Tutta la perfusione di fissaggio degli animali per i roditori

Riepilogo

Qui noi descriviamo un basso costo, rapido, procedura di sintesi uniforme e controllata impiegando 4% paraformaldeide perfusi attraverso il sistema vascolare: attraverso il cuore di ratto per ottenere la migliore conservazione del cervello.

Abstract

L'obiettivo di fissaggio è di preservare rapidamente ed uniformemente tessuto in uno stato simile vita. Durante il posizionamento dei tessuti direttamente nelle opere di fissativo bene per piccoli pezzi di tessuto, grandi campioni come il cervello intatto pongono un problema per il fissaggio a immersione, perché il fissativo non raggiunge tutte le regioni del tessuto alla stessa velocità ^5,7. Spesso, cambiamenti nella risposta all'ipossia iniziare prima che il tessuto può essere conservato ^12. Il vantaggio di perfusione fissativo direttamente attraverso il sistema circolatorio è che la sostanza chimica in grado di raggiungere rapidamente ogni angolo dell'organismo naturale, utilizzando la rete vascolare. Al fine di utilizzare il sistema circolatorio più efficace, occorre prestare attenzione a corrispondere pressioni fisiologiche ^3. È importante notare che pressioni fisiologiche dipendono dalle specie utilizzate. Tecniche per il fissaggio perfusione variano a seconda del tessuto da fissare e come il tessuto saranno elaborati fissazione seguente. In questo video, Noi descriviamo un basso costo, rapido, procedura di sintesi uniforme e controllata impiegando 4% paraformaldeide perfusi attraverso il sistema vascolare: attraverso il cuore di ratto per ottenere la migliore conservazione del cervello per immunoistochimica. Il vantaggio principale di questa tecnica (vs alimentata per gravità sistemi) è che il sistema circolatorio viene utilizzato più efficacemente.

Protocollo

1. Preparare Fixative

(Vedi tabella Fissativo e tamponi.)

2. Preparare buffer perfusione

(Vedi tabella Fissativo e tamponi.)

3. Preparare Apparecchiatura e Anestesia

1. Utilizzando il bagno d'acqua, calda tampone perfusione a 37 ° C. Luogo valvola di scarico in un bicchiere pieno di buffer. Riempire una siringa da 50 ml con il tampone e fissarlo al tubo fissativo. Lavare ripetutamente espellendo tubo e della revoca dello buffer.
2. Deselezionare la linea con buffer fino a quando tutte le bolle d'aria nelle tubazioni vengono eliminati. È fondamentale per il successo di una perfusione non avere bolle d'aria in qualsiasi delle linee.
3. Rimuovere la siringa e collegare il fissativo paraformaldeide al 4% (temperatura ambiente) del contenitore. Per evitare bolle d'aria alla fine tubo, spremere il tubo mentre posizionare il tubo nel contenitore in modo che una goccia di tampone sporge dalla t fineO contattare la superficie del liquido all'interno del contenitore.
4. Chiudere la porta di uscita (fine ago). Ruotare valvola tampone (blu) nella stessa posizione della valvola fissativo (bianco). Ciò consentirà il flusso dalla linea solo tampone.
5. Aprire la porta di uscita e ripetere il passo da A1 a A3 per il riempimento della linea di buffer. Dopo che tutte le bolle d'aria vengono eliminati chiudere la porta di uscita, rimuovere la siringa e collegare il contenitore buffer, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nel tubo.
6. Sistema di test per la capacità di mantenere la pressione pompando il blub manometro in gomma. Non vi è normalmente una certa resistenza dovuta alla compressione di aria nel sistema.
7. File di installazione di chirurgia per consentire facile accesso. Riempire l'ago perfusione con tampone per eliminare la possibilità di bolle d'aria.
8. Prima dell'intervento, uno ketamina / xilazina miscela (fino a 80 mg / kg di peso corporeo ketamina e 10 mg / kg di peso corporeo xilazina) viene somministrato mediante iniezione intraperitoneale (27 gauge e 1 siringa cc). Somministrazione supplementare di anestetico viene eseguita come necessario nel corso di ogni operazione di mantenere un piano chirurgica di anestesia.

4. Perfusione Chirurgia

1. Una volta che l'animale ha raggiunto un piano di anestesia chirurgica, posizionarlo sul vassoio poco profondo riempito con ghiaccio tritato. (Usare una convergenza pinch-risposta metodo per determinare la profondità dell'anestesia. Animale deve essere non risponde prima di continuare).
2. Eseguire un'incisione 5-6 cm lateralmente attraverso l'involucro e la parete addominale appena sotto la gabbia toracica. Accuratamente separare il fegato dal diaframma.
3. Fai una piccola incisione nella membrana utilizzando le curve, le forbici. La posizione e la pressione del dito può aiutare nella capacità di tagliare il diaframma.
4. Continuare la membrana incisione lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica.
5. Posizionare le forbici curve, lungo un lato delle costole, con attenzione spostando i polmoni, e fare un cut attraverso la gabbia toracica fino alla clavicola. Fare un taglio simile sul lato controlaterale.
6. Sollevamento dello sterno via, tagliare con cura qualsiasi tessuto di collegarlo al cuore. Bloccare la punta dello sterno con la pinza emostatica e posizionare la pinza emostatica sopra la testa. Se fatto correttamente, il timo solleva lontano dal cuore insieme con lo sterno, fornendo una visione chiara dei vasi sanguigni principali.
7. Fai una piccola incisione alla estremità posteriore del ventricolo sinistro con le forbici iris.

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8. Passare a 15-gauge perfusione smussata o di olio di punta attraverso il ventricolo taglio in aorta ascendente. La punta deve essere visibile attraverso la parete dell'aorta, e non dovrebbe raggiungere l'arco aortico dove le arterie carotidee brachiale e divergono.
9. Utilizzare una pinza emostatica per bloccare il cuore, questo assicura l'ago e impedisce la fuoriuscita. Se desiderato, all'emostato modificato può essere utilizzato per bloccare l'aorta intorno alla punta dell'ago (questi hemostats mantenuto fino a quando inizia dissezione, ma sono omessi dalle illustrazioni futuri per chiarezza).
10. Infine, per effettuare un'incisione all'atrio destro dell'animale usando forbici iris per creare una presa più grande possibile, senza danneggiare l'aorta discendente. A questo punto l'animale è pronto per essere perfuso.

5. Perfusione

1. Aprire la porta di uscita e collegare all'ago di base facendo attenzione a non introdurre eventuali bolle d'aria.
2. Gonfiare il bulbo manometro ad una pressione di 80 mmHg rapidamente e uniformemente. Mantenere questa pressione per tutto il periodo di infusione buffer. Avviare il timer.
3. Regolare l'angolo ago. L'angolo dell'ago è critica per il raggiungimento di una portata massima (notare la variazione di flusso con regolazione dell'angolo).
4. Accendere il buffer valvola (blu), una volta tampone è quasi finito (200 ml). Il fluido deve essere in esecuzione chiaro. La compensazione del fegato è un indicatore di un buon perfusione. Il fegato dovrebbe essere chiaro a questo punto. Indicare il tempo per i vostri record.
5. Tremori di fissaggio devono essere osservate in pochi secondi, questo dovrebbe essere considerato il vero tempo di fissazione. Indicare il tempo per i vostri record.
6. La pressione può essere gradualmente aumentare fino ad un massimo di 130 mm Hg ² per mantenere un tasso costante di flusso.
7. Chiudere la valvola di scarico una volta che il fissativo è quasi finito. Indicare ora di fine per i vostri record.
8. Il topo deve essere rigido in questa fase.
9. La paraformaldeide utilizzato deve essere raccolto e conservato per lo smaltimento secondo le norme della vostra istituzione.

6. Dissezione ^4,11

1. Togliere la testa con un paio di forbici.
2. Fai una incisione lungo la linea mediana tegumento dal collo al naso ed esporre ilcranio.
3. Tagliare il muscolo restante collo in modo che la base del cranio è esposto; rimuovere ogni residuo di muscolo utilizzando forbici o Rongeurs.
4. Posizionare la punta di un paio di forbici iride in forame da un lato, le forbici accuratamente scorrere lungo la superficie interna del cranio.
5. Successivamente, un taglio che si estende al bordo distale della superficie posteriore cranio. Fare un taglio identico sul lato controlaterale. Utilizzare i Rongeurs di sgombrare il cranio intorno al cervelletto.
6. Scorrere delicatamente le forbici lungo la superficie interna del cranio come la punta viaggia dal dorsale angolo distale posteriore al bordo distale frontale del cranio, sollevando la lama, come si sta tagliando per evitare danni al cervello. Ripetere sul lato opposto.
7. Utilizzando Rongeurs sbucciare la superficie dorsale del cranio fuori dal cervello. Rifilare i lati del cranio utilizzando Rongeurs pure.
8. Utilizzando una spatola, tagliare i bulbi olfattivi e le connessioni nervosezioni lungo la superficie ventrale del cervello.
9. Delicatamente stuzzicare il cervello fuori dalla testa, ogni taglio dura che collega ancora il cervello al cranio con le forbici iris.
10. Rimuovere il cervello e collocarlo in una fiala di liquido fissativo contenente almeno 10 volte il volume del cervello. Agitare il flacone di tanto in tanto.

7. Post-fissazione & Storage

1. Tenere il cervello in fissativo per 24 ore a 4 ° C, agitando di tanto in tanto.
2. Dopo 24 ore, lavare il cervello tampone fosfato scambiando i mezzi 3 volte e agitando ogni volta.
3. I cervelli possono essere memorizzati in salina tamponata con fosfato o HBHS con sodio azide e mantenuto a 4 ° C.

8. Risultati rappresentativi

Un indicatore iniziale del successo della perfusione è la compensazione delle estremità come il naso, le orecchie e le zampe e gli organi interni come il timo e il fegato (IHC World).Ispezione lordo del cervello rivela il vuoto vaso sanguigno di sangue (bianco a giallo pallido aspetto giallo). Questo sarà anche vero all'interno di sezioni di tessuto destinare per la colorazione ed immunoistochimica. L'indicatore finale del risultato della perfusione è la condizione della ultrastruttura nel tessuto. ^1,6,7,8

Preparare Fissativo:

Preparare magazzino paraformaldeide all'8%

Aggiungere 40 g di paraformaldeide a 500 ml dH 2 O. Riscaldare la soluzione a 60 - 65 ° C sotto agitazione (non superare i 65 ° C, così facendo può influenzare negativamente il successo della procedura immunoistochimica). Per cancellare la soluzione, abbassare la fiamma e aggiungere 2-3 ml di NaOH 1,0 M con un contagocce. Filtrare e conservare a 4 ° C per un massimo di 1 mese.

Preparare 0,2 M tampone fosfato di sodio, pH 7,4

Per il magazzino sodio fosfato monobasico, aggiungere 27,8 g di NaH 2 PO 4 * H 2 O a 1 L dH 2 O. Per lo stock di fosfato di sodio bibasico, aggiungere 28,4 g Na 2 HPO 4 a 1 L dH 2 O. Aggiungere 810 ml dello stock monobasico a 190 ml dello stock bibasico.

Preparare Fixative paraformaldeide 4%

Aggiungi parti uguali magazzino paraformaldeide 8% a 0,2 M tampone fosfato di sodio Nota: questa correzione è meglio preparato fresco, non più di 72 ore di anticipo.

Preparare perfusione e buffer di memoria:

Preparare Soluzione tampone fosfato, pH 7.4

1 L dH 2 O 9 g NaCl 144 mg KH 2 PO 4 795 mg Na 2 HPO 4 Controllare il pH

HEPES tamponata Hanks Solution (HBHS) con pH 7,4 Sodio Azide

990 ml di dH 2 O 7,5 g di NaCl, 0,3 g di KCl 0,06 g di KH 2 PO 4 0,13 g di Na 2 HPO 4 2 g Destrosio / glucosio 2.4 g 10 mm Hepes 0,1 g MgCl 2 6 parti dH 2 O 0,05 g MgSO 4 7 parti dH 2 O 0,165 g CaCl 2 2 parti dH 2 O 90 mg NaN 3 Controllare il pH

Tabella 1. Preparazione di fissativo e tamponi.

Figura 1. Apparecchiatura di perfusione con componenti etichettati.

Figura 2. Preparazione della perfusione Apparatus I. Inizia con la linea di fissativo. Lavare il tubo di bolle d'aria e riempire con il tampone, mediante una rapida espulsione e la revoca del buffer nella siringa e attraverso la linea. Chiudere la valvola sulla fine dell'ago off. Posizionare la linea fissativo nella bottiglia fissativo senza introdurre bolle d'aria.

Figura 3. Preparazione della perfusione Apparecchiatura II. 1. Aprire la valvola sul lato dell'ago. 2. Girare la valvola buffer (blu) in posizione per il flusso. 3. Lavare il tubo di bolle d'aria e riempire con il tampone, mediante una rapida espulsione e la revoca del buffer con la siringa. 4. Chiudere la valvola alla fine dell'ago. Posizionare tubo nella bottiglia buffer. Pressione di prova per assicurarsi che il sistema è sigillato correttaly pompando il bulbo manometro e guardare il manometro. L'apparecchio è pronto per la procedura di perfusione.

Figura 4. Apparecchiatura di perfusione in posizione per la consegna del buffer.

Figura 5. Perfusione Chirurgia I. a) Fare una incisione laterale attraverso l'involucro e la parete addominale. b) Praticare un'incisione nel diaframma e tagli attraverso il diaframma esponendo il cuore. Effettuare tagli paralleli ai lati delle nervature fino alla clavicola. c) bloccare la punta dello sterno con all'emostato e posizionare il emostato sopra la testa.

Figura 6. Perfusione Chirurgia II. a) passare l'ago perfusione attraverso il ventricolo taglio in aorta ascendente. b) Fissare ilperfusione ago uso una serie di hemostats per reprimere il cuore. Una seconda serie di una pinza emostatica modificato può anche essere utilizzato per bloccare l'aorta intorno alla punta dell'ago impedisce la fuoriuscita. Utilizzando forbici iride fare una piccola incisione a estremità posteriore del ventricolo sinistro.

Figura 7. Perfusione con la pompa del tampone lampadina manometro per creare pressione nella linea. Aprire la valvola (1) e allegare al mozzo dell'ago. E 'fondamentale per assicurarsi che non bolle d'aria vengono introdotti. Gonfiare il bulbo manometro ad una pressione di 80 mm Hg e mantenere questa pressione durante il periodo di infusione di buffer.

Figura 8. Perfusione con fissante volta tampone è quasi finito (200 ml) commutare la valvola tampone (1) per consentire il fissativo di flusso. La pressione può essere aumentata gradualmente fino ad unmassimo di 130 mm Hg.

Dissection Figura 9. I. a) rimuovere la testa con un paio di forbici. b) fare un'incisione nella pelle lungo la linea mediana dal collo al naso ed esporre il cranio. c) tagliare il muscolo restante collo in modo che la base del cranio è esposto. Tenere la testa in modo che la grande apertura nella superficie cranio (forame magno) è accessibile. Inserire con cautela la punta di un paio di forbici iris nel forame magno e fare un taglio. Ripetere la stessa manovra per il lato controlaterale. Utilizzare i Rongeurs di sgombrare il cranio intorno al cervelletto.

Figura 10. Dissection II. a) far scorrere le forbici lungo la superficie interna del cranio. Sollevare la punta come si sta tagliando per evitare danni al cervello. Ripetere la stessalato opposto. Utilizzare Rongeurs buccia del cranio fuori dal cervello. b) illustrazione con il cranio rimosso e il cervello esposto. c) utilizzare una spatola di spezzare i bulbi olfattivi e le connessioni nervose nella posizione più anteriore del cervello. Con attenzione guidare la punta di spatola lungo la parte inferiore del cervello di recidere le connessioni per la facilità di rimozione. Togliere il cervello e metterlo in un flaconcino di fissativo.

Discussione

Note aggiuntive per un intervento chirurgico di successo:

1. Una volta che il diaframma è violato, precedere rapidamente ipossia e ipercapnia avvierà irreversibili cambiamenti fisiologici che possono confondere la successiva analisi.
2. Quando l'ago viene inserito e bloccato in posizione, la pressione residua spingerà sangue alla base dell'ago (flashback). In realtà, gli animali più grandi possono vigorosamente espellere il sangue. È fondamentale che il sangue almeno raggiungere la base dell'ago per evitare l'introduzione di bolle d'aria che presenterà un ostacolo per completare perfusione. Se il sangue non si osserva alla base dell'ago, estrarre l'ago e riempire con il tampone collegandolo alla porta di uscita della piattaforma perfusione. Una volta buffer è stato eseguito attraverso la punta, l'ago può essere reinserito nel cuore.
3. Corretto posizionamento dell'ago all'interno della aorta è critica, non deve arrivare fino aortico.
4. Se perfusioni più avvengono non è necessario tinstallazione o dall'inizio ogni volta. L'utente deve avere il volume corretto sia per il buffer e fissativo in ogni bottiglia (200mls animali / soluzione). Le bottiglie possono essere ricaricate, se necessario. L'aspetto più importante da considerare è stanare la linea di perfusione che va dal programma di installazione per l'animale (valvola di uscita). Dopo il completamento di una perfusione, questa linea avrà 4% paraformaldeide in esso. Togliere il tubo dal flacone di soluzione tampone e utilizzare una siringa da 50 ml riempita con acqua per irrigare il fissativo. Assicurarsi che la valvola di scarico viene posto in un beaker di raccolta dei rifiuti per lo smaltimento della paraformaldeide. Ripetere questa operazione tre volte. Riempire con buffer utilizzando lo stesso metodo indicato in 2.3.
5. Questo metodo di fissaggio è altamente adattabile con la possibilità di modificare sia tampone e fissativo altri fissativi, ad esempio quelli utilizzati per EM) secondo le esigenze dell'esperimento.
6. Il sistema viene spesso utilizzato anche per l'estrazione di tessuto vivo. Per questoun processo utilizza semplicemente la consegna di solo tampone (buffer mentre il flacone ancora collegato al sistema viene posto in un contenitore e il flacone fissativo è impostato come vuoto ma sigillato). Ciò assicura una perfusione tampone freddo alla pressione ottimale. Da qui il sistema può essere adattato per l'infusione di coloranti fissabili aggiungendo il colorante direttamente al buffer (se la quantità non è un problema) o utilizzare una siringa con una quantità minima di tampone / soluzione di colorante tra il tampone - passo fissativo.
7. Nel caso di colata vascolare, la fase di monitoraggio della pressione tampone è fondamentale tuttavia a causa della viscosità e solidificazione natura della soluzione di colata o una siringa da 50 ml deve essere utilizzato per la somministrazione diretta o un allegato monouso secondario all'apparato (tubi, valvole e tenendo Contenitore) realizzato per interfacciarsi con il sistema essere utilizzato. Fusione vascolare I nostri laboratori »seguita la progettazione e la fabbricazione del dispositivo di perfusione. Pertanto non possiamo STmangiato che le misurazioni di pressione sarà una misurazione precisa al sito di consegna. I numeri possono essere regolata per ottenere la consegna di successo di fluidi viscosi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attrezzatura	Azienda	Numero di catalogo	Comments
			Anestetici:
La ketamina / xilazina miscela (anestetici può variare in base alla laboratorio / istituzione)	Ketaset	NDC 0856-2013-01	Flaconcino da 10 ml
			Chirurgia:
Punta dell'ago, 27 x 1,25 GA "	Materiale Servizi	25251
Grandi forbici curve smussate / blunt (circa 14,5 cm)	Strumenti di Scienze Belle	14519-14
Etero iris forbici	Strumenti di Scienze Belle	14058-11
Standard pinzette	Strumenti di Scienze Belle	11027-12
Coppia di fine (Graefe) pinzette	Strumenti di Scienze Belle	11050-10
1 Pinza grandi hemostat - curvi o rettilinei (circa 19 cm)	surgicaltools.com	17.21.51
2 pinze standard di hemostat - diritto seghettati (14 cm)	Strumenti di Scienze Belle	13013-14
1 pinza emostatica modificato (con 15-gauge foro presentata tramite la punta)	Strumenti di Scienze Belle	13013-14
15-gauge smussata o di olio di punta (ago perfusione)	Fisnar	5601137
			Perfusione:
HyPerfusion o sistema equivalente
Tampone fosfato salino, pH 7.4
Paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4
Shallow vetro o il vassoio di plastica, circa 10 "x 10"
Ghiaccio tritato
Bagnomaria (37 ° C)
Timer
50 ml siringa	Medline Industries	NPMJD50LZ
			Dissection:
Pair di standard di forbici affilate / blunt rette (~ 12 cm)	Strumenti di Scienze Belle	14054-13
Medio Rongeurs curvi o rettilinei (14-16 cm) o di rimozione delle ossa del cranio pinze	Strumenti di Scienze Belle	16020-14
Diritto forbici iris (circa 9 cm)	Strumenti di Scienze Belle	14058-11
Micro-spatola (2 doppi "estremità piatte, uno arrotondato, uno conico a 1/8")	Strumenti di Scienze Belle	10091-12
			Post-fissazione e conservazione:
50 ml fiala di vetro
40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) con azide di sodio (90 mg / l)