Determinazione del conteggio delle cellule dei mammiferi, le dimensioni delle cellule e la salute delle cellule utilizzando il Moxi Z Mini contaglobuli automatizzato

Riepilogo

Il Moxi Z contatore di cellule in miniatura automatizzato è un nuovo strumento che combina il Principio Coulter con brevettata tecnologia a film sottile sensore e un algoritmo software proprietario per eseguire il dimensionamento e il conteggio di una vasta gamma di dimensioni delle particelle, nonché per determinare la salute generale del monodisperse colture cellulari di mammifero. Questo protocollo descrive l'uso di tale strumento per il conteggio e valutare la salute delle colture cellulari.

Abstract

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls^1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques⁶.

Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.

The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.

Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

Protocollo

1. Preparazione di campioni

1. Diluire la sospensione cellulare con ORFLO diluente o un diluente appropriato in modo che la concentrazione cellulare è all'interno del campo di funzionamento dello strumento (da 3.000 a 500.000 cellule / ml per cassette di tipo M, o 3.000 a 2.500.000 cellule / ml per cassette Type S).
2. Una diluizione di 1:05-01:20 (tipo cassette M) o nessuna diluizione per diluizione 1:5 (cassette Type S) è consigliata per linee cellulari la maggior parte dei mammiferi, ma la diluizione appropriata dipenderà dal tipo di cellula e densità di semina. Il volume richiesto per un conteggio preciso è di circa 75 pl.

2. Di utilizzare i campioni

1. Girare la Z Moxi premendo il pulsante di accensione e la schermata iniziale verrà visualizzata.
2. Premere il vassoio e inserire una cassetta nel Z. Moxi Il campione Pipettare 75μL ... Verrà visualizzata la schermata.
3. Pipettare un campione di 75 microlitri nella porta di riempimento della cassetta (ovale bluetichettati 1 o 2, a seconda estremità della cassetta è stata inserita nello strumento). Queste sono le cassette monouso, che possono essere utilizzati per 2 test. Nota: Posizionare la punta della pipetta direttamente nel caricamento bene a ~ 45 ° angolo in modo che la punta e 'colto sotto il bordo anteriore del bene. Quando erogazione, è importante che il vuoto non "andare avanti" della erogazione del fluido come potrebbe causare sacche d'aria di entrare la cassetta. Si raccomanda di avere un piccolo tallone (la dimensione di entrata e) di forma fluida sul pozzo durante l'erogazione.
4. Per il conteggio delle cellule di mammifero più, toccare lo schermo per iniziare ovunque. Per il conteggio delle particelle molto piccole (da 4 a 8 micron diametro medio per Tipo M e 3-8 micron di diametro medio di Type S), la Z Moxi può essere eseguito in modalità di particelle di piccole dimensioni. Nota: il tipo di cassetta viene indicato nella barra nera nella parte superiore dello schermo. In questo modo, Moxi Z determina la scala di diametro da 2 a 10 um come predefinito ed esegue il conteggio ucantare parametri ottimizzati per il rilevamento di piccole cellule. Premere il piccolo pulsante TOUCH QUI Modalità di particelle (nero quadrato) per avviare ed eseguire il test in questa modalità.
5. La Z Moxi inizierà il test ed i risultati delle celle di conteggio sarà completato in circa 8 secondi (tipo cassette M) o 15 secondi (cassette Type S).
6. Il Curve Fitting e calcoli MVI iniziare automaticamente e richiede solo pochi secondi supplementari. Quando un accoppiamento idoneo viene trovato, i risultati vengono automaticamente visualizzato sullo schermo.
7. Per rendere Gating modalità di acquisizione predefinita, premere il tasto Count Curve Fit per passare in modalità Gating.
8. A questo punto la cassetta può essere rimosso dall'unità.

3. Gestione dei dati

1. Se il ridimensionamento AutoMode è spento, i risultati vengono visualizzati inizialmente per un conteggio curva di adattamento su una scala diametro di 2-34 micron (tipo cassette M) o 2-26 μm (cassette Type S). Se il ridimensionamento Automode è, allora il Z Moxi automaticamente scala l'asse orizzontale (asse x) per l'intervallo che è più vicina alla larghezza della curva-fit popolazione garantendo nel contempo tutti curva-fit dati visualizzati.
2. Se il ridimensionamento AutoMode è spento, per visualizzare manualmente i risultati a una risoluzione più alta, toccare l'icona di 2-26 micron (Tipo M) o l'icona di 2-18 micron (Type S). Nota: Il tipo di cassetta viene indicato nella casella blu in alto a sinistra dello schermo. Questa opzione è consigliata quando si contano più piccole cellule o particelle per migliorare sia le curve-fitting funzionalità nonché la capacità dell'utente di discriminare visivamente sfumature dei dati.
3. Su aumentare la risoluzione orizzontale, il pulsante di scala regola dinamicamente per consentire il ciclismo tra i disponibili x-asse campi scala: 2-34, 2-26 e 2-18 e 2-10 micron per il cassetto di tipo M o 2 -26, 2-18 e 2-10 micron per cassette del tipo S. Questa funzione è solo dispobile immediatamente dopo un numero di celle.
4. Contare le informazioni (cellule / ml) per la curva-fit o regione gated viene visualizzato in una scatola nera sotto il lato sinistro dell'istogramma. Informazioni media dimensione della cella viene visualizzata nella scatola nera sul lato destro dell'istogramma.
5. Il valore MVI viene visualizzato un riquadro blu in alto a destra dell'istogramma. Se il test è stato eseguito in modalità piccola particella, il MVI non si applica e verrà visualizzata come "MVI = SPM". Inoltre, se la concentrazione di cellule è al di fuori del campo di funzionamento MVI, un messaggio di "MVI = Out of Range" sarà visualizzato.
6. Per salvare l'istogramma corrente, toccare l'icona Fatto. Ciò consente di risparmiare i dati con il nome di "Test XXX" dove XXX è il numero di test corrispondente.
7. Per cancello manualmente l'istogramma, toccare per far passare la Fit Curve conteggio risultati pulsante. Ciò rende Gating modalità di acquisizione predefinita. Quindi, far scorrere ciascun indicatore blu gating per impostare le porte o toccare thle frecce destra e sinistra di e (queste appaiono dopo aver toccato l'indicatore blu gating) per le regolazioni fini del cancello solo le celle comprese tra i marcatori sono contati. La scala istogramma verticale viene automaticamente ridotta basa sulla curva-fit ampiezza popolazione. Per regolare questa scala verticale, scorrere lo schermo verso l'alto o verso il basso nella regione istogramma.
8. Toccare il tasto Gated Count risultati per riportare il display in modalità curva in forma e fare modalità curva di adattamento la modalità di acquisizione predefinita.
9. Quindi premere l'icona Fine per salvare i risultati e tornare alla schermata Home. Per eliminare i risultati, premere sul pulsante Elimina in qualsiasi momento per eliminare definitivamente i risultati del test.

4. Analisi dei dati precedentemente acquisiti

1. Per aprire un test salvato, premere l'icona Istogramma sulla schermata Home.
2. Icone per un massimo di nove istogrammi salvate verranno visualizzate sullo schermo.Premere l'icona appropriata per il test di interesse o premere il pulsante Pagina su o Pagina giù icone per visualizzare i risultati dei test più.
3. Ogni istogramma sarà aperto in entrambe le modalità di Conte Adattamento curva o in modalità Count Gated, a seconda di come è stato salvato. In modalità Count Gated, marcatori gating può essere posizionato a piacimento facendo scorrere ciascun indicatore blu gating in modo indipendente. Porta Auto toccando il picco desiderato. Toccare per passare tra il Conte e la Curva Gated modalità Count Fit.
4. Premere le icone Zoom e Unzoom per regolare la scala verticale dell'istogramma. La scala verticale può essere modificato anche in senso verticale strisciando il dito sul up display (per aumentare) o verso il basso (per diminuire).
5. Premere l'icona Delete per eliminare definitivamente i risultati del test.
6. Premere l'icona Fine perchiudere i risultati del test e tornare alla schermata Home. (Nota: vista ingrandita non verranno salvate.)

5. Trasferimento dati su un PC

1. I dati possono essere trasferiti a un PC utilizzando l'applicazione Moxichart Orflo o tramite bonifico USB collegando il Moxi Z cavo USB a un PC o Mac. Per il trasferimento Bluetooth (MoxiChart), in primo luogo determinare ID Bluetooth dell'unità premendo l'icona Bluetooth nella schermata iniziale del gruppo Moxi Z.
2. Sul computer, aprire l'applicazione MoxiChart e fare clic sull'icona Bluetooth in alto a destra. Quindi, scegliere il dispositivo che corrisponde alla ID Bluetooth del Z Moxi e selezionare una cartella di destinazione per i file caricati.
3. Moxichart trasferirà automaticamente tutti i file nella directory specificata tramite la connessione Bluetooth.
4. I file trasferiti via Bluetooth (MoxiChart) o USB può essere aperto e analisized direttamente con l'applicazione MoxiChart o, perché sono formattati. file CSV, possono essere aperti direttamente in Microsoft Excel o altri programmi di analisi dei dati per l'analisi in aggiunta / custom.

6. Risultati rappresentativi

Per valutare la precisione e l'accuratezza della Z Moxi, conta di cellule HEK-293, le cellule HeLa e CHO-K1, lievito, Jurkat E6-1 le cellule, le cellule PC12 e precisione calibrata sospensioni tallone con concentrazioni che vanno da 0-500,000 cellule / mL (Type cassetta M) e 0-2-2.5E ⁶ cellule / ml (cassetta tipo S) sono state contate e confrontate con Coulter Z2 e la Z. Moxi Tutte le cellule di mammifero sono stati ottenuti dalla American Type Culture Collection (ATCC) e coltivate come precedentemente descritto ^7-11. Brevemente, le cellule sono state coltivate in sospensione in 75 palloni di coltura tissutali mm ² con mezzi principali di RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293, HeLa) cellule, o F12K (CHO-K1) cellule. Tutti i media è stata integrata con10% di siero fetale bovino e 100 U penicillin/100 Streptomicina pg. Beute sono state mantenute in un incubatore a 37 ° C con 5% CO _2. Le cellule sono state diversi passaggi ogni 3 giorni. Cellule di lievito (X5, C. albicans, Vin 13) sono stati donati e utilizzato immediatamente, come previsto. Concentrazioni di campione iniziale di ~ 500.000 cellule / ml per i dati di tipo M cassette e ~ 2-2.5E ⁶ cellule / ml per le cassette del tipo S sono stati stabiliti utilizzando il Coulter Z2. Successivi livelli di concentrazione teoriche sono state preparate mediante diluizioni seriali con buffer fisiologici (ISOTON II o soluzione salina bilanciata di Hank). A ciascuna concentrazione, campioni identici sono stati misurati da entrambi i sistemi e tracciati contro l'altro. Come si vede nella figura 2, vi era una forte correlazione lineare (Tipo M r ^2> 0,9886, di tipo S r ^2> 0,9781) tra i conteggi per tutti i campioni. Le concentrazioni sono state anche rispetto alle attese / teorica concentrazione cellulare sia con il Moxi Z e Z2 ( Figura 3) e ancora una volta hanno dimostrato forti correlazioni lineari (tipo M r ^2> 0,9758, Type S r ^2> 0,9774).

Per valutare la precisione, HEK-293 e conta di cellule HeLa sono state eseguite usando la Z2 Coulter, Moxi Z, e un emocitometro. Il coefficiente medio di variazione (CV, n = 19) della conta di cellule utilizzando la Z Moxi (tipo cassette M), Coulter Z2 e un emocitometro sono stati calcolati con CV è misurata dal 5 punti distinti negli 200.000-300.000 cellule / ml gamma. Il piccolo medio CV (Figura 4) del Z Moxi è paragonabile a quella del Z2 ed è rappresentativo del livello di precisione ottenibile solo con tecnologie basate conteggio Coulter.

Dimensionamento di precisione dello strumento Moxi Z è stata valutata il prossimo attraverso la misurazione del acquistati, perle di polistirene di precisione calibrati. Misurazioni medie dimensione delle particelle (n = 5) da Moxi Z sono state rilevate in dimensioni produttore segnalati. Come si può vedere in figura 5, le misurazioni Z Moxi matching i valori produttore con un'alta correlazione lineare (r ² = 0,9989).

Oltre a informazioni su dimensioni e numero, Moxi Z fornisce un reagente-free, la valutazione generale di salute dei mammiferi coltura cellulare con un indice di vitalità riportato Moxi (MVI) valore. Questo indice è generato da un rapporto tra il numero di cellule nella popolazione di interesse rispetto ai conteggi totali di particolato. Per dimostrare le capacità di misurazione MVI, letture MVI (tipo cassette M) sono stati confrontati al manuale standard e flussocitometrici Live / Dead tecniche di misurazione. Popolazioni di morti (<10% vitali) HEK-293 e cellule HeLa sono state create per mezzo di incubazione overnight delle cellule vive in un nutriente-free, fluoruro di sodio contenente diluente (ISOTON II, Beckman Coulter) a 37 ° C. Controllati i livelli di vitalità teorici sono stati preparati da ratiometrically concentrazioni mescolando note di cellule vive e morte. Resulting soluzioni sono state analizzate per i livelli di redditività in duplicato con entrambi i conteggi e le misurazioni emocitometro citometro a flusso. Misurazioni emocitometro state effettuate utilizzando un tradizionale miscela 50/50 del 0,1% soluzione Trypan Blue e cellule. Misurazioni di citometria a flusso sono state effettuate utilizzando un citometro Guava PCA (Merck) usando il reagente Viacount e il fabbricante-specificato protocollo (Merck). Come mostrato in figura 6, i valori di correlazione di Pearson (r ²⁾ "del fit lineare dei dati MVI a percentuali analoghe vitalità emocitometro per" cellule HEK e cellule HeLa sono state r ² = 0,9937 e R ² = 0,9728, rispettivamente. Questi risultati dimostrano che questo approccio fornisce informazioni sulla salute della cultura in una vasta gamma di cellulari Viabilità che confrontano favorevolmente le misure Live / Dead ottenuti utilizzando un citometro a flusso o emocitometro.

Tabelle e figure (Da Dittami et al, 2011.) ^15:

Figura 1. A film sottile Conteggio Coulter: La corrente elettrica viene fatta passare attraverso la zona di rilevamento della cella a film sottile cassetta. Mentre le cellule fluire unico file attraverso il CSZ, gli aumenti momentanei di tensione sono misurati dalla Z. Moxi

Figura 2. Moxi conteggi Z sono paragonabili a Coulter Z2 conteggi. Conteggi identici di sospensioni cellulari e tallone sono stati contati utilizzando sia un Coulter Z2 e la Z. Moxi valori medi di conteggio (n = 3-4) dei conteggi Z Moxi sono stati tracciati rispetto al Coulter Z2 corrispondenti conti e ² r valori del fit lineare sono stati determinati. A) cassette di tipo M - intervallo di concentrazione 0 - 500.000 cellule / ml. B) cassette di tipo S - intervallo di concentrazione di 0 - 2-2.5E ⁶ / Bar ml.Error indicano ± 1 deviazione standard.

Figura 3. Moxi misure di concentrazione Z vs concentrazioni cellulari teorici. A) cassette di tipo M - I valori di concentrazione teorici sono stati preparati da diluizioni seriali di un primo campione di 500.000 cellule / ml B) cassette di tipo S -. Valori di concentrazione teorici sono stati preparati da diluizioni seriali di un iniziale 2 - 2.5E ⁶ cellule / ml di campione. Barre di errore indicano ± 1 deviazione standard.

Figura 4. Coefficiente di variazione per la Z2 Coulter, Moxi Z (tipo cassette M), e emocitometro. Il coefficiente medio di variazione (CV, n = 19) di HEK-293 e conta delle cellule HeLa per ciascun approccio sono stati calcolati con i CV misurati da separato da 5 conti di HEK-293 e cellule HeLa in 200.000 - 300.000 cellule / ml gamma. Barre di errore indicano ± 1 deviazione standard.

Figura 5. Precisione di misurazione delle dimensioni delle particelle che utilizzano Moxi Moxi Z-Z misurata dimensione tallone (tipo cassette M) vs produttore riportato dimensioni tallone. Barre di errore indicano ± 1 deviazione standard.

Figura 6. Cultura della valutazione della sanità con MVI - Confronto di misure di MVI (tipo cassette M) e Guava PCA vitalità Viacount rispetto visive, trypan-blu conta vitalità colorarle con un emocitometro.

Discussione

L'implementazione sottostante l'approccio Coulter possono essere altamente deterministica della precisione complessiva delle misurazioni. Un'area critica è la correzione dei conti delle cellule prime per "coincidenza" eventi in cui due o più celle contemporaneamente passare attraverso l'apertura e sono misurati come un singolo evento elettrica. "Eventi coincidenza" contribuire errore che varia a seconda di diversi fattori tra cui le dimensioni delle cellule e del grado di raggruppamento (Davis et al 1967) ^6. Come risultato, la correzione coincidenza necessario per qualsiasi dato campione non può essere prevista, varia ampiamente tra cellule / particella tipi e anche tra le culture di tipi cellulari identici. Stabilito teoria, radicata in pubblicazioni iniziali da Coulter, consiste nell'applicare una regolazione logaritmica dei conteggi in base al numero di eventi osservati e uno empiricamente-determinato, particelle specifico fattore di correzione, z. Mentre conteggi accurati possono essere adeguatamente raggiunti con til suo algoritmo di correzione, è limitata nella sua applicazione pratica a causa delle forti variazioni tra i valori di z tipi di cellule e la difficoltà corrispondente prevedere con precisione il suo valore. Qui, con il conteggio "vero" cella identificata dalla curva di raccordo Moxi Z insieme con l'algoritmo di correzione coincidenza, la Z Moxi corregge dinamicamente per coincidenza per ottenere le concentrazioni reali. Rispetto ai risultati ottenuti con high-end Coulter Z2, la Z Moxi prodotto conta comparabili tra un intervallo di concentrazione di 0 - 500.000 cellule / ml (tipo cassette M) e 3000 - 2-2.5E ⁶ cellule / ml (cassette Type S) . Inoltre, la Z Moxi raggiunge questa precisione conteggio con un basso coefficiente di variazione simile in conteggi e una precisione nel dimensionamento delle particelle che è caratteristica del sistema aureo, Coulter-tecnica conteggio delle cellule.

Inoltre, i dati qui presentati indicano che la Z Moxi fornisce utiliper quanto riguarda la salute generale di colture cellulari. La Z Moxi sfrutta l'approccio raccordo curva con un algoritmo software proprietario per determinare questa valutazione della salute della cultura. Cambiamenti morfologici associati con la morte delle cellule, come ad esempio blebbing, rompendo uno dall'altro, e le distorsioni volumetriche (Kataoka e Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) ^12-14, rendono possibile per il Moxi-Z di distinguere le differenze tra impedimetric vivono popolazioni e morti cellulari / detriti popolazioni. Il MVI è generata analizzando la cultura / distribuzione delle dimensioni delle particelle di identificare i contributi relativi di detriti, rattrappito cellule necrotiche, e la curva-misura popolazione di cellule di interesse. Il valore MVI riflette quindi un indice di popolazione o misura raziometrica dei conteggi popolazione monodisperse rispetto al profilo complessivo popolazione di particelle. Questo valore viene quindi regolata algoritmicamente-statistiche basati sulla popolazione e le osservazioni empiriche. Because la MVI guarda altri parametri rispetto agli approcci tradizionali colorazione, non si prevede il mirroring queste tecniche ma fornisce invece una vista valida alternativa nella salute di una coltura cellulare, in particolare per quanto riguarda i detriti e contaminanti microbici.

In sintesi, il Moxi-Z contatore di cellule è uno strumento ultra da banco di piccole dimensioni che fornisce precise e riproducibili saggi di conta delle cellule, le dimensioni delle cellule, e la salute delle cellule che utilizzano il principio Coulter e la curva-montaggio algoritmi software in combinazione con un sistema brevettato a film sottile tecnologia dei sensori . Con la cassetta M tipo è in grado di contare particelle da 4 a 25 micron di diametro (gamma dinamica di 2 - 34 micron), in 8 secondi. Con il cassetto Type S è in grado di contare particelle che varia da 3 - 20 micron di diametro (gamma dinamica di 2 - 26 micron), in 15 secondi. Inoltre, il Moxi-Z effettua gli accertamenti sanitari senza l'uso di reagenti. E 'inte lavoro molto menodispendiose e soggettiva del conteggio manuale. In confronto al conteggio standard Coulter, la Moxi è più veloce, significativamente più piccolo, fornisce ulteriori informazioni, richiede una manutenzione molto meno, è più facile da usare, ed è una frazione del costo.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
ORFLO Diluente	ORFLO	MXA006
Cassette Dispenser	ORFLO		Memorizza fino a 25 cassette per comodo di erogazione
Cavo USB	ORFLO		Collega strumento per PC / Mac o adattatore di alimentazione
Power Adapter (modelli USA e UE)	ORFLO		Si collega il cavo USB ad una presa CA
USB Flash Drive	ORFLO		Negozi MoxZ i software e manuale utente
Controllo della calibrazione Beads	ORFLO
Calibrazione cassetta elettronica	ORFLO		Cassetta elettronica per verificare il buon funzionamento del sistema e taratura