Cella di misura singola di rilascio di dopamina con simultanea di tensione-clamp e Amperometria

Riepilogo

La tecnica di misura amperometrico il rilascio di dopamina da una singola cellula rilevando la corrente ossidativo prodotta per ossidazione spontanea dopamina. Morsetto di tensione simultanea e la metodologia amperometria rivelano il rapporto meccanicistico tra il generale "attività" del trasportatore della dopamina e il ruolo di regolamentazione di questa attività sul trasporto inverso di dopamina.

Abstract

Dopo il suo rilascio nella fessura sinaptica, la dopamina esercita le sue proprietà biologiche attraverso i suoi obiettivi di pre-e post-sinaptica ^1. Il segnale dopamina è terminata da diffusione ^2-3, enzimi extracellulari ^4, e trasportatori di membrana ^5. Il trasportatore della dopamina, che si trova nel peri-sinaptico dei neuroni dopaminergici cancella le ammine rilasciate attraverso un flusso di dopamina verso l'interno (assorbimento). Il trasportatore della dopamina può funzionare anche in senso inverso per liberare ammine dall'interno verso l'esterno in un processo chiamato di trasporto verso l'esterno o l'efflusso di dopamina ^5. . Più di 20 anni fa Sulzer et al hanno riportato il trasportatore della dopamina può operare in due modi di attività: in avanti (assorbimento) e la retromarcia (efflusso) ^5. Il neurotrasmettitore rilasciato tramite efflusso attraverso il trasportatore può spostare una grande quantità di dopamina nello spazio extracellulare, e ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella regolamentazione dopamina extracellulare homeostasi ^6. Qui si descrive come patch clamp e registrazione simultanee amperometria può essere utilizzato per misurare dopamina rilasciata attraverso il meccanismo di flusso con risoluzione temporale millisecondo quando il potenziale di membrana è controllata. Per questo, cellule intere correnti e ossidativo (amperometrico) segnali sono misurati simultaneamente utilizzando un amplificatore Axopatch 200B (Molecular Devices, con un passa-basso insieme filtro di Bessel a 1.000 Hz per cellula intera registrazione corrente). Per amperometria registrazione di un elettrodo in fibra di carbonio è collegato ad un secondo amplificatore (Axopatch 200B) ed è posto adiacente alla membrana plasmatica e mantenuto a 700 mV. Le cellule intere e ossidativo (amperometrico) correnti possono essere registrati e la relazione corrente-tensione possono essere generati utilizzando un protocollo di tensione di fase. A differenza della calibrazione solita amperometrico, che richiede la conversione alla concentrazione, la corrente viene riportato direttamente senza considerare il ⁷ effettivo volume. Così, i dati risultantirappresentano un limite inferiore di efflusso dopamina perché alcuni trasmettitore è perso alla soluzione bulk.

Protocollo

1. Attrezzature e Forniture

1. Montare una gabbia di Faraday sopra il tavolo antivibrazione (TMI) per diminuire il rumore di fondo.
2. La simultanea patch clamp sistema amperometria di controllo richiede un microscopio invertito con eccellenti ottiche DIC e una lente lunga distanza di lavoro. Collegare il microscopio faro di una batteria per auto. Questa sorgente luminosa DC per il sistema diminuirà ulteriormente il rumore elettrico.
3. Micromanipolatori idraulici (Siskiyou) ulteriore riduzione del rumore. Nella nostra configurazione, utilizziamo un manipolatore di mano destra per la registrazione cellula intera, e la sinistra ha consegnato per amperometria.

2. Preparare Elettrodi di registrazione

1. Tirare elettrodi di patch utilizzando pipette quarzo su un P-2000 estrattore (Sutter). La trazione dura circa 5 secondi, con due cicli termici. Questa volta il calore ha portato a resistenza costante (3-4 MW) nei nostri pipette patch di cellule intere.
2. Riempire l'elettrodo con l'Aggiunta della soluzione contenente 2 mM dopamina e montarlo sul manipolatore destro. Avvolgere il contenitore che contiene la soluzione di pipetta contenente DA con un foglio di alluminio. Tenere su ghiaccio. La dopamina è ossidabile. Mantenendo la soluzione in ghiaccio, protetto dalla luce diminuirà il livello di ossidazione della dopamina.
3. Rimuovere delicatamente un (Dagan) ProCFE basso tenore di carbonio elettrodo amperometrico rumore fibra dal contenitore, riempire con il mercurio, per montaggio su scheda amperometrica (come illustrato nella figura 1), e poi montare sulla maniupulator destra. Proteggere la punta della fibra di carbonio da danni tenendo l'estremità della fibra di carbonio. Ispezionare l'elettrodo con un microscopio di laboratorio per garantire la punta è pulito e intatto.
4. Esaminare l'integrità del elettrodo amperometrico ponendo l'elettrodo in una capsula di Petri di vetro inferiore contenente soluzione esterna. Registrare una corrente di base in assenza di dopamina. Aggiungere 10 ml di una soluzione 1 mM DA al piatto. Un re buon elettrodo amperometricocavi di un aumento nella corrente ossidativo. Ripetere questo passo all'inizio e alla fine di ciascun esperimento per rendere certa la elettrodo amperometrico funziona correttamente.

3. Preparare la coltura primaria neuronale dei neuroni dopaminergici o di cellule ingegnerizzate per esprimere il vettore della dopamina di stoviglie fondo di vetro Petri

1. Lavare delicatamente le cellule o neuroni dopaminergici tre volte con soluzione esterna calda.
2. Montare il fondo piatto di vetro Petri sul palco microscopio.

4. Visualizza cellulare ed esecuzione Experiment

1. Trova il punto focale corretta di visualizzare chiaramente le cellule. Posizionare pressione positiva sull'elettrodo patch. Poi, delicatamente portare entrambi gli elettrodi giù nella soluzione, e vicino alla cella.
2. Posizionare l'elettrodo amperometrico accanto alla cella (a sinistra), e l'elettrodo cerotto sulla destra.
3. Realizzare un sigillo gigaohm sulla cella con l'elettrodo patch. La rottura del sigillo mediante aspirazioneottenere la configurazione a cellula intera.
4. Consentire 5-8 min per dialisi della soluzione interna contenente dopamina nella cella.
5. Utilizzare desiderato gradino di tensione o protocollo rampa. Acquisire simultaneamente i dati sia la pipetta patch e l'elettrodo amperometrico per la misura di correnti a cellule intere e invertire trasporto di dopamina attraverso il trasportatore della dopamina, mentre il potenziale di membrana è controllata tramite la pipetta patch.

Risultati

Patch clamp combinato con amperometria può misurare tensione-dipendente DAT-mediata DA efflusso. Figura 2A mostra una configurazione rappresentativa sperimentale e registrazione DAT-mediata DA efflusso quando l'ambiente intracellulare e il potenziale di membrana sono serrati da una cellula intera pipette patch. Usando questa tecnica, cellule esprimenti YFP-DAT proteine ​​sono in tensione fissata con una pipetta intero cerotto cellule mentre un elettrodo amperometrico viene posto sulla membrana ...

Discussione

Simultanea voltage-clamp e amperometria offre i seguenti vantaggi. Tutti i tipi cellulari sono accessibili e possono essere utilizzati per la registrazione. L'identificazione delle cellule o dei neuroni in cui sono fatte le registrazioni è semplice e lineare. In particolare, se la cella è marcato in modo fluorescente aggiungendo un tag fluorescente per la proteina di interesse sperimentatore può facilmente selezionare la cella di destinazione o neurone. La configurazione sperimentale consente un'erogazione un...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Attrezzatura
Anti-vibrazione tavolo w / gabbia di Faraday	Tecnico Manufacturing Corporation	63-500 serie	usiamo il modello 63-543
Microscopio invertito Nikon TE-2000	Nikon	interrotto	ora Eclipse Ti
Due amplificatori a basso rumore axopatch 200b	Molecular Devices		800-635-5577
1-203 CV BU headstage	Molecular Devices		800-635-5578
1-HL-U pipetta titolare	Molecular Devices		800-635-5579
Digidata 1440A convertitore A / D	Molecular Devices		800-635-5580
Due manipolatori Siskyou, a sinistrae la mano destra	Siskiyou	MX6600R MX6600L	877-313-6418
Laser pipetta estrattore	Sutter Instruments	P-2000	888-883-0128
Bassa rumorosità in fibra di carbonio elettrodo amperometrico	ProCFE		www.dagan.com
Bassa rumorosità quarzo pipetta	Sutter Instruments	QF100-70-7,5	888-883-0128
12 volt batteria auto			ampiamente disponibili
Caricabatterie per auto			ampiamente disponibili
			Reagente
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma	S7653
HEPES	Sigma	H3375
Destrosio	Sigma	G7528
Solfato di magnesio (MgSO4)	Sigma	M2643
Potassio fosfato monobasico (KH 2 PO 4)	Sigma	P5655
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma	P9333
Calcio cloruro diidrato (CaCl 2 • 2H 2 0)	Sigma	223506
Magnesio cloruro esaidrato (MgCl 2 • 6H 2 0)	Sigma	M2670
EGTA	Sigma	E0396