Solubilizzazione e Bio-coniugazione dei punti quantici e test di tossicità batterica curva di crescita e conta in piastra

Riepilogo

Nanoparticelle quali punti quantici di semiconduttori (QD) può essere utilizzato per creare agenti fotoattivabili per applicazioni anti-microbici o anti-cancro. Questa tecnica mostra come acqua, solubilizzazione di tellururo di cadmio (CdTe) QDs, coniugato ad un antibiotico, ed eseguire un test di inibizione batterica basata su curve di crescita e conta in piastra.

Abstract

Punti quantici (QD) sono fluorescenti nanoparticelle di semiconduttori con dimensioni-dipendente spettri di emissione che possono essere eccitati da una vasta scelta di lunghezze d'onda. QDs hanno attirato molto interesse per l'imaging, la diagnostica e la terapia a causa della loro luminosa, fluorescenza stabile ^{1,2 3,4,5.} QDs può essere coniugata ad una varietà di molecole bioattive per l'associazione di batteri e cellule di mammifero ^6.

QDs sono anche ampiamente studiato come agenti citotossici per l'abbattimento mirato di batteri. L'emergere di ceppi batterici resistenti si moltiplicano sta rapidamente diventando una crisi di salute pubblica, in particolare nel caso di patogeni Gram-negativi ^7. A causa del ben noto effetto antimicrobico di alcuni nanomateriali, in particolare Ag, ci sono centinaia di studi che hanno esaminato la tossicità delle nanoparticelle ai batteri ^8. Studi batterici sono stati condotti con altri tipi di nanoparticelle di semiconduttori anche, especbuona resa TiO ₂ ^9,10-11, ma anche ZnO ¹² e altri, compresi CuO ^13. Alcuni confronti di ceppi batterici sono stati eseguiti in questi studi, solitamente confrontando un ceppo Gram negativo con un Gram positivi. Con tutte queste particelle, meccanismi di tossicità sono attribuite ad ossidazione: o la fotogenerazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) dalle particelle o il rilascio diretto di ioni metallici che possono causare tossicità ossidativo. Anche con questi materiali, risultati di studi diversi variano notevolmente. In alcuni studi il ceppo batterico Gram positivo è riferito più sensibile del ¹⁰ Gram negativi, in altri è l'opposto ^14. Questi studi sono stati ben recensione ^15.

In tutti gli studi delle nanoparticelle, la composizione delle particelle, le dimensioni, la chimica di superficie, all'invecchiamento dei campioni / guasto, e lunghezza d'onda, la potenza e la durata di esposizione alla luce possono influenzare notevolmente i risultati. Inoltre, Synthesisottoprodotti s e solventi devono essere considerati ^{16 17.} Ad alto rendimento tecniche di screening sono necessari per poter sviluppare efficaci agenti nanomedicina nuovi.

QDs CdTe hanno effetti anti-microbici da soli ¹⁸ o in combinazione con gli antibiotici. In uno studio precedente, abbiamo dimostrato che l'accoppiamento di antibiotici per CdTe può aumentare la tossicità ai batteri, ma diminuire la tossicità per le cellule di mammifero, a causa della diminuzione della produzione di specie reattive dell'ossigeno dai coniugati ^19. Anche se è improbabile che il cadmio contenenti composti saranno approvati per l'uso nell'uomo, tali preparazioni possono essere utilizzati per la disinfezione di superfici o sterilizzazione di acqua.

In questo protocollo, diamo un approccio diretto per solubilizzare QDs CdTe con acido mercaptopropionico (MPA). I QD sono pronti all'uso nel giro di un'ora. Abbiamo poi dimostrano accoppiamento di un agente antimicrobico.

La seconda parte del protocollodimostra un test di inibizione a 96 pozzetti batterica utilizzando i QD coniugati e non coniugata. La densità ottica è letta su molte ore, permettendo gli effetti di aggiunta QD e l'esposizione alla luce di essere valutato immediatamente e dopo un periodo di recupero. Si illustrano anche un conteggio delle colonie per quantificare la sopravvivenza batterica.

Protocollo

1. QD solubilizzazione

Si tratta di un metodo appropriato per CdTe. Metodi simili possono essere utilizzati con altri tipi di QDs come InP / ZnS ²⁰ e CdSe / ZnS ^21.

1. Preparare una soluzione di QDs CdTe in toluene a 15 pM (densità ottica = 2,5 al picco eccitonico prima).
2. Trasferire 200 ul di questo stock in un flaconcino di vetro. Non utilizzare in plastica!
3. Aggiungere 800 pl toluene, 1 ml di 200 mM tampone borato (pH 9) e 2 microlitri di 11,5 M di acido mercaptopropionico (MPA).
4. Chiudere la fiala ed agitare vigorosamente per 30-60 secondi.
5. Le fasi acquose di solventi organici e separerà spontaneamente. La fase acquosa diventerà il colore dei QD. Per evitare lo strato di toluene, toglierla e gettarla via. Poi trasferire la fase acquosa in una fiala pulita.
6. Purificare i QDs solubilizzati mediante lavaggio / filtraggio quattro volte utilizzando una 500 microlitri, 10000 molecolare cutoff del filtro di peso centrifuga. I filtri devono esserecentrifugato a 3000 xg per 13 minuti. Per almeno gli ultimi due lavaggi, lavare con il tampone finale desiderato.
7. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere i QDs lavati in 50 mM di tampone borato a pH desiderato e conservare a 4 ° C. Saranno stabile per 1-2 settimane.
8. Misurare spettri di assorbimento e di emissione di stimare la concentrazione basato su formule pubblicate ^22.

Risultati rappresentativi: Figura 1 mostra un'immagine di QDs CdTe sotto illuminazione della lampada UV, e gli spettri di emissione prima e dopo solubilizzazione acqua, mostrando variazione trascurabile dallo scambio tappo. I valori di dimensione sono il diametro misurato con microscopia elettronica.

2. Coniugazione QD agli antibiotici

Questa parte del protocollo è applicabile a qualsiasi carica negativa acqua-solubilizzata nanoparticelle, compresi QDs più commerciali, particelle metalliche, e più ^19.

1. Ogni molecola che funziona either autoassembla ai QDs caricati negativamente solubilizzate, o che ha un gruppo reattivo che può essere coniugato, come una ammina primaria. In questo esempio, si utilizza polimixina B (PMB), che è caricato positivamente e autoassembla senza necessità di reagenti coniugazione. Sciogliere il PMB in H ₂ O a 60 pM. (Se l'antibiotico scelto non è solubile in H ₂ O, si dissolvono in DMSO o etanolo ad una concentrazione di 0,1-1 mM). Questo sarà una soluzione 10x (in H ₂ O) o una soluzione 100x (in solvente).
2. Calcolare quanta soluzione QD sarà necessario per gli esperimenti di tossicità batteriche. Per una piastra a 96 pozzetti con 0,3 ml per pozzetto in quadruplicato, 0,5 ml di 200 nM coniugato è necessaria. Preparare due provette contenenti 100 microlitri di 1 pM punti quantici in tampone borato 50 mM.
3. Se l'accoppiamento con una ammina primaria, preparare un 19 mg / mL (100 mM) soluzione di 1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimmide cloridrato (EDC) in H ₂ O. EDC in soluzione non è stabile; Usare immediatamente e gettare via il resto.
4. Aggiungere 50 pl della soluzione di antibiotico 10x (in H ₂ O) o 5 pl della soluzione 100x (in solvente) al tubo coniugato. Per PMB: coniugazione CdTe al rapporto molare di 30:1, aggiungere 50 microlitri di 60 PMB pM. Aggiungi H ₂ O o solventi per il tubo QD unico controllo.
5. Se necessario, aggiungere 1 ml di soluzione di riserva EDC al tubo coniugato.
6. Portare il volume coniugato a 0,5 mL con il tampone appropriato (borato buffer o PBS; non ammine contenenti tamponi quali Tris, in quanto inibisce EDC).
7. Tubi Shield dalla luce con un foglio di alluminio e posto su un nutator o rocker per 1 ora. Se l'aggregazione si verifica, ripetere la coniugazione con concentrazioni più basse di antibiotici. Titolare concentrazione verso l'alto fino a quando le particelle non si aggregano.
8. Lavare i coniugati passando attraverso un filtro appropriato. 10.000 taglio di peso molecolare funziona per la maggior parte degli antibiotici, ma non per le proteine ​​o anticorpi.
9. A seconda della molecola, diversi metodi possono essere utilizzati per stimare il numero di molecole di antibiotici per QD: spettroscopia di assorbanza o fluorescenza, elettroforesi su gel, o spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR).

Risultati rappresentativi. In questo esempio, coniugazione PMB è caratterizzato da variazioni spettro di emissione QD. Figura 2 mostra gli spettri di QDs CdTe con aggiunta PMB.

3. Preparazione dei batteri per lo schermo da 96 pozzetti, determinazione di antibiotici IC ₅₀

Questo è applicabile a qualsiasi ceppo batterico coltivato nel mezzo appropriato ^18. La durata esatta delle registrazioni dovrebbe continuare dipende dalla velocità di crescita batterica. Nel nostro esempio, usiamo Escherichia coli cresciute in brodo lisogenia (LB) media.

1. Per scegliere le concentrazioni appropriate coniugate QD, è importante conoscere laIC ₅₀ della antibiotico da coniugare e se le QDs sole sono tossici. Questo dovrebbe essere iniziato 2 giorni prima dell'esperimento coniugazione. In serata, semi 10 ml di terreno di coltura batterica da una colonia fresca, con una corretta tecnica sterile e la biosicurezza.
2. Il giorno successivo, 1-2 ore prima dell'esperimento, riempire ciascuno dei pozzetti di una chiara-bottom piastra a 96 pozzetti con una quantità quasi-massimale di terreno di crescita. Utilizzando una pipetta multicanale, semi di ogni pozzetto con 1-50 microlitri di coltura batterica (la concentrazione dipende da quanto velocemente il particolare ceppo cresce e dovrà essere calibrata dal laboratorio).
3. Mettere la piastra sulla lettore di piastre e impostare per leggere ogni 10 minuti per 2 ore ad una determinata lunghezza d'onda (di solito 600 nm). Monitorare la piastra in modo che i batteri non crescono troppo denso troppo in fretta.
4. Quando le cellule raggiungono tutti OD = 0,1-0,15, rimuovere la piastra dal lettore di piastre e fermare la registrazione.
5. Aggiungi farmaco da solo e da solo a QDconcentrazioni differenti in almeno triplicato. Uso di un lato della piastra come un controllo "scuro" e una metà da illuminare. Un layout suggerito è data in Figura 3. Le concentrazioni devono abbracciano una vasta gamma sufficiente per includere una concentrazione che inibisce i batteri molto poco, e uno che li uccide tutti.
6. Proteggere il lato "oscuro" della piastra con un foglio di alluminio. Esporre l'altro lato di una lampada a lunghezza d'onda desiderata. Usiamo una consuetudine a 96 pozzetti, 440-nm lampada fatta di 2,4 mW LED (Figura 4) e irradiano per 30-60 min. Le piastre nere con pantaloni chiari aiutare proteggere i batteri non esposte dalla luce diffusa. Una colonna vuota può essere utilizzata anche tra i lati esposti e non-esposti.
7. Dopo l'esposizione alla luce, mettere il piatto nel lettore di piastre e registrare OD 600 ogni 10 minuti per 5-12 ore a seconda tasso di crescita. Mantenere la temperatura <32 ° C, se possibile, per evitare l'essiccamento delle culture.
8. Tracciare le curve di crescitain un punto temporale selezionato vs log [concentrazione] e determinare l'IC ₅₀ di antibiotico utilizzando l'equazione di Hill:

dove H è il coefficiente di Hill, y _max è il punto più alto di crescita (idealmente su un altopiano), e y _min è il punto-zero, anche idealmente su un altopiano. E 'improbabile che QDs solo mostrerà tossicità molto alle cellule alle concentrazioni usate, quindi un valore non sarà determinato.

Risultati rappresentativi. Al termine del periodo di registrazione, pozzetti trasparenti indicherà completa morte delle cellule, e un gradiente di densità cellulare dovrebbe apparire lungo concentrazioni crescenti del farmaco. I batteri dovrebbero mostrare S forma di curve di crescita (figura 5 A), la posizione del plateau massima può variare notevolmente da ceppo a ceppo e dipende anche dalla temperatura. Un punto di tempo determinato può esseree scelto come rappresentativo dei valori rilevati vs Log [antibiotico] per dare l'IC ₅₀ (Figura 5 B). Per valutare la tossicità QD, la sopravvivenza vs Log [QD] può anche essere tracciata, ma per ottenere una significativa uccisione batterica con QDs solo è raro (Figura 5 C).

4. Preparazione dei batteri per lo schermo da 96 pozzetti con antibiotico / QD

1. Il giorno prima dell'esperimento, seme 10 mL della cultura da una colonia fresca nel mezzo adeguato ricchi, corretta utilizzando una tecnica sterile e la biosicurezza. Il QD-antibiotico coniugato deve essere preparata in questo giorno, a meno che è altamente instabile.
2. 1-2 ore prima dell'esperimento, riempire ciascuno dei pozzetti di una chiara-bottom piastra a 96 pozzetti con una quantità quasi-massimale di terreno di crescita. Utilizzando una pipetta multicanale, semi di ogni pozzetto con 1-50 microlitri di coltura batterica.
3. Mettere la piastra sulla lettore di piastre e impostare per leggere ogni 10 minuti per 2 ore alla stessa lunghezza d'onda nella parte 3.
4. Quando le cellule raggiungono tutti OD = 0,1-0,15, rimuovere la piastra dal lettore di piastre e fermare la registrazione.
5. Aggiungi coniugati QD a diverse concentrazioni in almeno quattro esemplari. Uso di un lato della piastra come un controllo "scuro" e una metà da illuminare. Un layout suggerito è data in Figura 6. A batteri-only striscia di controllo deve essere sempre incluso in caso problemi con la temperatura cultura, ecc alterare le condizioni di crescita. Una singola striscia di farmaco e solo QD solo dovrebbero essere inclusi per garantire che corrispondano piastra di controllo fatto in precedenza. Il resto dei pozzetti sono dedicate coniugati per consentire buone statistiche.
6. Proteggere il lato "oscuro" della piastra con un foglio di alluminio. Esporre l'altro lato di una lampada a lunghezza d'onda desiderata.
7. Dopo l'esposizione alla luce, mettere il piatto nel lettore di piastre e registrare OD 600 ogni 10 minuti per 5-12 ore. Mantenere la temperatura <32 ° C, se possibile, per evitare drying delle culture.

Rappresentativi dei risultati. La combinazione di QDs e antibiotici possono essere meno tossici di antibiotico da solo; altrettanto tossici, o più tossici. Questo può essere quantificato utilizzando le curve di crescita e di IC ₅₀ misurazioni. Figura 7 mostra un esempio di coniugati che altrettanto tossici come antibiotico da solo, e un esempio di coniugati che sono più tossici.

5. Tenore di germi

1. Scegliere uno o più pozzi del trattato piastra a 96 pozzetti da utilizzare per diluizioni seriali e conteggio delle colonie.
2. Effettuare una diluizione seriale di ciascuno dei campioni batterici selezionati con soluzione salina o PBS (0,9% NaCl). Trasferire 20 pl della soluzione batterica e diluirlo con 180 ul di soluzione fisiologica, cambiare la punta della pipetta, mix e trasferire 20 microlitri di una soluzione diluita batterica a 180 ul di soluzione salina. Ripetete 6 volte.
3. Prendere 10 microlitri da ogni diluizione e la piastra su un apposito solido supporto piastra. Tutti 8 concentrazioni di un campione può essere posto su una piastra Petri 10 round centimetri, anche se piatti rettangolari sono preferiti in quanto è più facile per allineare le cose.
4. Lasciare asciugare in panchina per 15 minuti. poi incubare a temperatura adeguata per i vostri batteri per 16 ore.
5. Contare le colonie e calcolare unità formanti colonie (CFU) secondo (numero di colonie x fattore di diluizione) / volume cromato = CFU / mL.

La figura 8 mostra una piastra CFU esempio.

6. Risultati rappresentativi

Figura 1. QDs al tellururo di cadmio. (A) Otto preparazioni a base di CdTe QDs illuminato con una bacchetta UV (365 nm). (B) spettri di assorbanza ed emissione di cinque taglie selezionati prima e dopo l'acqua, solubilizzazione. Le linee tratteggiate sono spettri in toluene, le linee continue sono in acqua.

files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg "/>
Figura 2. L'analisi spettrale e gel di QD-PMB coniugati. Orange-emettitori QDs al tellururo di cadmio sono stati utilizzati per questo esempio, gli effetti su altri tipi di QDs dovranno essere valutati per ogni esperimento. (A) assorbanza Tipica (linea grigia) e spettri di emissione (linea nera) dei QDs prima della coniugazione PMB e l'emissione (linea tratteggiata) dopo l'aggiunta di 160 equivalenti molari di PMB. (B) Relazione tra il rapporto del PMB e l'intensità di emissione QD (quadrati) e il picco di posizione lunghezza d'onda (triangoli).

Figura 3. Consigliato layout di piastra per piastra di controllo della crescita. Una vasta gamma di concentrazioni e PMB QD è rappresentata. Una metà della piastra viene irradiato (evidenziata in blu), e un mezzo identico è protetta dalla luce. clic quiper ingrandire figura.

Figura 4. Misura 96-LED lampada per irraggiamento lastra uniforme, mostrando l'aspetto spento e via. Un tipico portatile lampada UV possono anche essere utilizzati, ma non copre l'intera piastra uniformemente.

Figura 5. Risultati di esempio per piastra di controllo della crescita. (A) rappresentativi delle curve di crescita batterica con differenti concentrazioni di farmaco, da 0 a completare la morte cellulare. I simboli aperti sono PMB solo con concentrazioni dato; i simboli sono solidi CdTe-PMB senza irradiazione, e le mezze piene simboli sono CdTe-PMB con irradiazione. L'irradiazione non ha avuto effetto sulle PMB-solo campioni, così queste curve sono stati omessi per chiarezza. Tutti i PMB-CdTe coniugati sono 30:1 PMB: rapporti QD. (B) Terreni di valori curva di crescita a 200 min vs Log [PMB] e si adatta a Eq. (1). Per control per gli effetti di luce, una curva viene fatto con antibiotici solo con 30 minuti di esposizione alla luce. (C) la sopravvivenza batterica a 200 min vs concentrazione QD, utilizzando QDs al tellururo di cadmio. Alcuni tossicità è visto con l'esposizione alla luce, ma troppo poco per determinare un valore di IC _50. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 6. Consigliato layout per la piastra di prova coniugato. La metà blu evidenziata la piastra deve essere esposto alla luce, e la metà non evidenziato viene protetto. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 7. Esempio di risultati per piastra di prova coniugato. Valori di crescita della curva a 200 min erano plotted e in forma di Eq. (1). (A) CdTe-PMB coniugati mostrano un aumento della tossicità sulla PMB solo. (B) oro nanoparticelle Au-PMB coniugati non mostrano un aumento della tossicità sulla PMB solo.

Figura 8. Esempio di una piastra CFU. E. coli seminate in una piastra a 96 pozzetti è stata trattata con QD-PMB con o senza irradiazione per 30 min. poi incubate a 32 ° C per 4 ore. Diluizioni seriali di ciascun campione sono state effettuate batterica con soluzione salina, e 10 pl di 100 X a 10 x ⁷ diluizioni sono state piastrate su piastre di agar. Le piastre sono state incubate a 37 ° C e le colonie sono state contate dopo 16 ore. La tavola mostra le diluizioni lungo le righe come indicato, le colonne sono: (A) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe, (B) 0,12 PMB pM + 4 nM CdTe (C) 0,2 pM PMB + 6,7 nM CdTe, (D) 0.06 pM PMB + 2 nM CdTe irradiati, (E) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe irradiati, (F) 0,2 pM PMB + 6,7 nM CdTe irrairraggiato.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Le nanoparticelle rappresentano un promettente approccio per la creazione di nuovi agenti antimicrobici. Analisi della curva di crescita è un modo per monitorare la densità delle cellule batteriche che distingue le cellule attivamente, in crescita da inibito la crescita delle cellule. Una volta accoppiato con conta su piastra, consente una analisi approfondita del potenziale antibiotico di un coniugato. Il formato a 96 pozzetti permette variazioni relativamente high-throughput di concentrazione e le altre condizioni, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Componente tampone borato # 1	Pescatore	L'acido borico A-74-1
Componente tampone borato # 2	Sigma-Aldrich	Sodio Tetraborato B9876
MPA	Sigma-Aldrich	M5801
Vivaspin 500	GE Healthcare	28-9322	Varie MWCO disponibili
Flaconcini di vetro	Pescatore	03-338C
EDC	Sigma-Aldrich	E6383
Polimixina B	Sigma-Aldrich	P1004
Gr battericaowth medio (LB) Component # 1	Pescatore	NaCl S271
Crescita media batterica (LB) Component # 2	BD	Triptone 211705
Terreno di crescita batterica (LB) Component # 3	BD	Estratto di lievito 211929
Lampada per esposizione alla luce	Costume
Clear-fondo piastre da 96 pozzetti	Pescatore	07-200-567 o 07-200-730
Spettrometro a fluorescenza	Molecular Devices
Assorbanza lettore di piastre	Molecular Devices
BactoAgar per i supporti solidi	Bioshop	AGR001.1
Piastre di Petri intorno	Pescatore	08-75-12
Piastre di Petri rettangolari	Pescatore	08-757-11A