Rilevamento di aspergillosi polmonare in pazienti con neoplasie ematologiche maligne utilizzando la tecnologia a flusso laterale

Riepilogo

Una rapida e accurata point-of-care test per aspergillosi polmonare è presentato. Esso si avvale di flusso laterale tecnologia utilizza uno specifico anticorpo monoclonale che si lega ad uno Aspergillus secreto durante le infezioni polmonari. Il saggio è compatibile con lavaggio siero e brochoalveolar e rappresenta un nuovo test aggiunta per la diagnosi della malattia.

Abstract

L'aspergillosi polmonare invasiva (IPA) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nei pazienti con neoplasie ematologiche e staminali ematopoietiche riceventi trapianto di cellule ^1. Rilevamento di IPA rappresenta una sfida formidabile diagnostica e, in assenza di un 'gold standard', si basa su una combinazione di dati clinici e di microbiologia e istopatologia, ove possibile. La diagnosi di IPA devono essere conformi alla Organizzazione Europea per la Ricerca e la Cura del Cancro e l'Istituto Nazionale di Allergologia e Malattie Infettive Micologia Study Group (EORTC / MSG) la definizione di un consenso "provato", "probabile", e "possibile" malattie fungine invasive ² . Attualmente, non a base di acido nucleico prove sono state esternamente convalidato di rilevazione IPA e quindi la reazione a catena della polimerasi (PCR) non è incluso nelle attuali EORTC / MSG criteri diagnostici.

Identificazione di Aspergillus in sezioni istologiche è problematico a causa di Simiirregolarità in morfologie ifali con altri patogeni fungine invasive ^3, e l'identificazione comprovata richiede l'isolamento dell'agente eziologico in coltura pura. Cultura approcci basati contare sulla disponibilità di campioni di biopsia, ma questi non sono sempre accessibili in pazienti malati, e non sempre producono propaguli vitali per la cultura se sono stati ottenuti.

Una caratteristica importante nella patogenesi di Aspergillus è angio-invasione, una caratteristica che fornisce la possibilità di monitorare il fungo immunologicamente con test che rilevano le firme caratteristiche antigeniche molecole nel siero e nel lavaggio broncoalveolare (BAL) fluidi. Questo ha portato allo sviluppo del immunoenzimatico Platelia (GM-EIA) che rileva Aspergillus galattomannano e un saggio 'pan-fungini' (test Fungitell) che rileva il conservato fungina componente della parete cellulare (1 → 3)-β-D- glucano, ma non nelle Mucorales che non hanno tale componente in ^1,4 loro pareti cellulari. Ècita che circonda l'accuratezza di questi test ^1,4-6 ha portato al recente sviluppo della prossima generazione di anticorpi monoclonali (MAb) basati su saggi in grado di rilevare marker surrogati di infezione ^1,5.

Thornton ⁵ recentemente descritta la generazione di un Aspergillus-MAb specifico (JF5) usando la tecnologia degli ibridomi e suo uso per sviluppare un immunocromatografico a flusso laterale dispositivo (LFD) per la point-of-care (POC) diagnosi di IPA. Un importante vantaggio della LFD è la capacità di rilevare l'attività dal MAb JF5 lega ad un antigene glicoproteina extracellulare che viene secreto durante la crescita attiva del fungo solo ^5. Questa è una considerazione importante quando si utilizza fluidi come BAL polmonare per la diagnosi di IPA in quanto le spore di Aspergillus sono una componente comune di aria inalata. L'utilità del dispositivo nella diagnosi IPA è stata dimostrata utilizzando un modello animale di infezione, in cui il LFD visualizzato sensibilità e specificity rispetto al GM Platelia e Fungitell (1 → 3)-β-D-glucano saggi ^7.

Qui vi presentiamo una semplice procedura LFD per rilevare l'antigene Aspergillus nel siero e fluidi umani BAL. La sua velocità e la precisione fornisce una nuova aggiunta point-of-care test per la diagnosi di IPA nei pazienti con neoplasie ematologiche maligne.

Protocollo

1. Raccolta, conservazione e preparazione dei liquidi di lavaggio broncoalveolare di siero e

1. Raccogliere siero da campioni di sangue non trattati consentendo coagulazione a 4 ° C, e siero negozio come aliquote a -20 ° C prima dell'uso. Liquidi di lavaggio broncoalveolare (BAL) dovrebbero essere memorizzati come aliquote a -20 ° C. Nota: Stoccaggio di siero e BAL come aliquote limita il potenziale di degradazione della antigene bersaglio da ripetuti di congelamento-scongelamento dei campioni durante la ripetizione del test.
2. Scongelare i campioni e mescolare i campioni di siero e BAL accuratamente su vortex e centrifugare per 1 min a 14.000 rpm.
3. Per le prove di routine di campioni di siero umano, diluire il siero 1:01 (v / v) con mezzo di coltura tissutale (TCM). TCM consiste di mezzo RPMI-1640, 10% (v / v) di siero fetale bovino, 1% (v / v) di 200 mM L-glutammina soluzione, e sodio azide (0,02% w / v) come conservante. Il terreno è preparato in anticipo e può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi. Applicare 100 microlitri della diluted il siero LFD.
4. Per fluidi umani BAL, e per i fluidi di BAL modelli animali, si applicano 100 microlitri di campione puro al LFD, senza alcun pre-trattamento.
5. Per il siero da modelli animali, diluire siero 1:2 (v / v) con soluzione salina tamponata con fosfato contenente il 4% (w / v) EDTA, calore per 3 minuti in un bagno di acqua bollente, centrifugare per 5 min a 14.000 rpm, e applicare 100 ul di surnatante pulito al dispositivo LFD.

2. Applicazione di siero e BAL al dispositivo a flusso laterale

1. Conservare il flusso laterale dispositivi a temperatura ambiente (23 ° C). A questa temperatura, dispositivi sono stabili per 12 mesi. Rimuovere i dispositivi dalle loro tasche e posto su una superficie piana.
2. Utilizzando una punta di pipetta sterile, applicare 100 pl di pretrattato campione di siero o pulito BAL alla porta di uscita del dispositivo.
3. Lasciare il saggio a funzionare per 15 min a temperatura ambiente, momento in cui i risultati delle prove devono essere registrati. Nota: In pochi secondi il liquido sarà seen migrare per capillarità lungo la membrana di nitrocellulosa nella finestra di osservazione.

3. Registrazione ed interpretare i risultati LFD

1. La LFD consiste di una linea di controllo interno (indicato con la lettera C sul contenitore in plastica) e una linea di test (indicata con la lettera T). La linea di controllo deve sempre apparire a prescindere di antigene Aspergillus nel campione di siero o BAL. Questo dimostra che il test è stato eseguito correttamente.
2. Se l'antigene Aspergillus è presente nel campione di siero o BAL, la linea di test appariranno anche entro 15 minuti di applicazione del campione. Poiché l'intensità della linea di test è proporzionale alla quantità di antigene presente nel campione Aspergillus, la linea di test può apparire come una debole positivo (+), un moderato positivo (+ +) o come un forte positivo (+ + +) . Tuttavia, qualsiasi linea test positivo, indipendentemente intensità, che indicano la presenza di Aspergillus antigene nel campione. In the l'assenza di antigene Aspergillus, nessuna linea di test apparirà, e il risultato è registrato come negativo (-).

4. Risultati rappresentativi

Esempi rappresentativi di negativo, debolmente positivi, moderatamente positivi risultati positivi, e forte LFD con campioni di BAL e siero sono mostrati nella Figura 1.

I risultati di antigene prove positive di LFD (debole e forte) o negativi test LFD che utilizza fluidi BAL da leucemia mieloide acuta (AML) pazienti diagnosticati secondo EORTC / MSG criteri diagnostici sono riportati nella Tabella 1. Incluso in questa tabella sono i corrispondenti clinici e micologica (galattomannano e cultura) i dati ei risultati di un test specifico Aspergillus-PCR sviluppato presso Ospedale S. Bartolomeo ^8, per ogni paziente. La diagnosi della malattia è basata su fattori dell'ospite (neutropenia, l'uso prolungato di corticosteroidi, il trattamento con altri riconosciuti cellule T immunosuppressants), i criteri clinici e positività GM per il BAL (qui definito come un valore di indice GM> 0,8). Sotto i 2002 EORTC / MSG linee ^10, 12 pazienti, 13 e 16 sono stati diagnosticati con IA 'possibile' sulla base di fattori dell'ospite e dei criteri clinici o positività GM. Secondo le riviste (2008) EORTC / MSG linee ^2, i fattori di accoglienza e positività GM da soli o host fattori e dei criteri clinici da soli non indicherebbe l'infezione 'possibile' fungina invasiva se non accompagnati da documenti giustificativi da dati clinici e micologia, rispettivamente. Paziente 6 è stato diagnosticato un IA 'probabile' in entrambi i 2002 e il 2008 le linee guida a causa di fattori dell'ospite, le caratteristiche cliniche principali e secondarie e positività GM. Si noti che, mentre né il LFD né saggi di PCR sono attualmente inclusi nelle linee guida EORTC / MSG, esiste un accordo forte tra i due test e il test commerciale galattomannano che indicano la presenza di antigeni di Aspergillus e di acido nucleico nel campione BAL s di pazienti 6 e 12. Ulteriori risultati delle prove dimostrano l'efficacia dei saggi PCR LFD e nella diagnosi di IPA si possono trovare in Johnson et al ^8.

Figura 1. Negativo (linea di controllo solo) e positivo (linea di controllo e di prova) i risultati delle prove LFD utilizzando siero e nel BAL. Le intensità di reazioni di linea dei test sono proporzionali alle concentrazioni dell'antigene bersaglio nei campioni di siero e BAL. Le reazioni in genere varia da debole (+) attraverso moderata (+ +) a forte (+ + +). Indipendentemente intensità prova linea, tutte tre le reazioni di siero positivi indicherebbe invasiva aspergillosi malattia polmonare dovuta alla presenza di antigene Aspergillus circolante nel sangue. Positive le reazioni BAL (debole, moderata o forte) sta ad indicare la germinazione delle spore e lo sviluppo di ife potenzialmente patogeni nei polmoni.

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Paziente no.	Patient informazioni	Criteri clinici 1	BAL cultura 2	GM VIA indice 3	EORTC / MSG (2002) 4	EORTC / MSG (2008) 5	Aspergillus PCR risultato	Risultato LFD
6	-	Principali segni CT (nodulo e halo) e una minore	Negativo	0,9 (positivo)	Probabile	Probabile	Positivo	Debolmente positivo (+)
12	Presunto precedente infezione fungina	No major, minor uno	Candida glabrata	6,43 (molto positive)	Possibile	Nessuno	Positivo	Strong positivo (+ + +)
13	Stafilococco coagulasi-negativiylococcus e E. coli nel sangue	No major, minor due	Negativo	0,25 (negativo)	Possibile	Nessuno	Negativo	Negativo (-)
16	Infezioni del torace	3 criteri minori tra nuova effusione plurale infiltrato più	Negativo	0,16 (negativo)	Possibile	Nessuno	Negativo	Negativo (-)

¹ noduli o aloni su una tomografia computerizzata di scansione è suggestivo di infezione fungina
² Candida glabrata nel BAL verrebbe considerato come contaminante in quanto è la seconda più comune lievito isolato come parte della normale flora umani ^9
3 Un indice di> 0,8 nel test GM VIA del BAL è indicativa di infezione da Aspergillus
⁴ Sulla base dei 2002 EORTC / MSG criteri diagnostici per la 'possible ',' probabilmente 'o' provata 'malattia fungina invasiva ^10
5 Sulla base delle riviste (2008) EORTC / MSG criteri diagnostici per la 'possibile', 'probabile' o 'provata' la malattia fungina invasiva ²

Tabella 1. Risultati delle prove LFD di campioni di BAL da pazienti affetti da leucemia mieloide acuta con IPA probabile e dal controllo di pazienti con LMA (nessuna evidenza di infezione), e EORTC / MSG diagnosi di infezione.

Discussione

L'identificazione definitiva di IPA può realmente essere raggiunti mediante isolamento dell'agente eziologico da campioni bioptici, ma il recupero di campioni adeguati spesso non è possibile in pazienti molto malati e Aspergillus è raramente recuperabile dal sangue. Mentre grandi progressi sono stati fatti nell'uso di scansione tomografica computerizzata del torace nella diagnosi IPA, caratteristiche che sono indicativi di IPA polmonare come il "alone" o "mezzaluna" air-segni sono transiente o può essere attribuito ad artefatti respirazione o di altre infezioni fungine ^11,12. Tali dati sono quindi integrati con le tecniche sierologiche che mirano a identificare le molecole di firma (GM e β-glucano) da funghi che circolano nel siero del paziente o che sono presenti nei fluidi BAL, espettorato o ¹³ campioni di urina. Mentre questi test visualizzare sensibilità soddisfacente, mancano di specificità sufficiente o soffrono di interferenze determinate condizioni, ^1,6 .

Il test per la rilevazione di IPA LFD qui presentato permette di diagnosticare il 'point-of-care' della tecnologia IPA ed exploit che è stato utilizzato fino ad oggi nel test per la ricerca di virus, batteri, parassiti e tossine e ^14-19, il più famoso, per il test di gravidanza a casa prima introdotto da Unipath nel 1988. Nella LFD Aspergillus qui descritto, l'Aspergillus-specifico MAb JF5 è immobilizzato a una zona di cattura (linea del test) su una membrana di nitrocellulosa porosa. Immunoglobulina anti-topo immobilizzato alla membrana in una zona separata servito come controllo interno (linea di controllo). In aggiunta di siero o liquido BAL alla porta di rilascio, MAb JF5-coniugato di oro colloidale nel supporto di rilascio lega l'antigene bersaglio e il complesso passa poi lungo la membrana porosa per azione capillare. MAb JF5 immobilizzato nella zona di cattura si lega alla JF5-oro colloidale-antigene complesso risultante in una linea di test rossa. Qualsiasi JF5-oro colloidale non legatoconiugato si lega al controllo interno, che indica che il test è stato eseguito correttamente. Ciò si traduce in una linea di controllo rossa.

Il test è rapido, tenuto a soli 15 minuti per eseguire, è a buon mercato rispetto ai test di siero e BAL a base di GM e β-glucano di rilevamento, e non richiede costose attrezzature o strutture di laboratorio, per l'esecuzione. Inoltre, MAb JF5 non cross-reagiscono con i farmaci o agenti inquinanti che sono stati indicati per causare falso positivo di reazione in GM e β-glucano test ^1,4,6. Un ulteriore vantaggio importante rispetto agli attuali test diagnostici è la capacità di rilevare LFDs attività che è indicativo della crescita invasiva delle specie di Aspergillus.

Un punto critico del procedimento LFD è la necessità di leggere i risultati 15 min dopo l'applicazione del campione di siero o BAL al dispositivo. Il test non deve essere lasciato per più di 15 minuti prima di registrare i risultati, in quanto questo risultato interpretati polarizzazione puòsul. Una reazione debole non sarà rafforzata, estendendo il periodo di incubazione. Il trattamento termico di siero di modelli animali di infezione è stato trovato per migliorare la sensibilità del saggio. Una limitazione del test è che è qualitativa, e si affida al gestore di effettuare una valutazione soggettiva di positività. L'intensità della linea di test varia a seconda del contenuto antigene di campioni di siero e BAL (Figura 1). Tuttavia, qualsiasi reazione positiva (determinata rispetto ai negativi noti) indica la presenza di antigene Aspergillus e quindi l'infezione. Per limitare la soggettività di saggi LFD, dispositivi palmari sono disponibili che consentono la quantificazione delle intensità LFD linea del test e consentire la fissazione di valori soglia per il rilevamento dell'antigene ^20.

Gli sviluppi futuri della direttiva sulle discariche sono la sua commercializzazione e lo sviluppo di un LFD multiplex che permette la rilevazione simultanea di altri agenti patogeni fungine invasiveanticorpi monoclonali altamente specifici utilizzando ^3.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Aspergillus LFD	Università di Exeter		Disponibile presso l'autore corrispondente su richiesta
RPMI-1640	Sigma	R0883
L-Glutammina	Sigma	G7513
Siero fetale di vitello	Biosera	S9100	Altre fonti di siero di vitello fetale possono essere utilizzati nella preparazione di TCM
EDTA	Fisher Scientific	BPE120-1