Modello murino di asma indotta da allergene

Riepilogo

Modelli murini sperimentali di asma allergico offrono nuove possibilità per studiare la patogenesi della malattia e lo sviluppo di nuove terapie. Questi modelli sono adatti a fattori di misura che regolano la risposta immunitaria allergica, infiammazione delle vie aeree, e fisiopatologia polmonare.

Abstract

L'asma è una delle principali cause di morbilità e mortalità, che colpisce circa 300 milioni di persone in tutto il mondo. ¹ oltre l'8% della popolazione degli Stati Uniti ha l'asma, con la prevalenza in aumento. ² Come per altre malattie, modelli animali di malattie allergiche delle vie aeree facilitare notevolmente comprensione della fisiopatologia sottostante, aiutare ad identificare potenziali bersagli terapeutici, e permettere sperimentazioni precliniche di possibili nuove terapie. I modelli di malattia delle vie aeree allergica sono stati sviluppati in diverse specie animali, ma i modelli murini sono particolarmente attraente a causa del basso costo, pronta disponibilità, e ben caratterizzati sistema immunitario di questi animali. ³ disponibilità di una varietà di ceppi transgenici aumenta ulteriormente l'attrattiva di questi modelli. ⁴ Qui si descrivono due modelli murini di malattie delle vie aeree allergica, sia ovoalbumina utilizzando come antigene. A seguito di sensibilizzazione iniziale mediante iniezione intraperitoneale, un modello Delivtori la sfida antigene per nebulizzazione, l'altro con consegna intratracheale. Questi due modelli offrono vantaggi complementari, con ogni imitando le caratteristiche principali di asma umana. ⁵

Le caratteristiche principali di asma acuto sono una risposta esagerata delle vie aeree a stimoli come la metacolina (iperresponsività delle vie aeree; AHR) e ricco di infiammazione eosinofila delle vie aeree. Questi sono anche gli effetti di spicco del challenge allergenico nei nostri modelli murini, ^5,6 e descrivere le tecniche per la misurazione di loro e quindi valutare gli effetti della manipolazione sperimentale. In particolare, si descrive sia invasive ⁷ e ⁸ non invasivo tecniche per la misurazione iperreattività delle vie aeree come pure metodi per valutare l'infiltrazione di cellule infiammatorie nelle vie aeree e del polmone. Cellule infiammatorie delle vie aeree vengono raccolti da lavaggio broncoalveolare istopatologia polmonare mentre viene utilizzato per valutare i marcatori di infiammazione in tutto l'organo. Questetecniche forniscono potenti strumenti per studiare l'asma in modi che non sarebbero possibili in esseri umani.

Protocollo

I. sensibilizzazione agli allergeni e Challenge (vedi Figura 1)

A. Per la sfida intratracheale

1. Per la sensibilizzazione iniziale, iniettare maschio o femmina C57BL / 6 o topi BALB / c (6-8 settimane) via intraperitoneale al giorno 0 e anche il giorno 7 con 20 mcg di ovoalbumina (OVA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) emulsionato in 0,2 ml di soluzione salina tamponata fosfato sterile (PBS) contenente 2 mg di idrossido di alluminio (Sigma-Aldrich) oppure idrossido di alluminio con 2 mg in 0,2 ml di PBS sterile come controllo.
2. Challenge con antigene come appropriato (ad esempio, nei giorni 14, 16, 18 e 20). Procedura di sfida segue.
3. Anestetizzare topo con uno intraperitoneale (ip) iniezione di una miscela di ketamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Assicurarsi che il mouse è completamente anestetizzato per almeno 10 min.
4. Operazione di superficie Angolo a 45 gradi o superiore. Posizionare il mouse su questa superficie mantenendo lato ventrale verso l'alto e la testa in alto.
5. Hook thread sotto incisivi anteriori a tenere testa all'indietro. Level le zampe tra di loro per garantire la trachea è diritta e nastro delle etichette per tenere le gambe. Bagnare con il sito chirurgico% EtOH 70 e tampone.
6. Applicare bupivicaine (da 0,1 a 0,2 ml di soluzione allo 0,25%) per via topica al sito di incisione.
7. Nip pelle sulla gola con una pinza e tirare delicatamente verso l'esterno. Fai una piccola incisione verticale, con le forbici chirurgiche. Ridurre la dimensione di incisione.
8. Preparare una siringa da 1 ml con 50 microlitri di PBS o 0,1% in PBS OVA e inserirlo in una pipetta ripetitiva (Tridak Stepper, Torrington, CT). Prendere la pipetta in una mano e l'altra per tenere il tessuto posteriore con le pinze ed esporre la trachea.
9. Tenendo la siringa come parallela alla trachea possibile, inserire l'ago attraverso la trachea parete e iniettare la soluzione.
10. Mantenere il mouse in una iniezione verticale seguente orientamento per dare il tempo per la soluzione di stabilirsi nei polmoni.
11. Ferita zona delicatamente e sterilmente stretta collaborazione conpinzette e sigillare con sutura.
12. Luogo del mouse sterno in giù su una piastra elettrica e consentire di recuperare fino al completo ambulatoriale. Dopo il recupero, riportare il mouse al centro la cura degli animali e monitorare ogni giorno i segni di sieroma, infiammazione o infezione, e deiscenza della ferita fino a quando la ferita è completamente guarita.

B. Per la sfida di nebulizzazione

1. Sensibilizzare topi il giorno 0 mediante iniezione intraperitoneale di 20 mg di OVA (Sigma-Aldrich) emulsionato in 0,2 ml di PBS sterile contenente 2 mg di idrossido di alluminio (Sigma-Aldrich) o con 2 mg di idrossido di alluminio in 0,2 ml di PBS sterile come controllo .
2. Il giorno 14, aumentare la sensibilizzazione mediante iniezione ip come descritto sopra.
3. Il giorno ^{21, 22, 23, 24} e 25 ^° dopo la sensibilizzazione iniziale, topi sfida in caso di esposizione per 30 minuti per nebulizzata OVA 1% o PBS solo consegnato tramite un nebulizzatore ultrasonico (Buxco Systems Research, Wilmington, NC).
4. Luogo topi in camera principale del WBP; Ambientali loro all'interno della camera pletismografia per almeno 10 min.
5. Luogo 1 ml di 0,1% in PBS sterile OVA sterile o PBS solo, come descritto nelle fasi 4-6 seguito, tramite un ampolla. Nebulizzare per 30 min.
6. Rimuovere ampolla e scartare qualsiasi soluzione rimanente.
7. Nebulizzazione può essere eseguita su tutti i topi simultaneamente utilizzando una camera di nebulizzazione.

II. Determinazione della iperreattività bronchiale alla metacolina

A. Misurazione non invasiva della iperreattività delle vie aeree da corpo intero Pletismografia (WBP; Buxco Research Systems, Wilmington, NC)

1. Lasciare la bottiglia metacolina polvere riscaldare a temperatura ambiente prima dell'apertura (metacolina è molto igroscopico e formare grumi inutili se lasciato assorbire acqua). Preparare un 200 mg / ml soluzione stock in PBS sterile, quindi effettuare seriali 2-diluizioni (ad esempio, 100, 50, 25, 12,5 e 60,25 mg / ml). Conservare le soluzioni a freddo.
2. Impostare l'attrezzatura come segue: collegare ingresso principale della WBP per nebulizzatore, bias-portata in ingresso alla pompa ad aria, e la presa WBP di trappola per il gas utilizzando aderente tubo di gomma. Fissare trasduttore di pressione per colmare gli outlet delle camere principali e di riferimento della WBP. Collegare trasduttore di pressione per preamplificatore con i cavi in ​​dotazione, e collegare preamplificatore al PC utilizzando la specifica scheda di acquisizione dati.
3. Calibrare il preamplificatore con il software in base alle raccomandazioni del fabbricante.
4. Luogo topi in camera principale del WBP; Ambientali loro all'interno della camera pletismografia per almeno 10 min, poi letture di base dei record (Penhbase) per 3 min.
5. Mettere 1 ml di PBS sterile nella tazza del nebulizzatore. Nebulizzare per 2 minuti e quindi controllare le variabili respiratorie per ulteriori 6 minuti durante la fase di essiccazione. Rimuovere ampolla ed eliminare eventuali residui di PBS.
6. Mettere 1 ml di 6,25 mg / ml metacolina in tazza nebulizzatore e rnebulizzazione EPEAT per 2 minuti, più di 6 minuti ciclo di monitoraggio.
7. Ripetere la misurazione con 12,5, 25, 50 e 100 mg / ml metacolina, utilizzando lo stesso periodo di 2-min nebulizzazione e 6-min ciclo di monitoraggio.
8. Rimuovere i topi dalle camere e tornare alle loro gabbie.
9. Refill nebulizzatore tazza con 1 ml di PBS sterile ed eseguire un'altra sequenza di svuotare il tubo.
10. Arrestare i flussi d'aria, smontare, pulire e asciugare tutte le camere prima di eseguire una seconda serie di animali.

B. misurazione invasiva della reattività delle vie aeree da parte controllata da computer, Ventilatore (flexiVent; SCIREQ Inc., Montreal, Canada)

1. Pesare il mouse e anestetizzare da intraperitoneale (ip) iniezione di 60 mg per kg di peso corporeo di sodio pentobarbital.
2. A seguito di un'anestesia adeguata, la posizione dei topi ventro-dorsale per tracheostomia.
3. Disinfettare la pelle del collo con il 70% di etanolo. Applicare bupivicaine (da 0,1 a 0,2 ml di soluzione allo 0,25%) per via topica al incision sito. Incidere e aprire la pelle del collo. Separare i muscoli del collo ed esporre la trachea.
4. Creare un 1 - a 2 mm un'incisione nella trachea con le forbici sottili (essere certi di non recidere la trachea) e inserire il tubo tracheale con cautela. Tie una sutura intorno alla trachea per evitare una perdita d'aria.
5. Posizionare il mouse nella camera di pletismografo corpo e collegare il tubo tracheale inserito al ventilatore.
6. Avviare ventilazione meccanica. Impostare la velocità appropriata respiratoria e volume corrente / stroke (150 colpi / min e 200 pl, rispettivamente per un 20-g mouse). Assicurarsi che il torace si muove in sincronia con il ventilatore. Se il mouse è "lottare" con il ventilatore (self-respirazione), inietti altro anestetico e attendere la sincronizzazione.
7. A seguito di misurazioni di base, mantenere i topi sotto ventilazione di base per altri 3 min, e poi prendere un 2 ^° set di misure di impedenza. Questo 2 ^° set di misurazioni di base viene utilizzata per calculate i valori basali medi.
8. Fornire PBS o di metacolina (MCH) sfide (6,25, 12,5, 25, 50 e 100 mg / ml) per flusso inspiratorio canalizzazione dal ventilatore attraverso un nebulizzatore ultrasonico.
9. Dopo ogni sfida con MCh (6.25, 12.5, 25, 50 e 100 mg / ml), riportare il pistone a fornire un Vt di 10 ml / kg a 120 respiri al minuto e prendere misure di impedenza.

III. Misura di infiltrazione cellulare nello spazio aereo

A. Perform lavaggio broncoalveolare (BAL)

1. Dopo aver misurato il AHR, l'eutanasia topi con CO _2, e posizionare ogni mouse sul suo dorso sullo schienale chirurgico.
2. Bagnare l'area con il 70% EtOH.
3. Iniziando dal basso addome, tagliare aprire la cavità addominale e togliere la pelle / superiore del muscolo, spostando verso l'alto verso le costole.
4. Una volta che le coste sono visibili, usare le forbici per perforare la membrana con attenzione. Polmoni dovesse crollare dal diaframma. Prestare particolare cacon cautela e precisione non intaccare i polmoni o il cuore.
5. Tagliare la gabbia toracica per esporre completamente i polmoni / cuore (evitare di tagliare i vasi sanguigni importanti per mantenere il sangue di riempire il sito).
6. Usando una siringa da 1 ml con un ago 27 gauge (BD siringhe, Franklin Lakes, NJ), forare i ventricoli del cuore e lentamente e tirare indietro il siringa per raccogliere il sangue. Fare attenzione a non collassare il cuore.
7. Raccogliere il siero di questo sangue utilizzando il protocollo standard. Conservare a -70 ° C fino all'uso.
8. Tagliare pelle e dei tessuti dalla gola fino a quando la trachea viene rivelata. Sgombrare il campo da tessuto sufficiente per lavorare facilmente nel campo (ancora una volta, evitare di tagliare i principali vasi sanguigni).
9. Utilizzando forbici curve, tagliate sotto la trachea per cancellare un percorso.
10. Passare il punto di una pinza curve sotto la trachea e afferrare l'estremità di un pezzo di sutura. Disegnare il filo di sutura sotto la trachea.
11. Legare un nodo allentato mezza circa la trachea, in basso nella gola.
12. Carefully tagliare una tacca, di dimensioni sufficienti per la cannula, sopra il filo di sutura.
13. Cautela inserire la cannula nel foro e lungo la trachea oltre il punto del filo di sutura. Premere delicatamente in avanti fino a quando la cannula emerge proprio all'ingresso ai polmoni (troppo lontano: polmoni puntura, troppo brevi: il collasso della trachea durante il tentativo di recuperare BAL).
14. Stringere filo di sutura e il nodo completo per sigillare trachea intorno cannula.
15. Siringa blocco (PBS contenente 1 ml) sulla cannula, e premere delicatamente il fluido nel polmone. Lobi polmonari dovrebbe singolarmente gonfiare lentamente. Non over-fill. Per un pieno cresciuto topo 0,9-1,0 ml è il massimo assoluto. 0,8 ml può essere più sicuro. Bloccare siringa vagamente alla cannula, altrimenti è probabile che causare danni durante il tentativo di disimpegnarsi.
16. Ritirare liquido dai polmoni. Se si incontra resistenza (il tessuto risucchiato cannula), premere cannula lentamente ulteriormente nei polmoni e riprendere la rimozione. Provare anche a ruotare la cannula in posizione. Se tutti ELSe non riesce, ritirare il modo in cui parte cannula, la trachea è molto più probabile per crollare in questo caso.
17. Staccare la siringa dalla cannula, liquido BAL deposito nel contenitore, e ripetere 2 volte con soluzione fresca PBS.
18. Mantenere la soluzione BAL in ghiaccio fino al testacoda verso il basso.
19. Utilizzare il liquido BAL e siero per misurare il OVA IgE specifico usando il mouse disponibile in commercio IgE ELISA Kit (Bioproducts MD, St. Paul, MN).

B. Conteggio di celle e determinare Differenziali

1. Centrifugare il liquido BAL 5 min a ~ 600 × g, 4 ° C.
2. Risospendere il pellet di cellule in PBS con delicatezza e tenere su ghiaccio.
3. Caricare un emocitometro standard di Neubauer con la sospensione cellulare diluita e contare le cellule.
4. Rimuovere aliquote di 2 × 10 ⁴ cellule in 10-40 microlitri per il volume cytospins. Diluire le cellule se necessario.
5. Per cytospins, mescolare 2 × 10 ⁴ celle, 130 microlitri PBS e 10 microlitri FBS. Aggiungi miscela cella Dople Cytospin imbuto e centrifugare 10 min a 700 giri al minuto, utilizzando cytoslides doppi per i campioni duplicati.
6. Lasciare i vetrini ad asciugare a temperatura ambiente per 1 ora prima della colorazione.
7. Colorare i vetrini utilizzando Diff-Quick macchia (Siemens, Newark, DE).

IV. Risultati rappresentativi

Eccessiva costrizione delle vie respiratorie a seguito di stimoli provocatori è una caratteristica importante di asma clinico. Descriviamo due metodi per misurare tale iperresponsività delle vie aeree alla metacolina in topi OVA sensibilizzate e contestato: l'intero corpo pletismografia (Figura 2) e oscillazioni forzate utilizzando il sistema flexiVent (Figura 3). Entrambi i metodi di dimostrare che la sensibilizzazione e la sfida OVA produce iperresponsività delle vie aeree nei topi.

Eosinofili ricco di infiammazione delle vie aeree è un'altra caratteristica importante di asma sia clinica e malattie delle vie respiratorie allergiche nei topi. Come mostrato in figura 4 , sensibilizzazione OVA e sfida aumenta notevolmente il numero totale di cellule che possono essere recuperati dalle vie aeree da BAL. Il numero di eosinofili e, in misura minore, neutrofili sono particolarmente aumentata.

Le prove indicano che i risultati delle malattie allergiche delle vie aeree da sovrapproduzione di anticorpi IgE diretti contro antigeni sensibilizzanti. Sensibilizzazione e sfida con OVA utilizzando i protocolli che descrivono aumenta i livelli di IgE nel siero e fluido sia BAL di topi trattati (Figura 5).

Figura 1. Schema sperimentali per OVA indotta da asma allergica. Topi sono stati sensibilizzati ip due volte con 20 pg di OVA emulsionato in 2 mg di idrossido di alluminio in 0,2 ml di PBS sterile, o 2 mg di idrossido di alluminio in 0,2 ml di PBS sterile da sola, a seguito punti di tempo indicato dal contestarla con lo 0,1% o di soluzione sterile OVA PBS o da ex al giorno bientale per 30 minuti a nebulizzare OVA 1% in PBS o PBS solo forniti tramite un nebulizzatore ultrasonico (Buxco). Ventiquattro ore dopo l'esposizione OVA finale, la reattività delle vie aeree è stata determinata. Successivamente, BAL, campioni di sangue, cellule polmonari, e tessuti sono stati raccolti per ulteriori analisi.

Figura 2. Valutazione del allergene-indotta iperresponsività delle vie aeree con un metodo non invasivo. Topi (n = 4/group) sono stati sensibilizzati e stimolati con OVA. Ventiquattro ore dopo l'ultima sfida, iperresponsività delle vie aeree alla metacolina per via inalatoria è stata determinata utilizzando tutto il corpo pletismografia, come descritto nel protocollo. Penh è stata determinata ed espressa come rapporto tra Penh (media Penh il 8 min intervallo di tempo con metacolina Penh diviso per la media di 8 minuti con intervallo di PBS). * I, p <0,05 vs PBS.

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Figura 3. Valutazione del allergene-indotta iperresponsività delle vie aeree con un metodo invasivo (oscillazioni forzate). Topi (n = 4/group) sono stati sensibilizzati e stimolati con OVA. Ventiquattro ore dopo l'ultima sfida, iperresponsività delle vie aeree a concentrazioni crescenti di metacolina per via inalatoria è stata determinata mediante l'oscillazione forzata (flexiVent) metodo come descritto nel protocollo. A, B) la resistenza delle vie aeree; C) elastanza Lung. * I, p <0,05 vs PBS.

Figura 4. BAL conta delle cellule del liquido. Mice (n = 4/group) sono stati sensibilizzati e stimolati con OVA. Ventiquattro ore dopo l'ultima sfida, (Top) BAL cellule sono state raccolte e cellule totali sono state contate come descritto nel protocollo. (Bottom) slides Cytospin erano priparate e colorati con Diff-Quick. Tot. = cellule totali; Eos = eosinofili; Neu = neutrofili; Mac = macrofagi; Lym = linfociti. * I, p <0,05 vs PBS.

Figura 5. OVA-IgE specifiche. I topi (n = 4/group) sono stati sensibilizzati e stimolati con OVA. Ventiquattro ore dopo l'ultima sfida, IgE è stata misurata nel BAL e nel siero del sangue raccolto mediante puntura cardiaca, come descritto nel protocollo. * I, p <0,05 vs PBS.

Discussione

I modelli animali di malattie allergiche delle vie aeree forniscono importanti strumenti per gli studi relativi ad asma clinico. Un certo numero di modelli differenti, impiegando specie variabili e antigeni, sono stati sviluppati. Il mouse, una specie di laboratorio attraenti e di uso frequente, offre anche una serie di vantaggi per i modelli di malattie allergiche delle vie aeree. ^9,10 Sebbene tali modelli non imitare l'asma sotto ogni aspetto, ¹¹ con gli aspetti della malattia cronica che son...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del materiale	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Ovalbumina	Sigma-Aldrich St. Louis, MO	A5503
Idrossido di alluminio	Sigma-Aldrich	239186
Acetil-β-methylcholine cloruro	Sigma-Aldrich	A2251
Sale di sodio pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Pletismografia corpo intero (WBP) del sistema	Buxco Research Systems Wilmington, NC		http://www.buxco.com
FlexiVent	SCIREQ, Inc. Montreal, Canada		http://www.scireq.com
Microscopio ottico	Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Cytospin 4	Thermo Scientific Asheville, Carolina del Nord
Diff-Quick macchia	Siemens Newark, DE	B4132-1A
Pipetta ripetitiva	Tridak Torrington, CT	STP4001-0025