Rapida determinazione della soglia termica nocicettivo in ratti diabetici

Riepilogo

Qui, descriviamo una procedura rapida, semplice e affidabile per determinare la temperatura minima alla quale i ratti o topi mostrare un comportamento nocifensive, Ie Il Soglia termica nocicettiva (TNT). Questo metodo si applica uno stimolo lento aumento termico permettendo stima preciso e riproducibile di TNTs con minimo eventuali sollecitazioni agli animali.

Abstract

Neuropatia diabetica dolorosa (PDN) è caratterizzata da iperalgesia cioè, aumento della sensibilità agli stimoli nocivi, e cioè allodinia, ipersensibilità a stimoli normalmente innocui ^1. Iperalgesia e allodinia sono stati studiati in molti modelli di roditori diversi di diabete mellito ^2. Tuttavia, come affermato da Bölcskei et al, la determinazione del "dolore" in modelli animali è difficile a causa della sua natura soggettiva ^3. Inoltre, i metodi tradizionali utilizzati per determinare le risposte comportamentali a stimoli termici nocivi di solito mancano di riproducibilità e ³ sensibilità farmacologica. Per esempio, utilizzando il metodo della piastra calda di Ankier ^4, sussulto, ritiro e / o leccare di una posteriore e / o le zampe anteriori è quantificato come latenze reflex a costanti stimoli termici elevati (52-55 ° C). Tuttavia, gli animali che sono iperalgesico di stimolo termico non riproducibile mostrato differenze di relatenze Flex utilizzando le sovra-temperature soglia ^3,5. Come il metodo descritto di recente Bölcskei et al. ^6, le procedure descritte qui consente la determinazione rapida, sensibile e riproducibile di soglie nocicettivi termici (TNTs) in topi e ratti. Il metodo utilizza aumentando lentamente stimolo termico applicato soprattutto alla pelle di topo / ratto superficie plantare. Il metodo è particolarmente sensibile per studiare anti-nocicezione durante stati iperalgesiche come PDN. Le procedure descritte sotto sono basate su quelle pubblicate in dettaglio da Almasi et al ⁵ e Bölcskei et al ^3. Le procedure descritte qui sono stati approvati la cura degli animali da laboratorio e Comitato uso (LACUC), Wright State University.

Protocollo

TNTs di topi e ratti sono determinati utilizzando il incrementale piastra riscaldante analgesia metro [iHPAM, IITC Inc. Life Science (Woodland Hills, CA)]. L'apparecchiatura consiste di diversi componenti: una piastra di alluminio (10 x 20 cm) con il sistema di riscaldamento sotto osservazione e una camera di plexiglass sopra, una unità di controllo termico, software di acquisizione dati (Serie # IITC parte morbida 8), un PC (personal computer) e un pedale per l'avviamento a distanza, fermare o ripristinare il controllo dell'unità. Il sistema di riscaldamento consente inoltre start / stop / reset del processo di riscaldamento manualmente tramite una tastiera di fronte dell'apparecchiatura. Il iHPAM può essere impostato per varie velocità di riscaldamento, standby / cutoff temperature.

1. Attrezzature Set-up

1. Prima di test sugli animali, ispezionare visivamente l'unità di confermare i tassi di riscaldamento scelto (ad esempio, 6 ° C / min), le temperature iniziali standby e Final Cut-off (ad esempio, 28 ° C e 55 ° C, rispettivamente).
2. Verificare tutti i collegamenti. Per conservare copia elettronica dei risultati, l'unità deve essere collegata ad un computer che esegue software serie 8. In alternativa, copie cartacee dei risultati possono essere stampati tramite la porta seriale dell'unità.
3. Provare il materiale. Premete l'interruttore a pedale una volta per assicurarsi che il software serie 8 record: i dati iniziali in stand-by, le temperature di taglio finale e della durata in secondi necessari per raggiungere il cut-off della temperatura.
4. Come prova ulteriore controllo, i ricercatori coinvolti negli esperimenti può avere bisogno di provare il dispositivo su se stessi. Ritirare la mano dalla piastra metallica al momento della percezione del dolore (46-48 ° C) non deve causare danni alla pelle e non produce alcun disagio più tardi.
5. Una volta che l'unità è stata impostata e dei risultati delle fasi 1.3 e 1.4 registrate possono essere confrontati. Questo è utile per rilevare potenziali problemi che potrebbero inficiare l'uso dell'apparecchio. Per esempio, le divergenze tra standby iniziale / finale cut-off tempeperature e la lettura effettiva del gruppo, e / o le differenze tra le temperature visualizzate dal gruppo e la temperatura della piastra effettivo richiesto per il ritiro a mano.

2. Test animali normali

Giovane o adulto ratti Wistar [post-natale (p) età 21-25 giorni], o topi p21-25) di qualsiasi background genetico o di genere può essere utilizzato. I topi utilizzati nei nostri esperimenti sono del C57BL/6J ceppo.

1. La notte prima degli esperimenti da eseguire, abituare gli animali mettendo loro gabbie sulla panchina dove è collocato il iHPAM. Due ore prima di eseguire i test, accendere il iHPAM per familiarizzare gli animali con il rumore di fondo del gruppo. A questo punto, il iHPAM può essere impostato e testato per verificare il corretto funzionamento (cfr. punti 1). Cibo e acqua viene fornita ad libitum durante tutto il test, tranne quando l'animale è nella camera di osservazione (vedi punto 2.1).
   Nota: è important non dare per scontato che le condizioni di laboratorio in esperimenti comportamentali sono controllati per impostazione predefinita. Particolare attenzione dovrebbe essere prestata a fattori genetici e ambientali che possono influenzare l'esito degli studi comportamentali (recensione in ^7).
2. Delicatamente posizionare un topo normale / ratto nella camera di plexiglass osservazione sopra la piastra riscaldante dell'apparecchio. Permettere agli animali di acclimatarsi alla superficie riscaldata (fissata a 28 ° C) fino a quando l'animale mostra un comportamento confortevole.
   Nota: In queste condizioni ratti adulti normali mostrano un comportamento esplorativa iniziale, di tanto in tanto in piedi verso il coperchio della camera di osservazione durante lo sniffing. Dopo pochi minuti, i ratti possono mostrare attacchi casuali di governare e di un comportamento rilassato. A volte, i ratti giacque con una postura del corpo rilassato (estensione prona), mentre casualmente annusare i dintorni. I topi normali sono in genere più attivi rispetto ai ratti. Tuttavia, i topi mostrano un comportamento esplorativo rilassata dopo pochi minuti in camera di osservazione. E 'eccezionalmente raro osservare comportamenti sia in fuga (ad esempio, saltando, cercando di scappare dalla camera di osservazione) o atteggiamenti difensivi (per esempio, strillando). È altresì importante notare che i topi possono comunicare il dolore da un topo all'altro ^8. Pertanto, può essere importante per i topi di prova collocati in gabbie separate.
3. Posizionare rispecchia nella parte posteriore della camera di osservazione, per consentire osservazioni a tutti gli angoli. Un treppiede in possesso di un videocamera digitale può essere di aiuto per determinare il momento esatto in cui nocifensive (evitando il dolore), il comportamento si era verificato.
4. Una volta che l'animale è comodo nel calore della camera di osservazione la piastra premendo il pedale. Quando la temperatura della piastra si riscalda ad una velocità di 6 ° C / minuto, gli animali normali presentano un comportamento che coinvolge sia nocifensive-zampa posteriore * Di solito le temperature imperversano 46-48 ° C ^3,5,9,10. Così, l'animale è tipica forma rimosso il osservabilizione della camera dopo circa 3 minuti.
   Nota: Osservando la risposta tipica di un nocifensive cioè ratto o topo, zampa posteriore-lecca, agitando e / o di sollevamento, è sufficiente a interrompere lo stimolo termico. Ciò si ottiene premendo il pedale. In questo momento, il software registra la temperatura della piastra e la piastra raffredda immediatamente standby fino a quando la temperatura (28 ° C) viene raggiunta (~ 0,5 min). Questa temperatura, il che evoca qualsiasi reazione nocifensive viene considerata come soglia calore nocivo (TNT) del normale (controllo) animale.
   * A volte, in particolare nei topi, il comportamento nocifensive a temperatura nocivi possono in primo luogo rilevare una o entrambe le zampe anteriori (ad esempio, leccare seduti), pochi secondi prima che le zampe posteriori. Tuttavia, zampa anteriore leccare è un normale componente del comportamento governare. Quindi, solo posteriori-zampa reazioni sono valutate. In occasioni topi possono accudire i loro dietro le zampe pure. Tuttavia, fare grooming normale not durano più di pochi secondi, non comporta intensive leccare e termina di solito dopo aver pulito i suoi artigli.
5. Rimuovere delicatamente l'animale dalla piastra e inserirlo nella sua gabbia corrispondente. La misurazione della soglia di calore viene quindi ripetuto per altro controllo (normale) animale.
   Nota: TNTs può essere determinata in un singolo animale a intervalli di 1-2 minuti senza rimuovere l'animale dalla camera di osservazione. Determinazioni TNT in ratti o topi possono essere ripetuto più volte durante parecchi giorni. Ciò è particolarmente utile per determinare la media TNT di un singolo animale, nonché la sua variazione con l'età.
6. La TNT di animali di controllo viene espressa come media di tre o più soglie ± SEM.
7. L'analisi statistica dei dati ottenuti viene eseguita per confrontare i diversi gruppi di trattamento di topi o ratti. Procedure parametriche compresa l'analisi della varianza può essere utilizzato in modo appropriato i cui dati sono distribuiti normalmente e dove i gruppi di trattamento sono homoskedastic, quando queste condizioni sono state soddisfatte le seguenti approcci può essere applicata. Analisi della varianza seguita dal test di Newman-Keuls per rilevare le differenze di misurazioni multiple cioè, ripetute TNTs individuali con / senza trattamento o in tempi diversi (ad esempio, i dati della figura 3). Il Student per dati appaiati t-test può essere utilizzato per confrontare due gruppi di dati cioè TNTs prima vs dopo trattamento farmacologico, il t-test non appaiati possono essere utilizzati per determinare le differenze nei cambiamenti in TNT farmaco-veicolo trattati vs animali trattati (ad es , dati in Figura 4).

3. Test animali diabetici

La streptozotocina (STZ) indotta ratti diabetici è il modello animale più comunemente usato per studiare i meccanismi di PDN e di valutare i farmaci analgesici e terapie ^11,12. Ratti diabetici realizzato da una singola dose intraperitoneale di STZ (60 mg / kg) può be testato per iperalgesia termica durante il 3 ^° settimana dopo la comparsa del diabete ^11. È importante notare che non tutti i ratti diabetici sviluppano PDN. Tuttavia, gli animali che si sviluppano iperalgesia (~ 50%) può essere facilmente identificato. Infatti, i loro TNTs sono inferiori * normale.

* Per determinare TNTs di STZ-ratti diabetici, una temperatura piastra iniziale di 15 ° C invece di 28 ° C viene usata. La ragione di questi cambiamenti è che la maggior parte degli animali diabetici con neuropatia diabetica dolorosa dovrebbero essere iperalgesico ^2,11. Pertanto, avranno minore normali soglie di calore nocivi (ad esempio, <45 ° C).

1. Un ratto diabetico viene posta nella camera di osservazione dall'alto dell'apparecchiatura di prova. L'animale è consentito si adatti alla superficie della piastra finché l'animale mostra un comportamento confortevole.
   Nota: in genere, un topo diabetico non mostra gran parte del comportamento normale. Ratti diabetici sono di solito ipoattivo, letargico, che spesso mostrai movimenti limitati e governare lento. È raro osservare classifica verso il coperchio della camera di osservazione. Dopo pochi minuti, ratti diabetici possono tranquillamente stare in un angolo della camera con casuale sniffing dei dintorni.
2. Una volta che l'animale diabetica è confortevole nella camera di osservazione, la piastra viene riscaldata come nella Fase 2,3 ratto diabetico può esibire un comportamento nocifensive coinvolge o posteriore / anteriore zampa. Ciò accade solitamente a temperature non nocivi piastra (ad esempio, <45 ° C), o dopo non più di 5 minuti nella camera con il ° C / min 6 aumento della temperatura.
   Nota: La risposta nocifensive di un giovane topo diabetico adulto non differisce da quella di un topo normale. Tuttavia, la temperatura più bassa che evoca un tale comportamento è notevolmente abbassata.
3. Osservate il Passo 2,4
4. La media di più di tre soglie nel giorno dell'esperimento espresso in ° C ± SEM è considerata la soglia calore nocivo del diabetic animale.
   Nota: Un paradigma simile a quello descritto per ratti normali e diabetici può essere seguito per determinare la termica anti-nocifensive effetto di analgesici a soglie di calore.

4. Test Analgesia

Le proprietà anti-nocicettivi di farmaci (ad esempio, analgesici), nonché la determinazione dei parametri farmacologici come la dose minima efficace può essere facilmente ottenuto utilizzando i passi spiegati sopra. Si prevede che le dosi adeguate di un analgesico somministrato ai ratti / topi finirebbe per aumentare significativamente i loro TNTs. Questo è particolarmente sensibile negli animali con iperalgesia termica ^3. Tuttavia, per evitare distorsioni nell'interpretazione dei risultati, i ricercatori coinvolti nella osservazione del comportamento di un gruppo animale non deve sapere o conoscere se gli animali erano stati trattati o meno. Inoltre, i farmaci da iniettare da un osservatore può essere preparata da un altro ricercatore ed etichettateA, B, C, ecc dosaggio viene fornito in una stampa, elencando dosi individuali per animale identificato.

A seconda del farmaco da testare, diverse dosi di un analgesico potenziale possono essere somministrati agli animali normali o diabetici 5-15 min prove preliminari comportamentali. Opportuni controlli devono essere inclusi (cioè, di pari età animali iniettati con il solo veicolo e / o ratti diabetici senza PDN) e testato usando condizioni identiche (per esempio, stessa temperatura di partenza della piastra). Gli effetti cronici di farmaci possono essere testati.

5. Risultati rappresentativi

La temperatura più bassa piastra di evocare reazioni nocifensive in entrambi i posteriori-zampa di giovani adulti normali non trattati ratti o topi sono stati determinati seguenti passaggi 2-1 a 2-6. Come mostrato in figura 1, TNT di ratti giovani adulti normali e topi erano 47,2 ± 0,2 ° C e 47,5 ± 0,5 ° C, rispettivamente.

Abbiamo obserestano riservati non significativa variazione giornaliera di TNTs dell'individuo (Figura 2A), né cambiamenti significativi di TNTs tra individui della stessa età (Figura 2B). TNT differenze dovute al genere non sono stati osservati (non mostrato).

TNTs di giovani adulti STZ-diabetici ratti sono stati determinati in modo simile per ratti normali (passi da 3.1 a 3.3). Tuttavia, la temperatura della piastra di partenza è stato impostato a 15 ° C invece di 28 ° C. Il comportamento di nocifensive STZ-ratti diabetici è stata valutata almeno tre volte in un individuo e in modo giornaliera a partire undici giorni post-iniezione STZ. Come mostrato in figura 3, un calo significativo (p <0,01) in TNT di STZ-ratti diabetici diventa evidente due settimane post-iniezione STZ. La TNT media di STZ-ratti diabetici era 45,6 ± 0,1 ° C (n = 16, i valori raccolti da giorni 14-23).

Ratti diabetici presentano significativamente più basso rispetto TNT Normal sono stati considerati di avere PDN. Questi topi sono stati usati per testare le acute anti-nocicettivi proprietà di un analgesico (composto A). TNTs sono stati determinati in ratti normali e diabetici iniettati con una dose singola del composto o solo veicolo cinque minuti prima del test. Come mostrato in figura 4, un singolo intra-peritoneale dose del composto aumentato significativamente TNTs di ratti diabetici rispetto a ratti trattati con solo veicolo (45,6 ° C vs 47,6 ° C, rispettivamente). L'anti-nocifensive effetto del composto A è stata anche osservata in ratti normali, sebbene significativa (p <0,01), era meno pronunciato (47,4 ° C vs 48,0 ° C, rispettivamente).

Figura 1. Determinazione del TNTs di ratti normali giovani adulti o topi: Le TNTs di ratti giovani adulti (p21-24) (o topi p20-21) sono stati testati nel iHPAM seguendo la procedura descritta above. Un totale di 12 ratti e 25 topi sono stati testati. Le misurazioni sono state eseguite durante diversi giorni ed i risultati sono stati raccolti. I risultati sono espressi come media ± SEM. Il valori minimo e massimo TNT registrata in questi ratti erano 46,2 ° C e 48,6 ° C rispettivamente. Nel caso di topi, i valori massimo e minimo TNT registrati erano 48,8 ° C e 44,9 ° C, rispettivamente.

Figura 2. Età-dipendenza di TNTs in ratti e topi: A) tracciati sono i TNTs di quattro ratti normali (n = 4) di 21 giorni di età determinato almeno tre volte al giorno per 5 giorni B) TNTs di topi figliata determinata una volta indicato. età. I numeri sopra determinazione ciascun punto rappresenta il numero di cucciolata utilizzati.

Figura 3. Ratti diabetici diventano 3 iperalgesico noieks dopo la comparsa del diabete: TNTs di sei (n = 6) pari età giovani-adulte STZ ratti diabetici sono stati determinati tutti i giorni a partire 11 giorni dopo l'induzione del diabete. Vengono mostrati giornaliere medie TNT (media ± SEM). TNTs diabetici stati fissati tra 11-13 giorni dopo l'iniezione di STZ erano all'interno del range di normalità (linea rossa). Due settimane dopo l'iniezione di STZ TNTs notevole calo a 45,1 ± 0,4 ° C, (p <0,05).

Figura 4. Acuta anti-nocifensive effetti di composto B in STZ-ratti diabetici. Giovani ratti adulti normali (blu gruppo di n = 12) e l'età corrispondente STZ-ratti diabetici iperalgesiche verde (gruppo n = 6) sono stati testati nel iHPAM dopo l'iniezione intraperitoneale di veicolo (barre scure) o composti A (barre chiare). La media ± SEM TNT per ciascun trattamento (controllo del veicolo o il composto A-trattato) sono mostrati. Gli asterischi indicano differenze statistiche(P <0,05).

Discussione

Analogamente al test classico piatto caldo per quantificare iperalgesia termica ^4,13, il dosaggio di nocicezione qui descritto consente in modo rapido e affidabile per quantificare il comportamento nocifensive in ratti e topi. Tuttavia, contrariamente a test classico, il incrementale hot-plate metodo è non invasivo e praticamente priva di stress. Sebbene alcuni trattenere è necessario eseguire il test (cioè, l'animale deve essere nella camera di osservazione), ratti o topi sono abituati ad are...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Azienda	Numero di catalogo
Incrementale Hot-Plate Analgesia Meter	IITC Inc. Life Science	Part # PE34
Serie soft 8	IITC Inc. Life Science	Part # Series8
Streptozotocina	Calbiochem	572201