Generazione di un immortalato Murine Linea microvascolare Brain Cell endoteliali come<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Cervello Modello barriera

Riepilogo

Questo metodo descrive come isolare e immortalare cellule endoteliali microvascolari di cervello di topo. Descriviamo un passo-passo protocollo partire dalla omogeneizzazione del tessuto cerebrale, mineralizzazione, semina e immortalizzazione delle cellule. Di solito, ci vogliono circa cinque settimane per ottenere una omogenea, immortalato linea microvascolare delle cellule endoteliali.

Abstract

Cellule epiteliali ed endoteliali (EC) sono paracellulare costruzione di barriere che proteggono il tessuto dall'ambiente esterno e interno. La barriera emato-encefalica (BBB), composto da CE, astrociti finali piedi, periciti e la membrana basale è responsabile per la protezione e l'omeostasi del parenchima cerebrale. Modelli in vitro BBB sono strumenti comuni per studiare la struttura e la funzione del BBB a livello cellulare. Un numero considerevole di diversi modelli in vitro BBB sono stati stabiliti per la ricerca in laboratori diversi fino ad oggi. Solitamente, le cellule sono ottenute da bovini, suini, cervello di ratto o topo tessuto (discusso in dettaglio nella rassegna di Wilhelm et al. ^1). Campioni di tessuti umani sono disponibili solo in un numero limitato di laboratori o società ^2,3. Mentre preparazioni di cellule primarie sono in termini di tempo e le culture della CE può variare da lotto a lotto, la creazione di immortalato CE lines è al centro di interesse scientifico.

Qui vi presentiamo un metodo per stabilire una linea immortalato cervello microvascolare CE, dal cervello di topo neonatale. Descriviamo il passo-passo la procedura profilo reagenti e le soluzioni utilizzati. Il metodo stabilito dal nostro laboratorio permette l'isolamento di una linea omogenea immortalato cellule endoteliali entro quattro o cinque settimane. Le linee di cellule microvascolari cerebrali endoteliali definito CEND ⁴ (da corteccia cerebrale) e cerebEND ⁵ (da corteccia cerebellare), sono stati isolati secondo questa procedura in laboratorio Förster e sono state effettivamente utilizzate per la spiegazione dei diversi processi fisiologici e patologici a BBB. Utilizzando CEND e cerebEND abbiamo dimostrato che queste cellule rispondono a glucocorticoidi ^4,6-9 ed estrogeno-trattamento ¹⁰ nonché a pro-infammatory mediatori, come TNFalfa ^5,8. Inoltre, abbiamo studiato la patologia multiple sclerosis ¹¹ e ipossia ^12,13 sul CE-livello. Il CEND e linee cerebEND può essere considerata un valido strumento per studiare la struttura e la funzione delle risposte, BBB cellulari di EC per diversi stimoli o interazione del CE con linfociti o cellule tumorali.

Protocollo

1. Isolamento di Brain microvasi

1. Per ogni preparazione utilizzare 5-10 topi neonati di entrambi i sessi (3-5 giorni).
2. Euthanize un mouse a seconda locali IACUC / veterinario raccomandazioni, rimuovere il cervello immediatamente, e trasferire in una piastra Petri contenente la seguente soluzione: 15 mM Hepes (pH 7,4), 153 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,3 mM CaCl ₂ 2H ₂ x O, 2,6 mM MgCl ₂ x 6H ₂ O, 1% (w / v) BSA (di seguito denominato come tampone A).
3. Se non diversamente indicato, tutte le procedure di isolamento deve essere eseguita a temperatura ambiente (RT) (22-24 ° C) sotto la cappa a flusso laminare. Tagliare i cervelli (cervello senza cervelletto e tronco encefalico), dopo la rimozione delle meningi e frammenti capillari, in tampone A utilizzando un bisturi sterile. Pipettare il tessuto frammenti su e giù con una pipetta 10 ml fino a quando non appaiono grumi. Trasferire la sospensione in un tubo Falcon da 50 ml e centrifugare a 250 xg per 5 min a RT.

Nota: Meningi possono essere identificati come sottili membrane trasparenti alla superficie del tessuto cerebrale. Essi possono essere accuratamente rimosso con una pinza sterile.

4. Eliminare il surnatante.
5. Sciogliere il precipitato in 4,5 ml di tampone A con 1,5 ml di 0,75% (w / v) di collagenasi / dispasi (Roche) e incubare per 45 min a 37 ° C in un bagno d'acqua (occasionalmente agitazione).
6. Nel frattempo, preparare le piastre da 12 pozzetti con rivestimento quattro pozzetti con collagene IV (0,1 mg / ml sciolti in 50 mM di acido acetico). Consentono di aderire per 1 ora.
7. Arrestare la digestione mediante aggiunta di 15 ml di tampone ghiacciato A. risospendere il pellet accuratamente.
8. Centrifugare la sospensione a 250 xg per 10 min a RT.
9. Eliminare il surnatante.
10. Per rimuovere mielina, aggiungere 10 ml 25% (w / v) BSA (Sigma, purezza> 98%) e centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C. BSA 25% deve essere sciolto in PBS 1x (PAA Laboratories) e filtrata attraverso f 0,2 micronilter).
11. Eliminare attentamente il supernatante, sciogliere il precipitato in 10 ml di tampone A e trasferire in una nuova provetta Falcon.
12. Centrifugare la sospensione a 250 xg per 5 min a RT. Il pellet risultante contiene le cellule endoteliali.
13. Lavare due volte il collagene IV rivestita 12-pozzetti con PBS.
14. Risospendere il pellet in 4 ml di mezzo di crescita (DMEM contenente 10% FCS, 50U/ml penicillina / streptomicina, 1% di L-glutammina) e la piastra di sospensione cellulare in due pozzetti, 2 ml per ciascun pozzetto. Aggiungere la puromicina ad una concentrazione finale di 4 mg / ml e incubare per 45 min a 37 ° C in un incubatore per colture cellulari. Questo passaggio consente la rimozione di cellule in rapida aderenti Nota:. Puromicina è aggiunto per 24 ore. Solo cervello EC può metabolizzare, per altri tipi cellulari puromicina è tossico ^14.
15. Trasferire il 2 ml di terreno contenente le cellule non aderenti dal passo 1,14 in due pozzetti freschi (questi pozzetti contengono la frazione CE). Riempire i pozzetti con cellule aderenti da step 1,14 con 2 ml di mezzo fresco (questi pozzetti contengono altri tipi di cellule, ad esempio, fibroblasti e astrociti possono essere coltivate in parallelo e utilizzato per il confronto di morfologia).
16. Modificare il mezzo il giorno seguente.

2. Immortalando le cellule cerebrali endoteliali microvascolari

1. Coltivare il GP + E-86 Neo (GPENeo) ¹⁵ fibroblasti, che secernono una replica carente di virus con oncogene polioma centrale T in mezzo DMEM contenente 10% FCS inattivato al calore, 50U/ml penicillina / streptomicina, e 2 mg / ml di G418 ( . PAA Laboratories) in gelatina fiasche rivestite Nota: Polyoma metà trasfezione oncogene T provoca vantaggio di crescita delle cellule endoteliali nel non-ECS portando ad un monostrato omogeneo di cellule con morfologia endoteliale 4 a 6 settimane della cultura. GPENeo non sono disponibili in commercio e possono essere ottenuti come comune materiale pubblico (si prega di fare riferimento a pubblicazioni originali ^4,16).
2. Per utilizzare il virus per mezzo contenente immortalizzazione, coltivare le cellule in GPENeo G418 terreno privo per 24 ore.
3. Rimuovere 10 ml del surnatante e aggiungere GPEneo Polybrene (hexadimethrine bromuro) (Sigma) ad una concentrazione finale di 8 mg / ml, sterilizzare mediante 0,45 micron filtro per rimuovere i frammenti cellulari.
4. Rimuovere il terreno di crescita dalle culture CE preparati nella Parte 1 e aggiungere 2 ml di surnatante GPEneo / Polybrene miscela nei pozzetti. Ripetere il giorno dopo con un fresco GPEneo supernatante / Polybrene miscela Nota:. Polybrene è usato per fare pori nella parete cellulare di facilitare l'infezione con particelle virali).
5. Rimuovere il surnatante / Polybrene GPEneo miscela il giorno seguente, lavare le cellule due volte con PBS e mantenere le cellule nel mezzo di crescita cambiandolo ogni 3 giorni. Alla confluenza, dividere le celle 1:2 su collagene IV piastre rivestite.
6. In genere, stabili cerebrali endoteliali (CEND) linee cellulari devono essere ottenuti dopo 4-5 settimane.

e "> 3. coltivando le cellule endoteliali microvascolari cerebrali

1. Scongelare le cellule di cryoaliquot a bagnomaria e il trasferimento in 15 ml-Falcon con 10 ml di pre-riscaldato media.
2. Centrifugare la sospensione a 250 xg per 5 min a RT.
3. Rimuovere medie, trasferire il pellet nel collagene IV rivestita T _{25 cm} ² pallone di coltura cellulare con pre-riscaldato mezzo di crescita (densità cellulare per placcatura dovrebbe essere di almeno 1 x 10 ⁴ cellule / ml).
4. Cambiare media il giorno dopo e dopo che le cellule raggiunto confluenza (in genere dopo 5 giorni) dividere le celle.

4. La divisione della CEND-cellule (Nota: La divisione dovrebbe essere fatto solo una volta a settimana, evitare di spaccare superiore a 1:4).

1. Estrarre il supporto, lavare le cellule con PBS.
2. Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA caldo soluzione (PAA Laboratories) (T _{75 cm} ² beuta), incubare a 37 ° C e attendere strato di cellule viene disperso (di solito entro 5 a 15 minuti).
3. Aggiungere 5 ml ocrescita media f, pipettare su e giù, e il trasferimento ad un nuovo collagene IV rivestita pallone.

5. Congelamento dei CEND-cellule

1. Ottenere la sospensione cellulare come descritto nel passaggio 4
2. Centrifugare la sospensione a 250 xg per 5 min a RT.
3. Risospendere il pellet cellulare (ottenuto da 1 T _{75 cm} ² pallone) in 6 ml di mezzo di congelamento (95% mezzo di crescita, 5% DMSO).
4. Dividere la sospensione cellulare in quattro 1,5 ml crio-aliquote. Nota: un crio-aliquota può essere seminato su T _{25 cm} ² pallone.
5. Conservare i-aliquote congelate a temperatura azoto liquido vapore.

CEND terreno di crescita: 450 ml DMEM, 10% FCS, 10 ml L-glutammina, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, piruvato natrium 10 ml, 50 U / ml di penicillina / streptomicina

6. Risultati rappresentativi

Le cellule CEND e cerebEND sono stati caratterizzati da immunostainings endoteliale di unnd BBB marcatori nonché da misure di transendoteliale resistenza elettrica (TEER) e permeabilità. Il CEND e cerebEND aveva una morfologia simile a colture primarie di cervello ECS, con monostrati di cellule allungate, serrato che mostravano inibizione della crescita a confluenza. Le cellule esprimono livelli rilevabili di ben claudina-5, occludina e VE-caderina proteine ​​che sono state localizzate le giunzioni cellula-cellula, come mostrato mediante immunofluorescenza (Figura 3) ^4,5. Coltivazione di cellule in CEND siero ridotto medie portato ad un aumento TEER (da 150 Qcm ² in presenza di 10% siero di 500 Qcm ² in presenza di 2% di siero), che è stato potenziato con l'aggiunta di idrocortisone (800 Qcm ²⁾ o insulina (1000 Qcm ^{2) 4.} Monostrati di CEND coltivati ​​in siero ridotto mezzo per 21 giorni era di 900 Qcm TEER ² (Figura 4). TEER è stata misurata utilizzando un assiemecontenenti elettrodi di corrente e tensione passeggera di misura Strumenti di precisione (Mondo). Per confronto, il primario microvascolare cervello EC è stato segnalato per avere valori di 200-600 Teer Qcm ² e una linea cellulare disponibile in commercio del mouse bEnd.3 avuto Teer valori di 100-140 Qcm ² (per la revisione recente si veda Abate 2005 e Toth et al., 2011 ^17,18). Inoltre, il passaggio di macromolecole, come la non-carica FITC-destrano delle masse molecolari 4, 10, 70 e 500 kDa, o fluoresceina (300 Da) attraverso il monostrato di CEND in terreno di differenziamento 2% FCS oltre 4 ore è diminuito rispetto a cellule di controllo mantenute in terreno di crescita contenente 10% FCS: flusso paracellulare è ridotto al 30% di cellule di controllo per la fluoresceina, al 26% di FITC-destrano 10 e 70 kDa, ed il flusso è stato ridotto a 4,5% di cellule di controllo per FITC -dextrtan 500 kDa. Simile a Teer valori, la permeabilità era al livello più basso nelle cellule coltivate in presenza di Glucocorticoids (GC) ^4. In ulteriori studi, sono stati identificati i geni bersaglio glucocorticoidi, occludina, claudina-5 e VE-caderina in endotelio vascolare cerebrale ^4,7,9. Trattamento GC portato ad un aumento della espressione di queste proteine ​​e al riarrangiamento di VE-caderina al citoscheletro. La diretta GC-mediata regolazione della stretta giunzione proteine ​​occludina e claudina-5 appare attraverso elementi di risposta GC nelle loro regioni promotrici ^4,7,19. Inoltre, claudina-5 è stato identificato come un bersaglio estrogeni romanzo in endotelio vascolare ^10.

Alla base di disfunzioni endoteliali molte malattie differenti. Abbiamo colto il CEND sotto ossigeno / glucosio deprivazione (OGD) condizioni. OGD portato alla interruzione della funzione BBB, che potrebbe essere ricostituita dopo il trattamento combinato con GC e inibitore del proteasoma bortezomib ^12. Condizioni OGD portato ad un forte aumento del glucosio e nell'espressione di traspor glucosioTERS in cerebEND, che potrebbe essere attenuata mediante l'aggiunta di mk801, un inibitore non competitivo del recettore ^NMDA-13.

Figura 1. Morfologia del cervello cellule endoteliali microvascolari (CEND) una settimana dopo l'isolamento. Immagini microscopia ottica sono stati presi sotto il 6x (A) e 15x (B) ingrandimento. Le colonie isola-formate di cellule endoteliali sono visibili.

Figura 2. Morfologia del cervello cellule endoteliali microvascolari (CEND) un mese dopo l'isolamento e immortalizzazione. Immagini microscopia ottica sono state scattate sotto l'ingrandimento 15x. Un confluenti, monostrato omogeneo cellule endoteliali possono essere osservati.

Figura 3. Cervello microvascul Immortalatoar cellule endoteliali esprimono claudina-5, occludina e VE-caderina. CEND cellule sono state coltivate su collagene IV rivestite coprioggetto e colorate con anticorpi contro claudina-5 (A), occludina (B) e VE-caderina (C). Le immagini sono state scattate con un microscopio Zeiss Axioscop2 sotto l'ingrandimento 40x.

Figura 4. Misura della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) del CEND monostrato. CEND sono state coltivate su collagene IV rivestite filtri transwell (dimensione dei pori 0,4 micron). Dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule sono state mantenute in terreno contenente 2% di FCS. TEER è stata misurata dopo 7, 14 e 21 con un assembly che contiene elettrodi di corrente e tensione passeggera di misurazione.

Discussione

La procedura descritta può essere utilizzato per l'isolamento di microvascolare ECS di diversi ceppi di topi nonché da diversi knock-out ceppi di topo per studiare le variazioni specifiche funzione vascolare. Come metodo di immortalizzazione abbiamo utilizzato la trasformazione con oncoproteina di poliomavirus murino, Polyoma mezzo antigene T. Si trasforma rapidamente immature cellule endoteliali in vivo e in vitro ^20,21,22. Altri metodi di immortalizzazione di ECs descritti in letteratura includono per esempio l'immortalizzazione con SV40 antigene T grande di Simian Virus vacuolizzante 40 ^23, prodotto genico adenovirus E1A ²⁴ o sovraespressione della subunità catalitica della telomerasi umana ^3. L'immortalizzazione con PymT è specifico per il murina EC immaturo, che consente di ottenere una cultura omogenea CE da topi neonati in breve tempo. Immortalizzazione modifica le proprietà delle cellule e THrisultati ottenuti elettroniche con linee cellulari immortalizzate devono essere confrontati sia con cellule primarie o con esperimenti in vivo con topi. PymT immortalato CE è stato descritto per esprimere elevati livelli di attività fibrinolitica risultanti dalla produzione aumentata di urochinasi, attivatore del plasminogeno di tipo e diminuita produzione di plasminogeno inibitori ^25. Confronto diretto PymT immortalato bEND5 linea cellulare con primario EC rivelato che sia in vitro modelli BBB sono adatti per studi di adesione cellulare T ^26.

Le linee cellulari stabilite secondo la procedura descritta può essere utilizzata al numero passaggio basso per mantenere le proprietà di barriera per l'espressione di proteine ​​BBB e CE giunzionali, come cellule perdono queste proprietà durante l'invecchiamento. Così dopo la perdita di proprietà barriera, la preparazione di una nuova linea cellulare dovrebbe essere considerato. Placcatura densità delle cellule dovrebbe essere alto per EC, in quanto questo è un fattore critico per la proliferazione cellulare. Questo deve essere considerato nel corso della procedura di isolamento, nonché il mantenimento della immortalato EC. Ogni linea cellulare dovrebbe essere testato per le sue proprietà di barriera e di eventuali contaminanti con altri tipi cellulari. Monostrati CE può essere trattata con l'antigene muscolare anti-galactocerebroside, anti-proteina acidica fibrillare gliale e anti-liscia come anticorpi primari per escludere la contaminazione con gli oligodendrociti, astrociti e periciti ^4,27. Per escludere la contaminazione da vascolatura meningal, l'espressione di trombomodulina può essere testata, che è espresso in tutti i letti vascolari con l'eccezione del cervello ^28.

È interessante notare che le linee cellulari immortalizzate microvascolari endoteliali isolate da differenti regioni del cervello si differenziano per le loro proprietà di barriera e la suscettibilità a stimoli pro-infiammatori. Come esempio, i CEND cerebrale e cerebellare linee cellulari cerebEND possono citare ^4,5. CerebEND mostrato, in confrontoa CEND, più bassi livelli di espressione delle principali componenti di giunzione strette claudina-1 e occludina. Tuttavia, i livelli di claudina-3 e -12 erano più elevati nei cerebEND. La funzione di barriera di cellule cerebEND sofferto molto più sotto un trattamento con il mediatore infiammatorio, TNFa che le proprietà di barriera di cellule CEND fatto ^5. Maggiore vulnerabilità cerebellare a stimoli infiammatori, può essere osservato in vivo in pazienti con sclerosi multipla e nel suo modello sperimentale animale di encefalomielite autoimmune ^29. Questi risultati interessanti mostrano la necessità di generare e caratterizzare individuale modelli in vitro per diverse regioni del cervello, per migliorare il farmaco futuro mira nel cervello.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Albumina di siero bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Purezza> 98%
collagene IV	Sigma-Aldrich	C5533	50 ug / ml in 50 mM di acido acetico
Collagenasi / dispasi	Roche	10269638001
Mezzo di Dulbecco Eagle modificato (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Fetal Calf Serum (FCS)	PAA Laboratories	A15110-1333	concentrazione finale del 10%, inattivato al calore (30 min a 56 ° C)
L-glutammina	Biochrom AG	K0282	Conservazione: ≤ -15 ° C
MEM Vitamine	Biochrom AG	K0373	Conservazione: ≤ -15 ° C
Na-piruvato	Biochrom AG	L0473
Neomicina (G418)	PAA Laboratories	P11-012
Non aminoacidi essenziali (NEA)	Biochrom AG	K0293	Conservare a 4 ° C
Penicilin / streptomicina	Biochrom AG	A2212	Conservazione: ≤ -15 ° C
Tampone fosfato salino (PBS)	Biochrom AG	L1825
Polibrene (hexadimethrine bromuro)	Sigma-Aldrich	107689	0,8 mg / ml in PBS, conservazione a -20 ° C
Puromicina	Sigma-Aldrich	P8833
Tripsina / EDTA	Biochrom AG	L1825	0,05%, 0,02% EDTA in PBS