Creazione transitori pori della membrana cellulare utilizzando una stampante a getto d'inchiostro standard

Riepilogo

Una descrizione dei metodi utilizzati per convertire un HP DeskJet 500 stampante in un bioprinter. La stampante è in grado di elaborare le cellule viventi, che provoca transitori pori nella membrana. Questi pori possono essere utilizzati per incorporare piccole molecole, tra cui fluorescente G-actina e nelle cellule stampati.

Abstract

Bioprinting ha una vasta gamma di applicazioni e di significato, compresa l'ingegneria tessutale, terapie dirette applicazione di cellule e microfabbricazione biosensore. ^1-10 Recentemente, la stampa a getto d'inchiostro termico è stato utilizzato anche per la trasfezione genica. ^8,9 Il processo di stampa termica a getto d'inchiostro è stato dimostrato che temporaneamente interrompere le membrane cellulari senza compromettere la vitalità cellulare. I pori transitori della membrana può essere utilizzato per introdurre molecole, che altrimenti sarebbero troppo grande per passare attraverso la membrana, nel citoplasma cellulare. ^8,9,11

L'applicazione viene mostrato qui è l'uso di stampa a getto d'inchiostro termica per l'incorporazione di fluorescente g-actina monomeri in cellule. Il vantaggio di utilizzare termica a getto di inchiostro per iniettare molecole nelle cellule è che la tecnica è relativamente benigna alle cellule. ^{8, 12} La vitalità cellulare dopo che la stampa è stata dimostrata simile alla cella PLA normaMetodi Ting ^1,8. Inoltre, stampa a getto d'inchiostro in grado di elaborare migliaia di cellule in pochi minuti, che è molto più veloce microiniezione manuale. I pori creati dalla stampa hanno dimostrato di chiudere entro circa due ore. Tuttavia, esiste un limite alla dimensione del poro creato (~ 10 nm) con questa tecnica di stampa, che limita la tecnica di iniezione di cellule con piccole proteine ​​e / o particelle. ^8,9,11

Uno standard HP DeskJet 500 stampante è stato modificato per consentire la stampa cella. ^{3, 5, 8} Il coperchio della stampante è stato rimosso e il meccanismo di alimentazione della carta è bypassato mediante una leva meccanica. Una fase è stata creata per consentire il posizionamento di vetrini da microscopio e vetrini coprioggetti direttamente sotto la testina di stampa. Cartucce d'inchiostro sono stati aperti, l'inchiostro è stato rimosso e sono stati ripuliti prima dell'uso con le cellule. Il modello di stampa è stato creato con software standard di disegno, che poi controllato la stampante tramite un semplice comando di stampa. 3T3 fibroblasti sono state coltivate a confluenza, tripsinizzate, e quindi risospese in soluzione salina tamponata con fosfato solubili fluorescente g-actina monomeri. La sospensione cellulare è stata pipettano nella cartuccia d'inchiostro e linee di cellule sono state stampate su scivola microscopio in vetro di copertura. Le cellule vive sono stati ripresi utilizzando microscopia a fluorescenza e actina è stata trovata nel citoplasma. L'incorporazione di actina fluorescente nella cella permette l'imaging di dinamica citoscheletrici breve tempo ed è utile per una vasta gamma di applicazioni. ^13-15

Protocollo

1. Conversione del HP DeskJet 500

Occorre notare che questa tecnica dovrebbe funzionare con molte stampanti a getto d'inchiostro commercialmente. Tuttavia, le vecchie stampanti tendono a lavorare meglio come usano cartucce con ugelli di diametro maggiore, che non intasare la stessa facilità. Inoltre, le vecchie stampanti tendono ad usare sensori meccanici di alimentazione della carta che sono più facili da ignorare. Le stampanti con sensori ottici possono essere ingannati, ma con una piccola striscia di carta sul bordo opposto della stampante durante ogni ciclo, ma è un po 'più difficile che il sistema meccanico di "trucco". Le stampanti attualmente disponibili in commercio che funzionano meglio sono a bassa risoluzione (DPI).

Stampanti ad alta risoluzione tendono a intasare più facilmente. La risoluzione della HP Deskjet 500 è 300 DPI. Ci sono molte stampanti disponibili in commercio (HP Deskjet serie e altri) che hanno una risoluzione di 600 DPI. Questo tipo di stampante può essere utilizzata con solo un piccolo aumento di ugellointasamento problemi che possono essere alleviati con la pulizia accurata (sezione 3).

1. Togliere il coperchio superiore in plastica della stampante sbloccando diversi clip di plastica dalla base inferiore della stampante e lentamente sollevando la parte superiore off.
2. Svitare il pulsante / display del pannello di luce dall'alto della stampante, lasciandolo collegato alla scheda madre della stampante.
3. Pulire l'interno della stampante, in particolare le zone in cui la cartuccia d'inchiostro poggia e dove avviene la stampa.
4. Individuare i cavi che alimentano i meccanismi di alimentazione della carta e staccare la spina dalla scheda madre.
   1. Nella HP DeskJet 500, questi si trovano proprio sotto il vassoio verso sinistra anteriore.
5. Individuare meccanismo di rilevamento della carta. Bypass il meccanismo mediante apposizione di una stringa o un anello di filo di servire come una maniglia manuale.
   1. Nel HP DeskJet 500, il meccanismo di rilevamento della carta è una leva di plastica grigia trovato sopra e dietro la stampa / carta meccanismo di alimentazione.
6. Creazione di una fase di fronte al meccanismo di alimentazione della carta (dove la carta verrebbe alimentato da e depositati) per portare i vetrini di stampa desiderato ad un livello appena sotto la testina di stampa della cartuccia.
   1. Per i nostri esperimenti, il titolare di spedizione schiuma per provette da 15 ml per centrifuga è stato utilizzato con vetrini per microscopio diversi registrate in atto nella regione di stampa per portare il livello finale delle diapositive fino all'altezza desiderata.
7. Per mantenere una tecnica asettica, la stampante può essere inserito all'interno di un armadio standard di rischio biologico o cappa da tavolo flusso laminare.
8. È importante notare che modificando un disponibile in commercio a getto d'inchiostro di solito decadere garanzia produttore della stampante.

2. Conversione archivio cartucce d'inchiostro HP (HP 26 cartuccia di inchiostro nero)

1. Estrarre la cartuccia dalla confezione, lasciando il nastro protettivo che copre i contatti della stampante e testina di stampa per il momento.
2. Stabilizzare il corpodella cartuccia (parte nera) o con una pinza o morsa (semplicemente afferrando saldamente la cartuccia a mano di solito lavora pure), lasciando il verde chiaro superiore di qualsiasi ostacolo.
3. Con una pinza o una chiave regolabile, afferrare la parte superiore verde della cartuccia e girare avanti e indietro diverse volte fino a quando non si libera.
   1. Questo non dovrebbe prendere molta forza, ma la cima non è più necessario, quindi va bene se si rompe durante la rimozione.
4. Utilizzando cacciaviti, Scalzare il pezzo di plastica trasparente ora esposti.
   1. Ancora una volta, questo non dovrebbe assumere molta forza, ma non sarà necessario, quindi è bene se si rompe durante la rimozione.
5. Svuotare ogni residuo dal serbatoio.
6. Rimuovere il nastro di plastica protettiva che copre i contatti della stampante e testina di stampa.
7. Lavare i serbatoi con l'acqua.
   1. Utilizzare una pipetta o una siringa per spingere l'acqua attraverso i canali.
   2. Acqua probabilmente fuoriuscire dalla testina di stampa durantequesto processo, questo è accettabile, e non causa danni alla funzionalità della cartuccia.
8. Quando l'acqua scorre chiara, permettono la cartuccia asciugare.

3. Cartuccia di pulizia inchiostro

1. Per mantenere un ambiente pulito di stampa, la cartuccia d'inchiostro deve essere pulito prima e dopo l'uso.
   1. Questo aiuta anche evitare cristallizzazione di sali e altro materiale biologico nella cartuccia che potrebbe causare ostruzioni.
2. Immergere completamente la cartuccia in un bicchiere pieno di acqua deionizzata, e ultrasuoni per 15 minuti prima e dopo la stampa.
3. Dopo sonicazione, rimuovere la cartuccia dall'acqua, e scuotere l'acqua in eccesso.
4. Spray etanolo al 70% nella cartuccia per creare un ambiente più asettico.
   1. Assicurarsi che l'etanolo è asciugata prima di aggiungere la soluzione di stampa bioink.

4. Fare sospensione cellulare - "Bioinchiostro "

1. Cellule di coltura fino al momento di passaggio.
   1. Per fibroblasti 3T3: le cellule semi su T-75 palloni a circa 1.3x10 ⁴ cellule / cm ² a Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS). Cellule di coltura per due giorni in un incubatore a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Fai fluorescente g-actina soluzione madre alla concentrazione di 50 ug / ml in tampone fosfato (PBS).
3. Passage cellule.
   1. Per fibroblasti 3T3: Rimuovere i supporti dal pallone e lavare due volte con PBS. Coprire le cellule con 5 ml 0,25% tripsina + EDTA e incubare per 5 minuti.
   2. Aggiungere 5 ml di mezzo fresco e pipettare la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml centrifuga conica e centrifugare a 1000 rpm per 5 min. Aspirare speso media.
4. Risospendere le cellule in PBS con quelle fluorescenti g-actina soluzione madre per creare bioink.
   1. Bioink dovrebbe avere una concentrazione finale di g-actina di 10 ug / ml e un co cellulancentration di 1x10 ⁵ cellule / ml. Questa concentrazione è stata ottimizzata per limitare la quantità di cellule per goccia e intasamento della testina di stampa. ⁸
   2. Si noti che 250 pl di bioink stampa tre vetrini coprioggetto con il disegno illustrato nella figura 2.

5. Bioprinting

1. Accendere la stampante e lasciate scaldare.
2. Posizionare desiderata superficie di stampa (qui, usiamo 22 mm x 22 mm coprioggetti) al centro della scena preparato nella fase 1,6.
3. Creare un file di configurazione di stampa.
   1. Apri Microsoft Word (o qualsiasi altro software di disegno), e disegnare il modello desiderato.
   2. Scegli un modello di stampa desiderato per la stampa delle cellule nel file premade.
4. Caricare la cartuccia preparata con sospensione cellulare desiderato.
   1. Sospensione con pipetta nelle piccole e circolare nella parte inferiore del vano cartuccia. Utilizzare circa 100-120 ml di soluzione. Le dimensioni delle gocce di stampa è di circa 130⁸ picolitri.
5. Stampa il file con la HP Deskjet 500 Printer.
   1. Per i migliori risultati, stampare piccoli motivi più volte (5), cambiando la quantità di copie desiderato nel programma di elaborazione testi.
6. Stampante si riscalda di nuovo, poi la cartuccia si sposterà nella "posizione pronto".
7. Quando la cartuccia si sposta nella posizione di pronto (leggermente a sinistra della goccia d'inchiostro ben al di sotto e rimane lì), tirare il filo meccanismo di alimentazione della carta e la stampa deve iniziare.
   1. Per copie multiple di stampa, il meccanismo di alimentazione della carta dovrà essere rilasciato dopo ogni ciclo o pagina stampata. La cartuccia viene poi tornare alla posizione di "ready", e il filo di alimentazione della carta meccanismo dovrebbe essere nuovamente sollevata.
8. La stampante stampa sul vetrino coprioggetti posto al centro della fase di stampa nella fase 5,2 (vedi Figura 2).

6. Risultati rappresentativi

I risultati rappresentativi del processo di conversione di una norma, off-the-shelf HP Deskjet 500, standard HP 26 cartucce della serie creerà una stampante con la possibilità di soluzioni di stampa cellulari per molti tipi di analisi, come detto prima. La stampante completato dopo la conversione è mostrata in figura 3, con una fase di stampa per posizionare il coprioggetto sul microscopio. La stampante può essere utili in analisi in molti campi, inclusi ma non limitati a: meccanica singola cella, ingegneria tessutale, trasfezione del gene, micropatterning biosensore e terapie cellulari diretti ^{1-10, 16-22.}

In questo esempio, uno HP Deskjet 500 stampante HP 26 e cartucce d'inchiostro serie sono stati modificati per bioprinting. Usando questa configurazione della stampante con una bioink costituita da una sospensione cellulare in un fibroblasto g-actina soluzione di monomero, le cellule sono state stampate su vetrini coprioggetto per microscopio in vetro. Figura 1 illustra res rappresentativi ÜLTS di cellule di fibroblasti stampati, che mostrano incorporati monomeri di actina fluorescenti. I risultati sono stati ottenuti in un ambiente controllato asettico in cui sono stampate le cellule in schemi personalizzabili.

Il modello usato in questo esempio è stato creato in Microsoft Word (Figura 2). Questo modello ha creato una linea continua della soluzione di stampa attraverso la maggior parte del vetrino da microscopio. Figura 4 mostra la retta in cui la bioink e le cellule sono reciprocamente depositati. Si noti che immediatamente dopo la stampa, vi è un aumento di fluorescenza di fondo perché la soluzione bioink, in cui sono sospese le cellule, contiene monomeri liberi eccesso actina fluorescenti. Questa fluorescenza di fondo diminuisce significativamente dopo l'aggiunta di mezzi di crescita sulle cellule (Figura 1), che lava monomero in eccesso dal substrato.

ad/3681/3681fig1.jpg "/>
Figura 1. Immagini rappresentative di fibroblasti 3T3 3 ore dopo la stampa con la stampante a getto d'inchiostro modificate. L'interno delle cellule mostrano incorporati monomeri di actina fluorescente tag. Barre di scala rappresentano 50 micron.

Figura 2. Di progettazione utilizzati per la stampa bioink.

Figura 3. Stampa dopo la conversione con stadio Styrofoam. Il filo arancione in mezzo bypassa il feed sensore della carta leva.

Figura 4. Immagine rappresentativa di fibroblasti 3T3 stampati in una zona localizzata di stampa. Microscopia immagine presa 5 minuti dopo la stampa di ingrandimenti a 20x.

/ Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg "/>
Figura 5. Immagine di fluorescenza (ingrandimento 40x) preso 3 ore dopo la stampa mostrando un fibroblasto con interiorizzate monomeri di actina fluorescenti. Barra della scala rappresenta 50 micron.

Figura 6. Microscopia fluorescente (20x) di una cellula presa 15 minuti dopo la stampa. L'immagine mostra sia g-actina (verde) e il nucleo (blu). Da sinistra a destra: g-actina con Alexa Fluor 488, nucleo con DAPI, e una sovrapposizione di entrambi.

Figura 7. Microscopia fluorescente mostra due fibroblasti in un modello di linea 3 ore dopo la stampa. Immagine a sinistra mostra monomeri di actina fluorescente all'interno delle cellule. Immagine a destra è una sovrapposizione del canale fluorescente con l'immagine di sfondo per mostrare che, sebbeneci possono essere alcuni detriti sul vetrino (in basso a sinistra), non è fluorescente. Barre di scala rappresentano 50 micron, se non indicato taglia l'estrema destra è un gruppo di controllo non-stampati cellule incubate per 3 ore con monomeri fluorescente tag. Questo controllo è quello di mostrare che i monomeri non poteva penetrare la membrana cellulare, senza permeabilizzazione della membrana cellulare dalla stampa.

Discussione

Il processo di convertire un normale stampante a getto d'inchiostro per bioprinting non è particolarmente difficile. Il passo più difficile è determinare il modo per bypassare il meccanismo di alimentazione della carta, che dipende dalla marca e il modello della stampante utilizzata. Tuttavia, questo è relativamente semplice, quando il sensore alimentazione carta è di tipo meccanico come qui descritto. Per i modelli con sensori ottici di alimentazione, altre tecniche potrebbe essere necessario essere impiegati per ingannare la stampante a pensare che sta usando la carta, per esempio, si può eseguire un piccolo pezzo di carta attraverso la stampante durante la stampa sul vetrino da microscopio. Bypassare il meccanismo di alimentazione della carta è probabilmente il passo più difficile l'applicazione di tali procedure per differenti modelli di stampante.

Quando si realizza uno stadio per contenere i coprioggetti per la stampa, è importante assicurare un corretto allineamento e altezza. La fase dovrebbe consentire la coprioggetto da essere collocato al centro dell'area di stampa. Inoltre, dovrebbe place del vetrino ad una altezza sufficiente per permettere l'autorizzazione per la cartuccia di stampa a passare alla diapositiva, senza turbarlo. L'altezza esatta della fase dipenderà dal modello di stampante.

Per assicurare che le cellule stampati non viene lavato via, i vetrini sono stati posti in un incubatore immediatamente dopo la stampa per circa 30 minuti per permettere l'adesione delle cellule prima di ulteriori mezzi di crescita delle cellule è stato aggiunto. Poiché le cellule sono state stampate in una soluzione che contiene grandi quantità di PBS delle cellule non seccano e rimasti vitali. Le cellule sono state ripreso utilizzando microscopia a fluorescenza per visualizzare la distribuzione dei tag g-actina monomeri all'interno della cella (figure 1, 5-7). Quando si stampa con fibroblasti 3T3, la figura 5 mostra un risultato rappresentativo, con l'actina causando gran parte della cella di fluorescenza, ma mostra linee di maggiore luminosità. L'incorporazione di fluorescenza con tag g-actina nel citoscheletro èutile per lo studio della dinamica citoscheletrici e meccanica cellulari. ^12-15 Un limite di questa tecnica è che è applicabile solo per le molecole e proteine ​​che hanno diametri inferiori a circa 10 nm.

Per garantire che le cellule sono state effettivamente elaborato dalla stampante convertito, DAPI (1:5000 in PBS) è stato aggiunto al bioink in luogo della metà del volume di PBS puro. Il colorante fluorescente DAPI lega a porzioni di amminoacidi ricchi di DNA che si trova nel nucleo. Pertanto DAPI è utile in una macchia fluorescente nuclei delle cellule immagini stampate. Figura 6 mostra una immagine rappresentativa di una cella di visualizzazione sia Fluor Alexa 488 (actina) e DAPI (nucleo) fluorescenza con un'immagine sovrapposizione di entrambi. Figura 7 illustra anche come le cellule fluorescenza quando le g-actina monomeri sono stati inseriti, mentre non materiale biologico che è stato depositato nel campione non emette fluorescenza a causa del absence g-actina di monomeri.

Una considerazione importante per bioprinting è il mezzo acquoso e utilizzate per bioink. Si è riscontrato che l'uso di normali mezzi di crescita delle cellule con il siero prodotto risultati inconsistenti. Ciò è probabilmente dovuto a intasamento delle ugelli della testina di stampa da parte di proteine ​​del siero. L'uso di PBS aumentato la consistenza di motivi stampati e il numero di cellule depositato. Uno svantaggio dell'utilizzo PBS è che le cellule non dovrebbe essere lasciato in sospensione per periodi di tempo prolungati. Tuttavia, fibroblasti in questi esempi sono stati in grado di tollerare le condizioni bioink per almeno un'ora senza modifica vitalità cellulare. Ciò è coerente con diversi ritrovamenti precedenti, che riportano stampati che le cellule con meccanismi a getto d'inchiostro termico hanno dimostrato di avere tassi di redditività elevati. ^2-8

Questa configurazione della stampante modificato potrà essere utilizzato per applicazioni diverse da stampa cell. ^16-22 proteine ​​della matrice, come il collagene o fibronectin, possono essere facilmente stampati su substrati con questa tecnica, che può essere utile per patterning cella. Ad esempio, collagene di tipo I stampato in modelli di linea si tradurrà in substrati collagene allineati che possono essere utilizzati per studi in vitro hanno. ¹⁷ Oltre alle proteine ​​della matrice, molecole, compresi fattori di crescita, può essere localizzato in modo affidabile su substrati per studi cellulari e potenziali applicazioni terapeutiche ^18.

Una limitazione importante della progettazione descritta nei passaggi precedenti è che la stampante non è in grado di stampare in più di una dimensione. Questo limita la possibilità di utilizzo in applicazioni modellate come la stampa scaffold. Per consentire la stampa 3D, una fase specializzato deve essere usato. La fase deve avere regolazioni in altezza incrementali per layer-by-layer deposizione di bioink.

Bioprinting ha mostrato risultati promettenti come un metodo efficace e conveniente per l'ingegneria tissutale, Gene trasfezione, micropatterning e microarray fabbricazione ^{1-12, 16-22} Le applicazioni future di questo tipo di dispositivo sono molteplici, tra cui:. Creazione di controllate e modellata microambienti cellulari, l'incorporazione di macromolecole nel citoplasma delle cellule, e deposizione di cellule su ponteggi e strutture che non presenti in natura o in modo efficiente.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
HP DeskJet 500	Hewlett-Packard	C2106A	Fuori dal produttore. Acquistato ristrutturato Trader dicembre
HP 26 Cartuccia inchiostro nero	Hewlett-Packard	51626A
Actin dal muscolo di coniglio, coniugato con Alexa Fluor 488, 200 mcg	Invitrogen	A12373
Soluzione tampone fosfato (PBS)	MP Biomedicals	ICN1860454
Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Scientific	SH3002201
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	F4135
Amfotericina B	Sigma-Aldrich	A2942	Utilizzato al 0,5% in terreni di coltura cellulare
Penicillina-Streptomicina	Sigma-Aldrich	P4333	Utilizzato al 0,5% in terreni di coltura cellulare
Flusso unidirezionale Clean Bench	Envirco	VLF 797	Alloggiamento opzionale per mantenere stampante asettica