta dissezione. Oltre ai tre fasci principali vascolare, ci unri molti rami minori sottocutaneo vascolari. Quando il tunnel sottocutaneo è fatto, questi vasi sono stati tagliati, ma non principale è necessario. Emostasi può essere ottenuto semplicemente premendo garza. Questo è fatto facilmente inserendo un angolo di garza nel tunnel per alcuni minuti. Prima di chiudere l'incisione, assicurarsi che nessun sanguinamento attivo è presente.
2. Incisione infezione e deiscenza: Queste complicazioni possono verificarsi se le incisioni sono contaminati. Ciò può essere evitato l'uso di rigorosi tecnica asettica e nessun antibiotico è necessaria. Tuttavia, se l'infezione si verifica, il drenaggio adeguato e cambi di medicazione sono necessari.
3. Ear edema: a causa di legature vascolari e la perturbazione della circolazione linfatica, edema dell'orecchio lieve possono presentare per alcuni giorni. Tuttavia, scompare per sé e non è necessario il trattamento.

5. Risultati rappresentativi

Dal 2007, abbiamo utilizzato questa procedura in più di 70 conigli, tra cui 23 diabetici unoimals. Nel gruppo diabetico, l'intervento chirurgico è stato eseguito in tempi diversi diabetici: sette conigli avuto due settimane di tempo diabetica, quattro di loro avevano due mesi, dieci avevano 12 mesi e 2 avevano 24 mesi di tempo diabetica.

Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, l'orecchio ischemica è apparso freddo e cianotico, con lieve edema. L'orecchio più importante-arteria centrale arteria-avuto un forte impulso nell'orecchio normale, ma tale impulso non era presente nell'orecchio ischemica. Movimento Ear è stato ridotto, ma non scompariranno del tutto. La pelle ha depressioni chiari sul tunnel, ma non ischemia o necrosi è stata trovata in un animale (Fig. 4).

Le temperature della pelle delle orecchie normali e ischemico sono stati misurati con un termometro digitale (da Omron Omron Healthcare, Bannockburn, IL, o un tipo K termometro a infrarossi posto da Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Le differenze di temperatura tra l'orecchio non-ischemica e ischemica variava da 1 a 10 ° C, with maggior parte dei conigli che rientrano nell'intervallo di 2-6 ° C. Fig. 5 mostra le differenze di temperatura media di 30 conigli. La differenza di temperatura era maggiore nei primi giorni dopo l'intervento chirurgico, diminuita gradualmente dopo 15 giorni, ma venne mantenuta alla fine di un mese.

Tessuto ad alta energia contenuti fosfato sono stati misurati in alcuni animali dopo che sono stati sacrificati. Sei campioni di tessuto sono stati prelevati da ciascun orecchio e ad alta energia contenuti fosfato sono state misurate mediante HPLC. Sia ATP e concentrazioni di energia totale erano più elevati nelle orecchie normali che nelle orecchie ischemiche. Fig. 6 mostra un esempio di un coniglio sacrificati 23 giorni dopo l'intervento. La media dei tessuti contenuti ATP erano 0,349 ± 0,047 mmol / g (media ± SD) nella spiga normale vs 0,237 ± 0,059 micromol / g nell'orecchio ischemico (p <0,005). Media totale di energia (ATP + ADP + AMP) è 0,882 ± 0,137 micromol / g nell'orecchio normale vs 0,556 ± 0,115 micromol / g nel ische mic orecchio (p <0,001).

Tempi di guarigione delle ferite erano sempre più per l'orecchio ischemica che per il non-ischemica orecchio in tutti i gruppi (non-diabetici o diabetica). Fig. 7 mostra un confronto di guarigione 26 tra coppie di ferite sulle orecchie ischemici e non-ischemica. Tempi di guarigione variano da 13 a 18 giorni (media 14,9 ± 1,6 giorni) sulle orecchie normali vs 17 a 27 giorni (media 20,5 ± 3,4 giorni) sulle orecchie ischemico (p = 0,001). Tempi di guarigione della ferita nei conigli anziani e diabetici erano molto più a lungo, soprattutto quando il tempo era diabetica più di 12 mesi.

In questi conigli, tutte le incisioni guariti normalmente senza complicazioni, compresi i conigli con 24 mesi di tempo diabetica. Figura 8 è un esempio istologia mostra il tunnel sottocutaneo guarita in cui muscolo è assente e viene sostituito da tessuto fibroso. Tuttavia, la pelle è intatta.

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Figura 1. L'orecchio coniglio è alimentato da tre fasci vascolari. La centrale è il più grande, il cranica è più piccolo, e il fascio caudale è il più piccolo. Questi vasi sono facilmente visibili sulla superficie dopo l'orecchio è rasato.

Figura 2. I tre fasci vaso sul sangue dorsale alimentazione orecchio non solo per la pelle dorsale, ma anche alla pelle ventrale attraverso vasi penetranti. La freccia indica i vasi che penetra attraverso la cartilagine. Gli spettacoli incasso Sezione dei questi vasi.

Figura 3. Quattro 6 mm ferite vengono creati sul lato ventrale del orecchio e il pericondrio viene rimossa. La base su cui la granulazione e la epitelizzazione avvengono è la cartilagine, ma la cartilagine non è perforato. Il 3 smal incisioni cutanee sono chiusi con l interruzione pelle molto poco.

Figura 4. Dopo che le incisioni cutanee sono chiuse, la rientranza sul tunnel sottocutaneo è chiaramente visibile.

Figura 5. La differenza di temperatura media della pelle tra l'orecchio normale e ischemica in 30 conigli. Le gamme differenza primi da 7 ° C a 10 ° C dopo l'intervento. La differenza diminuisce gradualmente ma ancora mantenuto alla fine di un mese.

Figura 6. Auricolari tessuto ad alta energia contenuti fosfato sono ridotti nell'orecchio ischemica rispetto ai non-ischemica orecchio a 23 giorni dopo l'intervento (p <0,001).

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Ferita Figura 7. Tempo di guarigione è più lungo nelle orecchie ischemici rispetto ai non-ischemiche orecchie ferite (26 ciascuno). Healing è definito come il ripristino di integrità di tessuto danneggiato, cioè, la riepitelizzazione completa della ferita siti.

Figura 8. Campione istologia mostra la porzione ad orecchio contenente tunnel sottocutaneo. Il tessuto guarito è più sottile orecchio normale, il muscolo scheletrico originale è assente e viene sostituito da tessuto fibroso. Tuttavia, la pelle è intatta.

Discussione

Il diabete colpisce 23,6 milioni di persone negli Stati Uniti, ^2,3 e 15-20% di questi pazienti sviluppa ulcere del piede durante la loro vita, ^4,5 ad un costo annuale di trattamento di più di $ 25 miliardi. ^3,6 Tuttavia, anche i migliori disponibili trattamenti di raggiungere solo un tasso di guarigione del 50% e questo è spesso temporanea, ⁷ con tassi di recidiva addirittura al 66% nei diabetici. ^3,6 Quando si verificano ulcere in pazienti diabetici, complicazion...

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