Tracciamento di segnalazione all'interno di aggregati di cellule ipossiche Encapsulated

Riepilogo

Un metodo per foto-incapsulamento delle celle in un idrogel PEG reticolato è descritto. Segnalazione ipossiche all'interno incapsulato insulinoma murino (MIN6) aggregati è monitorato attraverso un sistema marcatore fluorescente. Questo sistema permette la visione seriale di cellule all'interno di un idrogel impalcatura e la correlazione di segnalazione ipossia con i cambiamenti nel fenotipo delle cellule.

Abstract

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic β-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored^1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.

Biologically-derived materials, such as alginate³ and agarose⁴, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth⁵ which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,^6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures^6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells^7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue¹⁰. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.

An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact β-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen^11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated¹⁴. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling¹⁵. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously¹⁵. The virus is stored in 10% glycerol at -80° C as many 150 μL aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 10¹⁰ pfu/mL.

Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion¹⁵. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1α for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

Protocollo

1. PEGDM sintesi e PEGDM fotoattivi preparazione macromer soluzione

1. Pesare 2 g di PEG (lineari, 10.000 Da) in un flacone di vetro 40ml con tappo in plastica rigida.
2. Aggiungere circa 308μL di anidride metacrilico e vagamente tappo del flaconcino.
3. Microonde la fiala in alto per 2 minuti in un forno a microonde standard ad uso privato. Indossare guanti resistenti al calore, completamente vortice il flacone, poi in alto a microonde per altri 5 minuti.
4. Brevemente il flacone permettono di raffreddare abbastanza da essere maneggiato con i guanti. Stappare e aggiungere lentamente il cloruro di metilene, mentre agitando il flaconcino. Aggiungi sufficiente in modo che la soluzione appare chiara ed omogenea, vortex il campione, se necessario. Il volume totale del cloruro di metilene utilizzato deve essere 1,5 - 2 ml.
5. PEGDM precipitato in 200 ml di freddo, agitato dietiletere aggiungendo goccia a goccia la soluzione.
6. Raccogliere il PEGDM filtrazione sotto vuoto e lasciarlo asciugare.
7. Sciogliere il PEGDM in quantità adeguatadi acqua deionizzata (tipicamente 100 -150 ml).
8. Dializzare la soluzione contro l'acqua deionizzata per 5 giorni in tubi di dialisi, con un peso molecolare di cut-off di 1.000 Da. Sostituire l'acqua una volta al giorno.
9. Aliquota della soluzione in appositi contenitori e congelare a -80 ° C durante la notte. Liofilizzare la soluzione per 4 giorni fino ad ottenere una polvere bianca PEGDM purificata. Conservare la polvere a 4 ° C, quando non in uso.
10. Per preparare una soluzione PEGDM fotoattivi, prima preparare una percentuale 0,5 Peso soluzione fotoiniziatore magazzino sciogliendo Irgacure 2959 in acqua deionizzata. Vortex la soluzione e conservarla nel buio.
11. Preparare un 10% in peso PEGDM e 0,025% in peso Irgacure 2959 soluzione in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS). Vortex a fondo per garantire lo scioglimento del PEGDM. Noi di solito preparare 1 ml di questa soluzione in un momento.
12. Sterilizzare la soluzione filtrandola attraverso un filtro 0,2 micron siringa in una provetta per microcentrifuga da 1,8 ml. Avvolgere il tubo in alluminioe conservare a 4 ° C

2. Cultura, l'infezione e l'aggregazione di cellule MIN6

1. MIN6 cellule sono coltivate in RPMI 1640 medium supplementato con 10% FBS, glucosio 7mm, 100 unità / mL penicillina / streptomicina, e 0,5 mg / ml amphotercin B in un ambiente umidificato a 37 ° C e 5% di CO _2.
2. Per rilasciare le cellule dalla superficie coltura trattata fiasco, aspirare il terreno, lavare le cellule con 37 ° C di calcio / magnesio senza HBSS, aspirare il HBSS, poi aggiungere 2 ml di 37 ° C tripsina-EDTA soluzione e permettono alle cellule di incubare per 3 minuti.
3. Saldamente vaso sul lato del pallone per battere il celle libere, quindi aggiungere 8 mL di 37 ° C di media e vigorosamente pipetta la sospensione cellulare su e giù facendo attenzione a non introdurre bolle.
4. Pipettare le cellule in una provetta sterile 15 ml centrifuga ed effettuare un conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro o una cella di altri procedura di conteggio.
5. Nella preparazione di infettare le cellule con il produttorevirus, in primo luogo determinare il numero totale delle cellule di essere infetti e calcolare il volume di sospensione di virus necessari per raggiungere il desiderato molteplicità di infezione (MOI) (da 50 a 100 particelle infettive per cella).
6. Diluire il virus in HBSS con attenzione pipeting la giusta quantità di sospensione di virus in un pre-aliquotati volume di HBSS in una provetta da microcentrifuga da 1,8 ml. 50 ml di HBSS per pozzetto di cellule aggregazione è appropriato.
7. Disperdere le cellule pipeting su e giù nel loro tubo, poi pipettare il volume necessario per raggiungere 400.000 cellule per pozzetto nei pozzetti di un 6-pozzetti sospensione cultura.
8. Aggiungere il volume appropriato di virus diluito in ciascun pozzetto per ottenere il desiderato MOI.
9. Aggiungi medio in ciascun pozzetto per portare il volume totale fino a 1,7 ml.
10. Posizionare la piastra su un agitatore orbitale all'interno dell'incubatore. Impostare l'agitatore in un ambiente basso in modo che il mezzo lava delicatamente intorno ai pozzi (~ 100 rpm). Permettono alle cellule di aggregazionete per 24-36 ore. Aggregati con un diametro approssimativo di 75-175 micron dovrebbe essere formato.

3. Incapsulamento delle celle a PEGDM

1. Le cellule possono essere incapsulati come una dispersione (passo 2.4) o l'aggregazione seguente (punto 2.10). Dal momento che il precursore soluzione idrogel PEGDM è un liquido, le cellule possono tendere a risolvere prima di reticolazione e la formazione di idrogel. Se il regolamento dovrebbe avvenire rapidamente, come nel caso di grandi aggregati, può essere utile per produrre l'idrogel in due fasi in modo che le cellule risolvere su un piano centrale del gel. Un one-step procedura di sintesi idrogel appropriata per le cellule disperse è mostrato (Figura 2) e la procedura in due fasi è mostrato così (Figura 3) e di dettaglio di seguito (3,2-3,9).
2. Creare un vaso in cui l'idrogel sarà formata da taglio la punta affusolata off di una siringa da 1 ml di plastica e l'immissione aprirlo finire in un rack.
3. Pipettare 20 ml di PEGDM fotoattivi cosìluzione in l'estremità aperta della siringa sul pistone assicurandosi il volume copre l'intera superficie dello stantuffo. Regolare lo stantuffo in piccoli incrementi per ottenere una superficie piana fluido.
4. Posizionare la pipetta nel rack e la posizione del rack sotto una lampada UV (365nm, ~ 7 mW / cm ²⁾ per circa 8 minuti per consentire la reticolazione idrogel. Durante questo tempo, la preparazione delle cellule può essere iniziata
5. Pipettare un volume contenente il numero desiderato di cellule / aggregati in un tubo di 1,8 ml microcentrifuga, berretto, e centrifugare la provetta a 130 g per 5 minuti.
6. Utilizzando un micropipettor, rimuovere con attenzione i media senza disturbare il pellet di cellule sulla punta del tubo. Come capo dei media si avvicina il pellet, può essere utile utilizzare una più fine, 10 punta della pipetta microlitri.
7. Delicatamente risospendere il pellet cellulare in 20 ml di soluzione fotoattivi PEGDM (usare una bocca larga punta della pipetta se si lavora con aggregati) e aggiungere la sospensione cellulare alla siringa sulla parte superiore del secoloe precedentemente reticolato porzione idrogel.
8. Esporre la siringa per ulteriori 8 minuti di luce UV per completare la costruzione del idrogel. Al termine, le cellule devono essere completamente incapsulato all'interno del idrogel cilindrico (Figura 3).
9. Espellere l'idrogel dalla siringa e in 1 ml di HBSS nel pozzo di un 24-pozzetti per lavare brevemente il gel. Trasferire il gel per 1 ml di media nel pozzo di un 24-pozzetti e cultura sotto le condizioni desiderate.

4. Monitoraggio ipossia

1. In qualsiasi momento durante l'immagine della cultura, le cellule usando la microscopia a fluorescenza per monitorare l'avvio di segnalazione ipossiche. A seconda di cosa viene esposta si può immagine nel multi-pozzetti o trasferire il gel di un vetrino da microscopio prima del posizionamento sul palco microscopio. Eccitazione picco di Ds Rosso è raggiunta a 556nm e picco di emissione avviene a 586nm. Emissione è abbastanza intenso, e quindi photobleaching non è stato osservatoried per essere problematico. Intervallo di tempo tra l'inizio della produzione di proteine ​​e il rilevamento primo segnale è di circa 12 ore. Il segnale è sufficientemente specifica da identificare le singole cellule di segnalazione, ma la risoluzione può essere inadeguato per determinare la localizzazione del segnale intracellulare. Nelle cellule di segnalazione, il segnale si osserva tipicamente in modo uniforme in tutto il citoplasma. Intensità del segnale può anche aumentare con l'esposizione estesa a ipossia, anche se non abbiamo ancora pienamente determinato se questo è dovuto alla maggiore espressione della proteina, accumulo di proteine ​​nel complesso, o ritardata maturazione delle proteine.

5. Rappresentante risultati

Un esempio rappresentativo di MIN6 aggregati incapsulato in un idrogel PEG è mostrato in Figura 4. Il gel reticolato sarà solido in tutto, prendendo la forma del recipiente in cui è stata eseguita la reazione. Un gel con lisce superfici esterne è preferibile per l'impianto di aiuto nella prevenzione di un nuovo corpo estraneosponse. All'interno il gel, aggregati di cellule dovrebbe essere completamente chiusa nella matrice e omogeneamente distribuita in modo da migliorare il trasporto dei nutrienti.

Immagini rappresentative di segnalazione ipossiche in MIN6 aggregati sono illustrati nella Figura 5. Identico MIN6 aggregati infettati con il virus marcatore sono state coltivate in entrambe il 20% O ₂ (5a) o 1% O ₂ (5b) per 44 ore prima della cattura dell'immagine.

Figura 1. Schematica delle attività del nostro sistema marcatore ipossia. Inserimento adenovirali della Red Ds DR gene a monte e promotore HRE permette di ipossia indotta la produzione della proteina fluorescente sotto il controllo di HIF-1.

Figura 2. Diagramma di flusso procedurale per l'unico passaggio incapsulamento di dispersi MIN6 celle di una crosslinked idrogel PEGDM. Per ogni gel, le cellule disperse sono sospese in 40μL della soluzione macromer fotoattivi PEGDM. Questo è posto in una siringa 1 ml e decapitato l'idrogel è formata sotto la luce UV 365nm dopo 10-12 minuti. Al termine, il disco idrogel è rimosso dalla siringa, lavato e messo in un mezzo pieno di pozzetti per l'incubazione.

Figura 3. Diagramma di flusso procedurale per il doppio passo incapsulamento di aggregati MIN6 cellule in un idrogel PEGDM reticolato. Per ogni gel, un mezzo-gel è il primo formato da reticolazione UV 20μL della soluzione macromer PEGDM fotoattivi per 8 minuti. MIN6 aggregati sono accuratamente sospesi in un 20μL addizionale di soluzione fotoattivi macromer che viene aggiunto in cima alla pre-formata a metà gel. Il gel completo è formato da un ulteriore 8 minuti di esposizione ai raggi UV con aggregati completamente incapsulato nel medialepiano del gel.

Figura 4. Immagine di un idrogel 40μL sotto ingrandimento 20X. MIN6 aggregati (~ 400.000 cellule totali) si vedono chiaramente all'interno del gel. Diametro idrogel è di circa 6mm (bar = 1mm).

Ipossia Figura 5. Fluorescente di segnalazione in forma aggregata MIN6 cellule in un idrogel PEGDM. Le cellule che sono state incapsulate e poi messe in incubazione a 20% O ₂ per 44 ore non vengono visualizzati segnalazione ipossia (a), mentre le cellule che sono state incapsulate poi incubate in 2 O _2% per 44 ore visualizzare segnale chiaro e onnipresente. (Bar = 100μm) (b).

Discussione

Il metodo presentato qui offre una tecnica rapida e semplice per l'incapsulamento delle cellule in un idrogel PEG con il minimo uso di non-fisiologiche condizioni. PEG rappresenta un materiale di incapsulamento molto utile per la sua biocompatibilità e la facilità di modifica. Semplice variazione di percentuale PEG nella soluzione fotoattivi, per esempio, possono essere utilizzati per regolare le proprietà meccaniche, come modulo di compressione, e proprietà di trasporto attraverso la dimensione dei pori. Inoltre, PEG è facilmente modificabile con l'aggiunta di catene laterali. Idrogel PEG, quindi, rappresentano sia un dispositivo promettente clinico e una piattaforma flessibile per la ricerca in vitro

Un metodo per il monitoraggio ipossia nel PEG-incapsulato cellule è stato presentato. Questo metodo è utile per la semplicità di rilevazione ipossia e per evitare la necessità di sacrificare le cellule di interesse. La tecnica può essere applicata ad una varietà di tipi di cellule in una varietà di condizioni che rendono le sue noiefulness ampio. Per esempio, l'ipossia come spunto per la differenziazione delle cellule staminali possono essere rintracciati in colture di cellule staminali Micromass. Tuttavia, questo metodo può essere applicato solo per disperdere i sistemi cellulari o sistema in cui le cellule sono disperse in seguito aggregate. Inoltre, il rilevamento del segnale fluorescente può essere difficile nei tessuti più grandi o più dense.

Materiali

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale
PEG	Sigma-Aldrich	309028-500G
Anidride metacrilico	Sigma-Aldrich	276685-100ML
Microonda	Emerson	MW8784SB
Vortex	Settori scientifico	SI-A236
Cloruro di metilene	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Etere dietilico	Sigma-Aldrich	346136-1L
Dialisi Tubi	Spettro	132640
	Laboratori
Congelatore
Liofilizzatore	Labconco	7670521
Pompa del vuoto	Welch	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21-022-CV
Filtro siringa	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	* Formulazione personalizzati
FBS	PAA Laboratories	A15-351
Penicillina-Streptomicina	Mediatech	30-002-CI
Amfotericina B	Mediatech	30-003-CF
Incubatrice	Thermo Scientific	3597	NAPCO Serie 8000 WJ w / O2 soppressione
Tripsina EDTA	Mediatech	25-052-CI
Shaker orbitale	VWR	12620-926
Lampada UV	Sanyo Denri	FLR40SBLB / M	Tiene due 40W, lampade UV 365nm blu blacklight
Centrifuga	Eppendorf	5811 000.010 *	* Numero d'ordine. Modello 5810 R
Microscopio	Nikon	TI-ND6-PFS	Con filterset di eccitazione 556nm / 586nm emissione