Valutazione di espressione GFP e sostenibilità Utilizzando la Image-Based Tali Citometro

Riepilogo

Questo protocollo descrive come eseguire la vitalità cellulare e saggi di espressione utilizzando la fluorescenza Image-Based Tali Citometro.

Abstract

Unicellulari e informazione della popolazione sono comunemente ottenute mediante citometria di flusso o microscopia a fluorescenza. Tuttavia, questi due metodi forniscono informazioni diverse. Citometria a flusso dà quantitativa multi-parametrico informazioni sulle caratteristiche fisiche e colorazione o espressione, ma non permette per la visualizzazione. Stand-alone microscopia a fluorescenza fornisce dati visivi, ma non consente semplici misurazioni quantitative ^1.

Image-based citometria colma il divario tra questi due metodi, che permette la visualizzazione rapida e simultanea analisi quantitativa di migliaia di cellule in popolazioni eterogenee ^2. Qui vi presentiamo un metodo per eseguire la vitalità cellulare e la Green Fluorescent Protein (GFP) saggi di espressione utilizzando la Tali Image-Based Citometro ^3. Tali Lo strumento è un 3-canale (campo chiaro, verde fluorescenza, fluorescenza rossa), piattaforma di analisi da banco che offers numerosi vantaggi oltre citometria a flusso e microscopia a fluorescenza. Il citometro Tali è meno costoso, occupa spazio sul banco di meno, richiede meno manutenzione, e il flusso di lavoro è stata semplificata in modo che l'operazione e l'analisi è molto più semplice e veloce. Il citometro Tali è in grado di eseguire una vasta gamma di sospensione saggi cellulari, tra cui GFP e rosso proteina fluorescente (RFP) espressione, l'apoptosi ^4-6 e vitalità analisi cellulare con ioduro di propidio (PI) ^7-11.

Qui, dimostrano l'uso dello strumento Tali in esecuzione di un test di vitalità cellulare nelle cellule che esprimono GFP. GFP-trasdotte sono testate in base alla Viabilità Tali Kit - Red Cell Morto. Le cellule sono poi pipettati in una diapositiva Tali analisi cellulare e caricato nel citometro. Campo chiaro, fluorescenza rossa e verde immagini di fluorescenza vengono catturati e analizzati utilizzando algoritmi di analisi specifiche. Gli istogrammi vengono poi generati per visualizzare le dimensioni delle cellule, PI fluointensità fluorescenza, e GFP intensità di fluorescenza. Questi parametri possono essere thresholded a casa su una popolazione di cellule specifiche.

A fianco a confronto i lati del Citometro Tali basato su immagine e citometria a flusso tradizionali dimostra che i due metodi forniscono dati comparabili per quanto riguarda la vitalità delle cellule e di espressione delle proteine. Tuttavia, lo strumento Tali fornisce ulteriori informazioni visive sulla popolazione di cellule che non possono essere ottenuti utilizzando un citofluorimetro.

Protocollo

1. Le cellule colorazione con il kit Viability Tali - Reattivo cella Red Dead

1. Iniziare questa procedura con le cellule U2OS (American Type Culture Collection), che sono state trasdotte con CellLight Nucleo-GFP * BacMam 2,0 *. (Nota: Le celle possono anche essere centrifugati e risospesi in media o PBS).
2. Per colorare le cellule morte con PI, il trasferimento di 100 l di cellule in una provetta da microcentrifuga nuovo. Si noti che una concentrazione di 1 x 10 ⁵ a 1 x 10 ⁷ cellule / ml è consigliato per questa analisi, anche se la concentrazione non deve essere esatti.
3. Successivamente, a macchiare le cellule morte, aggiungere 1 ml di PI-based reagente cella Tali Red Dead. Mescolare brevemente nel vortex per miscelare. Incubare Morti Tali reagenti Red Cell e la miscela di cellule a temperatura ambiente al buio per 1-5 minuti.
4. Dopo l'incubazione, immediatamente procedere all'analisi del campione sul Image-Based Citometro Tali.

2. Esecuzione di un test di vitalità cellulare Utilizzando unTali Image-Based Citometro

1. Il citometro Tali utilizza la plastica monouso Tali diapositive analisi cellulare che specificamente inseriscono nel citometro e può contenere due campioni separati 25μL in camere chiuse (A e B). Quando si maneggia il vetrino, assicurarsi di tenere sempre ai lati.
2. Per caricare la slitta, pipetta 25 ml di campione lentamente nella forma di mezzaluna area campione di carico, avendo cura di evitare la formazione di bolle o indietro splatter. Non sopra o sotto riempimento.
3. Qui, le cellule di controllo (senza macchia, non trasdotte) vengono caricati in camera di A e il colorato GFP che esprimono le cellule vengono caricati in camera di B. Il campione di controllo contribuirà a determinare il livello di autofluorescenza quando si analizzano i dati.
4. Per eseguire un test di vitalità, toccare GFP / RFP sulla schermata iniziale del citometro. Le opzioni di dosaggio apparirà sulla destra. Seleziona GFP + vitalità.
5. Successivamente, a nome della serie di campioni, premere Nome Adesso . Quindi, utilizzando il touch screen, digitare il nome della serie di campioni, e premere Salva. (Nota: Seleziona Nome tardi per assegnare automaticamente un nome per ogni serie di campioni per data e ora).
6. Dopo aver nominato il campione, il citometro Tali passa automaticamente alla schermata di misura. Premere la linguetta Sfondo nella metà inferiore destra dello schermo Misura.
7. Successivamente, con il campione di controllo (A) rivolto verso il citometro, inserire la diapositiva nel porto di carico fino all'arresto. Non forzare.
8. Nella schermata di sfondo, toccare Premere per inserire nuove cellule di controllo non colorati. La slitta automaticamente tirato in citometro e una immagine dal vivo delle cellule verrà visualizzato sullo schermo.
9. Utilizzando la manopola di messa a fuoco, portare le cellule nel piano adeguato di vista. Le cellule devono essere uniformemente scuro con un alone luminoso attorno a ciascuna cella (Figura 1, a sinistra).
10. Cellulas può essere sottostimata quando la transizione tra lo sfondo ei bordi delle celle è sfocata, in modo che i bordi delle celle non sono ben definiti (Figura 1, Center). Le cellule possono essere overcounted quando hanno centri luminosi e perimetri scuro (figura 1, a destra).
11. Per meglio visualizzare la popolazione cellulare mentre ci si concentra, far scorrere il pulsante rosso indicatore Zoom per 4X o 16X.
12. Una volta che le cellule sono state portate a fuoco, toccare Premere per eseguire il controllo non colorati cellulare per misurare la fluorescenza di fondo.
13. Il citometro automaticamente acquisire e analizzare le immagini del campione. Ci vuole circa 1 minuto per catturare e analizzare le immagini di default (9 foto) modalità.
14. Le miniature di ogni campo di vista vengono visualizzati come vengono catturati e la barra di avanzamento fornisce un aggiornamento in corso. Dopo la cattura delle immagini è completo, il citometro espelle automaticamente la diapositiva e fornisce i dati dall'analisi delle immagini catturate.
15. I dati memorizzati saranno visualizzati nel menu a discesa della scheda Sfondo sul citometro. Il campione di controllo di fondo verrà assegnato lo stesso nome dato alla sperimentazione e saranno importati nel menu a discesa. Nota: Se un controllo di fondo non viene eseguito, il citometro assegna automaticamente una soglia di fluorescenza. Questa può essere cambiata manualmente dopo aver eseguito il test.
16. Per eseguire il PI-macchiato campione trasdotte, rimuovere il vetrino dal citometro, lancia intorno e reinserirlo con il campione trasdotte rivolto verso lo strumento.
17. Premere la linguetta di esempio e quindi toccare Premere per inserire nuovo campione. Quando l'immagine viene visualizzata sullo schermo, utilizzare la manopola di regolazione delle immagini per portare le cellule a fuoco come prima. Poi tocco Premere per esempio di esecuzione.
18. Dopo la cattura delle immagini è completa, i dati della analisi appare nella scheda del campione e l'automatico citometroalleato espelle la diapositiva.
19. Opportunamente smaltire l'analisi scorrere Tali cellulare come rifiuti a rischio biologico. Tali diapositive Analisi cellulare non può essere riutilizzato.

3. Soglie di impostazione e Gates

1. Una volta che il campione è stato eseguito, le soglie possono ora essere applicati al campione di casa su una popolazione di cellule specifiche. Qui, regolerà le soglie per determinare la percentuale di cellule vive e morte in GFP-trasdotte.
2. Nella scheda del campione, il numero e la percentuale di cellule che esprimono GFP, le cellule vive e morte che esprimono GFP, vitalità totale, la dimensione media delle cellule, il numero di cellule contate, e la concentrazione delle cellule vengono visualizzati.
3. Inoltre, la visualizzazione istogramma le dimensioni delle cellule, fluorescenza verde e rosso fluorescenza (PI) vengono visualizzati nella parte inferiore dello schermo.
4. Per impostare la porta di dimensioni delle celle, toccare la miniatura Dimensione cella per aprire l'istogramma dimensione della cella. Mentre le cellule in coltura hanno raramente debris, altri campioni possono contenere residui che è più grande o più piccolo rispetto alle cellule.
5. Per escludere questo detriti, far scorrere i pulsanti blu sulla barra di scorrimento per escludere gli eventi piccoli e grandi. Poi, selezionare Applica a ri-analizzare i dati e aggiornare i risultati.
6. Poi, per aggiungere la fluorescenza GFP per l'analisi, toccare la miniatura istogramma GFP per aprirlo. Far scorrere la barra blu di fissare la soglia appena a destra del picco più debole, utilizzando il campione di controllo come guida.
7. Questo permette di includere l'analisi delle cellule GFP positive, ma escludere le cellule autofluorescenti. Autofluorescenza è frequente quando le molecole biologiche all'interno delle cellule sono eccitati.
8. Selezionare Applica per confermare e tornare alla schermata precedente. I dati visualizzati nella scheda del campione dovrebbe rispecchiare le porte e le soglie indicate per entrambi i canali di fluorescenza.
9. Successivamente, per separare le cellule PI macchiato da autofluorescenza, premere tsi miniature istogramma PI per aprire l'istogramma PI.
10. Anche in questo caso, il picco campione di controllo viene visualizzato come un picco grigio sul istogramma. Il picco rosso è la fluorescenza del campione. La fluorescenza di fondo viene visualizzato come un picco più vicino al valore 0 RFU su questo citometro.
11. Per eliminare la fluorescenza di fondo nel canale PI, spostare il pulsante blu sulla barra di scorrimento per regolare la soglia di escludere il picco corrispondente fluorescenza di fondo, con il picco di grigio dal campione di controllo come riferimento. Selezionare Applica per confermare e tornare alla schermata precedente.
12. Poi, per confermare visivamente che ogni cellula sia correttamente assegnato, selezionare un campo di vista catturato per la revisione premendo la miniatura dell'immagine nella scheda Zoom, quindi premendo la scheda Livelli.
13. Successiva, premere il pulsante GFP o PI, per visualizzare l'immagine catturata attraverso quel particolare canale. Premere lo stesso tasto di nuovo per rimuovere lo strato dallo schermo, oppure, a sovrapporre strati, toccare il pulsante più livelli.
14. Per identificare come le cellule sono contate attraverso un canale particolare, Cerchi tatto. Le cellule che sono stati contati solo attraverso il campo chiaro canale, che non esprimono fluorescenza sarà cerchiato in blu. Ciò indica che quella cella particolare sono in diretta (cioè PI negativo).
15. GFP cellule che esprimono si vedrà nel canale GFP, e sarà cerchiata in verde. Le cellule morte colorate con Red Cell Morto si vedrà nel canale PI, e sarà cerchiata in rosso.
16. Cellule contate sia nel canale rosso e verde saranno cerchiato in giallo, significa che la cellula esprime GFP, ma è anche macchiata di PI ed è quindi morto.
17. Occasionalmente, cerchi neri apparirà sullo schermo, questi sono oggetti che sono stati identificati, ma sono stati esclusi dall'analisi in base alle dimensioni delle celle.
18. Continuare a fine regolare la soglia sull'istogramma fluorescenza utilizzando la procedura appena descritta finché ogni cellula che sta esprimendo la fluorescenza è cerchiato con il colore appropriato.
19. Tutti i parametri di analisi vengono automaticamente salvate nella scheda di dati. Il citometro Tali grado di memorizzare file di dati da circa 500 corre campione.
20. Ogni file memorizzato nella scheda sono disponibili dati per rianalisi. Selezionando il file dalla scheda Dati sarà aperto e tutti gli istogrammi e livelli diventano attivi.
21. Per archiviare i dati e generare report, i dati memorizzati nel citometro possono essere trasferiti ad un computer tramite un drive USB.

4. Rappresentante dei risultati:

La Image-Based Tali Citometro è stato utilizzato per misurare il livello di espressione della proteina fluorescente in cellule che sono state trasdotte con un nucleare mirata espressione GFP BacMam costruire 2.0. Quattro tipi di cellule rappresentative trasdotte (U2OS, 293MSR, HEKn e CHO-S).Per queste linee cellulari, il numero di cellule che si esprimono GFP è stato riportato dal citometro Tali e confrontati con i dati stessi campioni analizzati su un citometro a flusso. Inoltre, le cellule sono state colorate con il reagente di Red Dead cella utilizzando il kit Viability Tali per identificare la popolazione cellulare sia morto sul citometro Tali e su un citofluorimetro.

Le rappresentazioni grafiche in Figura 2 mostrano la percentuale della popolazione totale per ogni tipo di cellula che stavano esprimendo GFP. Questi dati dimostrano che il citometro produce Tali dati comparabili ai dati generati da un citofluorimetro.

Figura 1. Le cellule devono essere correttamente a fuoco prima dell'analisi. Diapositive Analisi Tali Cellulare con concentrazioni di cella appropriata per l'analisi (1 x 10 ⁵ a 1 x 10 ⁷ cellule sono consigliati). (SINISTRA) a fuoco le cellule sono uniformemente darca in tutta la cellula, con un alone luminoso attorno ad ogni cellula Cellule. (CENTRO) può essere sottostimata quando la transizione tra lo sfondo ei bordi delle celle sono sfocate e le cellule hanno confini indefiniti (DESTRA) Cellule forse overcounted quando hanno luminoso centri e perimetri buio.

Figura 2. Espressione della proteina fluorescente dati dal citometro Tali Image-Based è paragonabile a quella ottenuta con citometria a flusso. Un side-by-side di confronto calcolato GFP-espressione risultati in 4 diverse linee cellulari di cellule vitali.

Discussione

Abbiamo appena una procedura dettagliata per eseguire conteggi vitalità e valutare l'espressione della GFP con il Image-Based Tali Citometro. Utilizzando la stessa procedura, questa citometro è in grado di eseguire una serie di altri test, tra cui: l'apoptosi viabilità, RFP e cella di analisi utilizzando non cellule trasdotte.

Analisi fluorimetrica di vitalità cellulare, apoptosi e l'espressione genica sono diventate metodologie chiave nella ricerca biomedica ^7-12. In passato, la strumentazione a parte è stato utilizzato per ottenere informazioni quantitative e visivi sulle cellule. Mentre le informazioni quantitative sulle cellule all'interno di una popolazione eterogenea è stato ottenuto tramite l'uso di citometria a flusso, le informazioni visive o qualitative sono state raccolte attraverso l'utilizzo della microscopia a fluorescenza ^1-4. Qui vi presentiamo una tecnologia che colma il divario tra popolazione e studi sulle cellule individuali. Utilizzando la Image-Based Tali Citometro, quantitativo data dati di celle e visive di singole cellule o popolazioni di cellule possono essere raccolte contemporaneamente. Tali Lo strumento può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni compresa la valutazione dell'espressione genica, test di apoptosi, gli studi di efficacia dei farmaci e la valutazione della progressione della malattia.

La Image-Based Tali cattura e analisi Citometro campo chiaro, fluorescenza rossa e verde immagini di fluorescenza, permettendo informazioni su sottopopolazioni di cellule da ottenere. Per esempio, in questo saggio, siamo stati in grado di distinguere le cellule morte da cellule vive all'interno della GFP che esprimono popolazione di cellule utilizzando Morto colorante Red Cell. Questo dà la precisione nella misurazione di cellule vitali che esprimono GFP, e identifica la popolazione di cellule utilizzabili per la lavorazione a valle. E 'importante notare che le cellule morte nella popolazione potrebbe derivare da varie fonti, tra cui la morte delle cellule normali in coltura o morte cellulare causato da condizioni ambientali (ad esempio, tripsinizzazione o death indotta dalla trasfezione / trasduzione metodo scelto).

Qui mostriamo l'uso del citometro Tali U2OS con le cellule. Metodi simili possono essere eseguite utilizzando maggior parte delle cellule di mammiferi e insetti. Per ogni linea cellulare, il citometro Tali prodotti quantitativa dei dati di espressione GFP, che non è possibile con un controllo visivo delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza di serie. Anche se questi risultati sono paragonabili a citometria a flusso, sono raccolti in una frazione del tempo. Il citometro è in grado di contare con precisione le cellule da 5 micron a 60 micron di diametro, idealmente a una concentrazione di 1 x 10 ⁵ a 1 x 10 ⁷ cellule / ml.

E 'importante sottolineare che la maggior parte dei protocolli di colorazione standard, tra cui il Morto il protocollo di colorazione Red Cell qui descritte, utilizzare lo ioduro di propidio per distinguere le cellule vive e morte. Questo rappresenta una sfida per valutare la vitalità delle cellule che sono state permeabilizzate per staining dei markers intracellulari, dal momento che PI si macchia una cella con una membrana compromesso. Dal momento che qualsiasi colorante fluorescente o proteine ​​che possono essere rilevati con i canali verde o rosso fluorescenza possono essere analizzati sulla Image-Based Citometro Tali, gli studi futuri possono esplorare l'uso di coloranti alternativi, come amine coloranti vitalità reattiva ^4. Uno studio del 2006 da parte Perfetto et al. ¹² trovati questi coloranti per essere facile da usare e riproducibili nel discriminare popolazioni cellulari vivi e morti.

Si noti che la Tali ha delle limitazioni rispetto alle tipologie di test si può eseguire. Per esempio, poiché l'obiettivo utilizzato dallo strumento è 4X, le operazioni di conteggio sono limitati a tipi di cellule più grandi: le strutture sub-cellulari come i mitocondri o vescicole, e le cellule batteriche non può essere quantificato. Si noti inoltre che i canali di rilevamento in Tali sono limitati a fluorofori che si eccitano ed emettono all'interno dei canali. Mentre YFP e luminoso mCherry segnali cuno da rilevare, dimmer segnali mCherry non può. Infine, l'analisi Tali solo le cellule in sospensione. Non sarà accuratamente contare le cellule che aderiscono a una diapositiva. Inoltre, mentre c'è solo capacità limitata per il conteggio delle cellule che sono di forma irregolare, tra cui alcuni lieviti e cellule primarie.

Inoltre, studi futuri è probabile che trattano l'uso di questo sistema per valutare l'espressione di marcatori intracellulare. Coloranti individuali possono essere controllati per sovrapposizione spettrale con canali adiacenti, utilizzando uno strumento online SpectraViewer Invitrogen ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). Data la novità di questa tecnologia, la gamma completa di applicazioni è ancora da scoprire.

In sintesi, l'immagine-Based Tali Citometro dimostrato qui presenta una nuova tecnologia che consente la visualizzazione simultanea e l'analisi delle popolazioni di cellule, consentendo la valutazione delle singole cellule e cell popolazioni in un formato compatto, con un flusso di lavoro semplice.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
Tali Image-Based Citometro	Invitrogen	T10796
Tali diapositive analisi cellulare, 50 diapositive	Invitrogen	T10794
Tali diapositive analisi cellulare, 500 diapositive	Invitrogen	T10795
Tali kit di Fattibilità - Red Cell Morto	Invitrogen	A10786
Tali kit di Fattibilità - Verde cellule morte	Invitrogen	A10787
Tali Apoptosis Kit	Invitrogen	A10788
U2OS cellule