La coda di test Sospensione

Riepilogo

La coda-sospensione in esame è convalidato come una procedura sperimentale per valutare l'efficacia di trattamenti farmacologici antidepressivi nei topi. I topi sono sospesi per la coda per sei minuti e la fuga comportamenti correlati sono valutati. Si descrivono le modalità utilizzate nella conduzione della prova sospensione coda.

Abstract

La coda-sospensione di prova è un test di topo comportamentale utile per lo screening di potenziali farmaci antidepressivi, e la valutazione di altre manipolazioni che si prevede di influenzare i comportamenti depressione correlati. I topi sono sospesi per la coda con del nastro adesivo, in una posizione tale che non può sfuggire o resistere alle superfici vicine. Durante questa prova, in genere di sei minuti di durata, i comportamenti di fuga risulta orientata sono quantificati. La coda-sospensione di prova è uno strumento prezioso nella scoperta di nuovi farmaci per high-throughput screening di potenziali composti antidepressivi. Qui, descriviamo i dati necessari per l'attuazione di questo test, con ulteriore enfasi sugli eventuali problemi che possono verificarsi e come evitarli. Offriamo inoltre una soluzione al comportamento coda arrampicata, un problema comune che rende questo test inutile, in alcuni ceppi di topo, come il diffuso C57BL / 6. In particolare, evitare la coda dei comportamenti salire passando la coda del mouse di plastica con una piccolacilindro prima della sospensione. Infine, dettaglio come per segnare manualmente i comportamenti che si manifestano in questo test.

Protocollo

1. Materiale

1. Sospensione Box

La coda-sospensione di prova (TST) comporta topi sospensione dal suolo per la coda. Al livello più elementare, la procedura richiede solo una barra di sospensione o sporgenza scaffale, e nastro. Tuttavia, lo sperimentatore dovrebbe considerare l'uso di un fondo che offre un contrasto ottimale. Inoltre, è prudente prendere misure per evitare che i topi da osservare altri animali che sono in fase di test. Nel nostro laboratorio, utilizziamo prodotti specificamente scatole sospensione coda (quattro ore al giorno, Baltimore MD), in plastica con le dimensioni (55 X 60 altezza x larghezza 11,5 cm di profondità). Al fine di evitare che gli animali osservando o interagendo tra loro, ogni mouse è sospeso all'interno della propria tre pareti del vano rettangolare (55 x 15 altezza x larghezza 11,5 cm di profondità). Il mouse è sospeso nel mezzo di questo compartimento e la larghezza e la profondità sono sufficientemente dimensionato in modo che il mouse non si può fare contact con le pareti. In questa impostazione, la distanza approssimativa tra il naso del mouse e il pavimento apparecchio è 20-25 cm. Ci sono quattro compartimenti identici l'apparecchio che consente di testare quattro topi alla volta. Una barra di sospensione in alluminio (1 cm. Altezza X 1 cm. Larghezza x 60 cm. Lunghezza), utilizzato per sospendere la coda di ogni mouse è posizionato sulla parte superiore della scatola. Le dimensioni che usiamo nel nostro laboratorio deve essere considerato come un riferimento generale. Per esempio, la dimensione dei singoli comparti della coda di sospensione box può essere aumentato se un ceppo grande del mouse outbred (ad esempio CD-1) viene utilizzato.

Nella parte inferiore di ogni compartimento abbiamo posto un vassoio estraibile in alluminio che raccoglie le feci o urine dagli animali. Usiamo un box grigio scuro per gli animali albini e una scatola color crema per i topi di colori cappotto altri. Questo accordo ci fornisce un migliore contrasto e quindi più affidabile punteggio comportamentale del test.

2. Nastro

Tape dovrebbero aderire saldamente sia la coda del mouse e la barra di sospensione, e di essere abbastanza forte per sopportare il peso del mouse in fase di test (ad esempio sistemi di etichettatura TimeMed, Inc, Burr Ridge IL, 1,9 cm di larghezza). Tuttavia, il nastro non deve essere eccessivamente appiccicoso quanto al termine della sessione verrà rimosso dalla coda. Abbiamo tagliato 17 cm di frammenti di nastro e mettere un segno di due centimetri da un'estremità. Questo 2 centimetri porzione è stata utilizzata per fissare il nastro per la coda, mentre il restante 15 centimetri è stato utilizzato per la sospensione del mouse.

3. Timer

4. Dispositivo di registrazione video

Una videocamera e un treppiedi (o struttura di supporto) sono necessari. Poiché questo test di solito comporta animali più in fase di sperimentazione allo stesso tempo, segnando dal vivo sarà difficile e non è consigliato. La videocamera dovrebbe registrare in altagh risoluzione sufficiente per rendere un'immagine di qualità che verrà usata in seguito per il punteggio comportamentali. Accertarsi sempre che non vi è memoria sufficiente a registrare la fotocamera prima di iniziare il test. Noi usiamo una videocamera che registra in digitale senza l'utilizzo di supporti fisici (cioè videocassetta), consentendo il trasferimento diretto di video.

5. Generatore di rumore bianco

Il generatore di rumore intermittente deve mascherare i suoni ambientali. L'uso di un generatore di rumore è particolarmente consigliata in ambienti di laboratorio, dove improvvisi rumori forti può essere sentito che sarebbe potenzialmente sussultare topi. Nella nostra stanza sperimentale il livello di rumore ambientale (senza il generatore di rumore bianco attivato) è di circa 60 dB. Il livello sonoro totale con il generatore di rumore bianco attivato nella posizione in cui si svolge il TST è 70-72 dB. Tuttavia, va notato che queste cifre sono forniti come esempio solo, e ogni laboratorio dovrebbe selezionare illivelli di rumore diritto in base al loro ambiente unico e le circostanze.

6. Materiali di pulizia

La casella di sospensione deve essere pulito a fondo dopo ogni sessione con una soluzione di sterilizzazione (ad esempio MB-10, Quip Laboratories Inc., Wilmington, DE, o simili).

7. Climbstoppers (opzionale: dipende dal ceppo utilizzato)

I topi di alcuni ambienti, come ad esempio C57BL / 6, può salire le loro code durante il test ^1. Chiaro cilindri cavi (4 cm di lunghezza, 1,6 centimetri di diametro esterno, 1,3 centimetri di diametro interno, 1,5 grammi) che vengono tagliati a quattro cm di lunghezza (da FourHourDay Inc, Baltimore MD) dal tubo di policarbonato (# 8585K41, McMaster-Carr, Santa Fe Springs , CA) sono disposte intorno le code di topo per evitare la coda come arrampicata comportamento ^2,3. Questi dispositivi possono essere realizzati in qualsiasi laboratorio con strumenti e materiali.

2. Procedure comportamentali

Il design complessivo sperimentale dovrebbe riflettere contrappeso adeguato tra variabili specifiche per l'esperimento. Per esempio, nei nostri esperimenti si cerca di rappresentare ogni gruppo in modo uguale in ogni sessione di TST (cioè, se ci sono quattro gruppi di trattamento, ognuno sarà rappresentata in ogni sessione). Inoltre, le posizioni di topi vengono ruotati in modo tale che i topi da ciascun gruppo di trattamento sono posti in una posizione diversa in ogni sessione.

1. Posizionare la fotocamera in posizione. La fotocamera dovrebbe essere il più vicino possibile al fine di ottenere la massima risoluzione possibile degli animali.
2. Frammenti di nastro che sarà utilizzato durante la sessione deve essere tagliato, marcato, e preparato per la sessione.
3. Avviare il generatore di rumore bianco, se utilizzato, prima che i topi vengono introdotti per la sala prove. Il livello di rumore bianco dovrebbe essere sufficiente per mascherare i rumori esterni. Evitare un alto volume e assicurarsi che lo stesso livello di rumore bianco è usato per tutti gli animali.
4. Portare il unoimals in sala prove. Se la stanza in cui risiedono gli animali e la sala prove sono adiacenti gli uni agli altri con analoghe condizioni ambientali, nessun periodo di acclimatazione può essere necessario. In caso contrario, luogo gli animali in sala prove per un periodo di acclimatazione (in genere almeno un'ora). Essere consapevoli del fatto che gli altri animali collocato nella stessa stanza in grado di percepire stimoli olfattivi e ad ultrasuoni.
5. Se un ceppo noto per scalare la coda, come C57BL6 / J, viene utilizzato Climbstoppers luogo intorno le code prima di applicare il nastro.
6. Rispettare il nastro per le code dei topi. Utilizzare l'estremità marcata del nastro e assicurarsi che il nastro si attacca alla coda e su se stesso. Il nastro deve essere applicato fino alla fine della coda con 2-3 millimetri di coda ancora al di fuori del nastro.
7. Una volta che ogni pezzo di nastro adesivo è attaccato ad una coda di topo bastone la parte centrale del nastro alle pareti interne della gabbia. Questo aiuterà a prevenire grovigli di pezzi nastro per l'altro. Si noti che confinement in questo modo può causare stress e che è importante per completare il processo di applicazione del nastro per ogni animale il più presto possibile.
8. Una volta che il nastro è applicato, avviare la registrazione e identificare la sessione prima che i topi sono sospesi.
9. Sospendere gli animali mettendo l'estremità libera del nastro sulla barra sospensione o una mensola in un ordine che si contrappone tra i gruppi di trattamento. Sospendere i topi in un modo che non ostacoli la vista della telecamera perché la sessione TST intero saranno segnati e ostacolando la fotocamera comportare l'impossibilità di valutare i comportamenti in quel periodo. Verificare che tutte le estremità del nastro sono appesi parallelamente alla barra sospensione o la mensola con una lunghezza simile di lasco per ogni mouse.
10. Al termine della sessione (che è in genere di sei minuti), il ritorno degli animali al homecage e rimuovere il nastro da ogni coda tirandola delicatamente fuori. Non strappare il nastro dalla coda in quanto ciò potrebbe causare dolore al microfonoe.
11. Dopo il ritorno dei topi nella loro stanza colonia scartare il Boli feci e l'urina dalla vasche di raccolta e pulire l'apparato con una soluzione sterilizzante.

3. Analisi del comportamento

1. In generale, il TST è dall'inizio alla fine sei minuti di lunghezza. A differenza di un'altra procedura ampiamente utilizzata efficacia antidepressiva, il test di nuoto forzato, l'intera sessione è segnata. Ciò è dovuto alla generale constatazione che i topi tendono a manifestarsi immobilità all'inizio della TST.
2. Nel nostro laboratorio abbiamo caricare i file video direttamente dalla fotocamera al PC in cui viene condotta l'analisi.
3. Durante l'analisi comportamentale del tempo che trascorre come ogni mouse mobile è misurata. Mentre è possibile misurare il tempo di immobilità direttamente, abbiamo trovato più facile individuare e misurare i movimenti attivi, piuttosto che la mancanza di tali movimenti.
4. L'aspetto più importante del TST analisi comportamentale è l'identificazione consistente del movimentos che sono registrati come persone in buona fede mobilità. Topi, specialmente all'inizio della sessione, i comportamenti che manifestano apertamente di fuga sono legati. Questi includono cercando di raggiungere le mura di apparecchi e la barra di sospensione, scuotendo forte del corpo, e il movimento degli arti simile alla corsa. Questi movimenti costituiscono chiaramente la mobilità. Questi comportamenti poi diminuire e diventare più sottile. Nel nostro piccolo laboratorio che i movimenti sono confinati le zampe anteriori, ma senza il coinvolgimento delle zampe posteriori non sono contati come la mobilità. Inoltre, le oscillazioni del pendolo e come altalene che sono dovuti alla quantità di moto acquisita durante il periodi di mobilità in precedenza, inoltre, non vengono conteggiati come la mobilità.
5. Nel nostro laboratorio usiamo sullo schermo software cronometro per misure di tempo (Xnote cronometro, dnSoft Research Group). Due cronometri separati utilizzati sullo schermo. La prima cronometro conto alla rovescia da 360 secondi e avverte l'osservatore quando il periodo di analisi comportamentale finisce. Il secondo STOpwatch controllata da un osservatore, misura il tempo trascorso mobile. Alcuni software cronometro ha la capacità di assegnare tasti per avviare e interrompere le funzioni, in modo che sullo schermo la tastiera in grado di controllare il cronometro. Invece di una tastiera normale, si usa un dispositivo di input comunemente noto come 'gamepad' di controllare i cronometri.
6. Se c'è più di un topo testati e presenti sullo schermo è una buona idea per coprire gli altri animali in modo che i loro movimenti non distrarre l'osservatore. Questo può essere realizzato utilizzando un'altra finestra del programma o fisicamente coprire i topi altre sullo schermo di carta.
7. Ci possono essere alcune distorsioni che si verificano se l'importo totale del tempo trascorso per la mobilità di un mouse particolare è visibile prima del completamento della sessione di analisi. Se sullo schermo cronometro viene utilizzato, suggeriamo di coprire tutti, ma i decimali millisecondo del cronometro. Coprendo il cronometro l'osservatore conosce solo se il cronometro èattivare o disattivare in qualsiasi momento, ma non conosce il tempo totale trascorso e quindi non può essere influenzata da ogni pregiudizio. Con questo approccio l'osservatore, mentre cieco alle assegnazioni di gruppo degli animali, non avranno un'idea generale del livello di mobilità in ciascun animale.
8. Un test di affidabilità inter deve essere condotto per ogni nuovo osservatore prima di iniziare a raccogliere i dati provenienti da animali di prova. Nel nostro laboratorio ogni nuovo osservatore primi orologi un osservatore esperto, mentre lui o lei è il punteggio. Dopo gli osservatori nuovo guadagno abbastanza fiducia per differenziare mobilità da immobilità, hanno poi punteggio in tempo reale con l'osservatore esperto osservando e segnalando eventuali errori. Una volta che questa fase è completata con successo, i nuovi osservatori analizzerà uno specifico insieme di video TST che manteniamo nel nostro laboratorio a scopo di addestramento. Solo dopo che un alto livello di correlazione tra osservatori si ottiene con l'osservatore esperto fa un investigatore di analizzare i video TST da realiesperimenti. Noi archiviare i dati da queste analisi la formazione di costituire uno standard interno per il laboratorio. Abbiamo osservato differenze tra ceppi nel modo in cui essi esprimono la mobilità (e immobilità) i comportamenti, e il tempo medio immobilità tra i sessi. Quando un nuovo ceppo del mouse, il sesso, o geneticamente modificati modello viene testato in laboratorio, è necessario intraprendere questo nuovo tipo di analisi di affidabilità.

4. Rappresentante Risultati

Abbiamo usato il TST per valutare antidepressivo-quali risposte a terapia con litio in diversi ceppi di topi (Figura 1) ^3. Dettagli sperimentali di questo esperimento sono stati pubblicati a Can et al., 2011 ^3.

Figura 1. Tempo immobilità nel test di coda sospensione dopo somministrazione cronica di litio in cinque ceppi di topi inbred. I topi sono stati gruppo casad, quattro topi per gabbia. I topi nel gruppo terapia con litio chow ricevuto litio contenente 4 g / kg LiCl per tre settimane. Animali di controllo hanno ricevuto cibo identico senza il cloruro di litio. **: P <0.01, ***: p <0,001 denotano un significativo, non appaiati t-test. I dati sono espressi come media ± SEM. n :10-12 animali per gruppo per ogni ceppo. (Figura riprodotta da ^3).

In questo esempio, un effetto del trattamento significativo di litio cronica consegnato negli alimenti è stata osservata solo nei ceppi C57BL/6J e DBA/2J. Negli altri tre ceppi, alcuna diminuzione statisticamente significativa nel tempo immobilità è stata osservata. Questi dati indicano che un antidepressivo, come risposta al trattamento con litio è tensione cronica dipende come è stato osservato anche con altri farmaci antidepressivi ^4-8.

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Discussione

Sviluppo del TST da Steru et al. ⁹ è stato influenzato dal sviluppato in precedenza costretto nuotare prova ^10-12. Simile al test di nuoto forzato, nel TST topi si trovano in una situazione inevitabile, ma moderatamente stressante. La mancanza di comportamento di fuga relativo è considerato immobilità. Come per il test di nuoto forzato, il TST è un test migliore validato per la valutazione dell'efficacia dei farmaci antidepressivi, ma anche utilizzato per valutare gli effetti ambie...

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Materiali