Immunoistochimica Wholemount per rivelare Topografia Cervello Complex

Riepilogo

Circuiti neurali sono topograficamente organizzate in compartimenti funzionali con specifici profili molecolari. Qui, forniamo i passi pratici e tecnici per rivelare la topografia globale del cervello utilizzando un approccio versatile wholemount colorazione immunoistochimica. Abbiamo dimostrato l'utilità del metodo che utilizza il ben capito citoarchitettura e circuiti del cervelletto.

Abstract

L'architettura ripetuto e ben compreso cellulare del cervelletto ne fanno un sistema modello ideale per esplorare la topografia del cervello. Alla base della sua citoarchitettura relativamente uniforme è una complessa serie di domini parasagittali del gene e l'espressione delle proteine. La compartimentazione molecolare del cervelletto si riflette l'organizzazione anatomica e funzionale delle fibre afferenti. Per apprezzare pienamente la complessità di organizzazione cerebellare in precedenza abbiamo affinato un approccio wholemount colorazione ad alto rendimento per l'analisi dei difetti di patterning nel cervelletto mouse. Questo protocollo descrive in dettaglio i reagenti, strumenti e misure pratiche che sono utili per rivelare con successo pattern di espressione delle proteine ​​nel cervelletto topo adulto utilizzando immunostaining wholemount. I passaggi qui evidenziati dimostrare l'utilità di questo metodo utilizza l'espressione di zebrinII / aldolaseC come esempio di come la topografia sottile del cervello può essere rivelato nel suonativo conformazione tridimensionale. Anche descritto sono adattamenti al protocollo che permettono la visualizzazione di espressione della proteina in proiezioni afferenti e cervelletti grande per gli studi comparativi di topografia molecolare. Per illustrare queste applicazioni, i dati di colorazione afferente del cervelletto di ratto sono inclusi.

Protocollo

1. Animal perfusione e dissezione Cervelletto

1. A seconda della proteina, perfusione può essere essenziale per ^1,2 colorazione successo. Perfusione transcardiaca è invasivo, non la sopravvivenza procedura che richiede il corretto uso di anestetici. Corretta formazione, approvazione istituzionale, e l'approvazione IACUC sono tutte necessarie prima di tentare la procedura. E 'sempre una buona idea di consultare i veterinari dell'ente per ottenere aiuto per identificare i requisiti sperimentali e l'acquisizione di un corretto allenamento. Prima della procedura, l'animale deve essere profondamente anestetizzati e non risponde agli stimoli, come a piedi o pizzico coda. Utilizzando forbici fare un taglio nella pelle addominale e parete muscolare e quindi continuare ad aprire la gabbia toracica, tagliando appena adiacente allo sterno su ogni lato. Inoltre, il sperimentatore può creare un più ampio spazio utile interno tagliando la fascia che circonda la membrana. Sollevando la parete addominale e toracica superiorly, il cuore sarà ora esposto. Effettuare un piccolo taglio nell'atrio destro per permettere al sangue di fluire e immediatamente inserire l'ago perfusione nel ventricolo sinistro. Una pompa idrostatica di base è preferito fornire le soluzioni di perfusione (vedi Tabella 1 per i dettagli). In primo luogo, lavare il sangue con fosfato 0,1 M soluzione salina tamponata (PBS, vedi Tabella 3) fino a quando il liquido si chiaro. Quindi, spegnere la pompa idrostatica, passare velocemente il tubo di mandata soluzione ad un contenitore del 4% paraformaldeide (PFA, vedi Tabella 3) diluito in PBS e poi girare la pompa a consegnare il fissativo. L'uso di una pompa non è necessaria: con la pratica, due siringhe riempito con PBS e il 4% PFA possono essere usati per fornire lentamente le soluzioni.
2. È fondamentale sezionare accuratamente il cervello dal cranio senza introdurre alcuna lesione al tessuto. Anche le piccole lacerazioni al cervello durante la dissezione amplierà gradualmente nelle fessure visibili cheanticorpi trappola e causare macchie artefatti durante la lavorazione del tessuto (ad esempio asterischi rossi in figura 2). Per dissezioni cerebellari, è tipico per tagliare la pelle lungo il centro della testa e poi delicatamente provocare gli lembi parte per esporre il cranio. Tagliare il cranio da anteriore a posteriore lungo la linea mediana dorsale, e anche lateralmente lungo entrambi i lati del cranio. Non tagliare oltre il bregma come questo corre il rischio di intaccare il cervelletto. Utilizzando pinze sollevare delicatamente la parte anteriore del cranio fuori dal cervello facendo attenzione a non strappare il tessuto cerebrale che è collegato alle meningi. Recidere i nervi cranici sul lato ventrale del cervello.
3. Separazione del cervelletto dal resto del cervello è importante per due motivi. In primo luogo, esso consente di esplorazione di pattern di espressione nei lobuli anteriori, che sono nascosti alla vista dal collicoli in situ. La seconda è che separare il tessuto in più piccole, le regioni isolate consente more fissaggio completo, che può facilitare la colorazione di alcune proteine. Durante questa fase la dissezione finale, si deve prestare attenzione a non toccare il cervelletto con le punte della pinza. Inserire le punte di un paio di pinze in mezzo ai collicoli superiori e inferiori. Con una seconda serie di pinze lentamente stuzzicare via il collicoli inferiore del cervelletto. Poi, c'era il cervelletto in modo che il suo lato anteriore sia rivolto verso il basso e il tronco cerebrale sia rivolto verso l'alto. Inserire le pinze nel quarto ventricolo tra il tronco encefalico e lobuli IX / X del cervelletto. Tagliare i peduncoli da pizzicare con le pinze da entrambi i lati e poi sollevare delicatamente il cervelletto dal tronco encefalico. Una volta che il cervelletto è isolato, post-fissare mediante immersione in PFA 4% a 4 ° C per un minimo di 24-48 ore. Il cervelletto può essere memorizzato in PFA 4% per un periodo prolungato di tempo. Le meningi devono essere rimossi prima o dopo colorazione per una migliore visibilità dei pattern di espressione.Se il sperimentatore sceglie di rimuovere le meningi prima della colorazione vi è una forte possibilità che il cervelletto verranno intaccate durante il processo. Rimossi i meningi al termine della procedura di colorazione è molto più semplice poiché diventano più facile individuare dopo acquisiscono una debole colorazione di fondo diventano fragili e post-elaborazione.

2. Elaborazione del tessuto per la colorazione Wholemount

Poiché il metodo di colorazione wholemount richiede più di colorazione immunoistochimica di sezioni di tessuto, è utile programmare i tempi per ciascuno degli esperimenti, come mostrato nel calendario esempio fornito (Tabella 2). Prima di iniziare, ci sono diverse cose importanti da tenere a mente. 1) Le microprovette contenenti il ​​tessuto deve essere ruotato su un nutator in qualsiasi momento, tranne durante il congelamento / scongelamento processo. 2) Diverse soluzioni devono essere fresco per ogni esperimento (vedi Tabella 3 per le ricette di soluzione). 3)In tutto il protocollo, quando si cambia soluzioni, delicatamente versare la soluzione esausta, piuttosto che rimuovere il cervelletto con le pinze, per evitare di toccare il cervelletto. Poi, dopo la miscelazione la nuova soluzione in un altro contenitore, una pipetta per aggiungere lentamente la soluzione fresca al tubo.

2,1 Giorno 1:

1. Fissare il cervelletto in ³ fix Dent a temperatura ambiente per 6-8 ore dondolandosi dolcemente sulla nutator. Se il metanolo è distruttivo per il vostro antigene, sostituire i passaggi attraverso 2.1a 2.3a con un metodo di recupero antigene. Il calore e tamponi utilizzati per il recupero dell'antigene contribuirà a preparare il tessuto per la penetrazione degli anticorpi.
2. Bleach Bleach del cervelletto in Dent a ³ notte a 4 ° C.

2,2 Giorno 2:

1. Disidratare il cervelletto in due turni di 100% MeOH a temperatura ambiente per 30 minuti ciascuno.
2. Quindi, per migliorare la penetrazione delle soluzioni, soggettoil tessuto ad una serie di congelamento / scongelamento. Posizionare il tubo in un contenitore con ghiaccio secco e congelare per 30 min. Quindi, rimuovere il tubo e lasciarlo a temperatura ambiente in panchina per 15 minuti. Il gelo / disgelo passo deve essere effettuata quattro volte (almeno).
3. Dopo l'ultimo scongelamento del tessuto, inserire il tubo in un congelatore a -80 ° C per una notte.
4. Il tessuto può essere immagazzinato per lunghi periodi di tempo a -80 ° C o immediatamente prima o dopo il congelamento / scongelamento passi. In caso contrario, il protocollo deve essere continuato.

2,3 Giorno 3:

1. Reidratare il cervelletto mediante lavaggio in 50% MeOH/50% PBS, 15% MeOH/85% PBS, e il 100% PBS per 60-90 minuti a temperatura ambiente.
2. Successivamente, per l'adulto del mouse cervelletti, soggetti del tessuto alla digestione enzimatica con proteinasi K 10μg/ml in PBS per 2-3 minuti. Nessun passo è necessario per la digestione cervelletti di animali giovani (P5 o più giovani nel topo). Più digestion è consigliato per i più grandi cervelli. Ad esempio, la digestione può essere l'altezza di 5-6 minuti per cervello dei primati ^4.
3. Dopo la digestione, immediatamente lavare il cervelletto in PBS tre volte per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente per rimuovere la proteinasi K.
4. Bloccare il tessuto in PMT (vedi Tabella 3) notte a 4 ° C. Il latte in polvere è spesso la prima scelta quando si seleziona un agente bloccante di lavoro proteina perché è poco costoso, riduce effettivamente la colorazione di fondo, e tipicamente non interferisce con il legame anticorpo o l'accesso al antigene. Sieri animali possono anche essere utilizzati, sebbene la sperimentatore deve essere a conoscenza dei costi aggiuntivi e devono prima verificare la qualità siero per cross-reattivi immunoglobuline e capacità di produrre un segnale ottimale rispetto al rumore.

2,4 Giorno 4-5:

1. Incubare il tessuto in anticorpi primari diluiti in PMT supplementati con DMSO 5% per 48 ore a 4 ° C (Larger cervelletti richiederà tempi di incubazione maggiore).

2,5 6 ° giorno:

1. Lavare il cervelletto 2-3 volte per 2-3 ore ciascuno in PMT a 4 ° C per rimuovere gli anticorpi non legati primari.
2. Quindi, incubare il tessuto in anticorpi secondari in una soluzione contenente PMT con DMSO 5% a 4 ° C per una notte (maggiore cervelletti può richiedere tempi di incubazione aumento).

2,6 Giorno 7:

1. Lavare il cervelletto 2-3 volte per 2-3 ore ciascuno in PMT a 4 ° C.
2. Dare il tessuto un lavaggio finale con PBT (cfr. tabella 3) per 1-2 ore. Questo passaggio elimina il latte in eccesso e migliora la chiarezza della colorazione.
3. Infine, incubare il tessuto in DAB (3,3 '-diaminobenzidina) soluzione fino alla intensità di colorazione ottimale è raggiunta. Il prodotto di reazione marrone deve essere chiaramente visibile in ~ 10 minuti. E 'meglio usare DAB al buio come la luce fa sì che il cromogeno precipitazionete, che possono aumentare la colorazione di fondo.

2,7

Quando l'intensità di colorazione ottimale è raggiunta, arrestare la reazione inserendo il cervelletto in PBS con 0,04% di sodio azide. Il tessuto può essere immagazzinato a lungo termine in questa soluzione. La sodio azide è un potente inibitore della crescita batterica, ma dovrebbe essere evitato fino a questo passo dal momento che inibisce anche perossidasi di rafano.

2,8 procedura di amplificazione Optional:

seguire il protocollo normale, ma queste procedure devono essere eseguite in luogo di passi 2.5b-2.7 di cui sopra.

1. Incubare il tessuto notte a 4 ° C in anticorpi secondari coniugati biotina-in PBST (vedi Tabella 3) con 5% di DMSO.
2. Lavare il tessuto per 2-3 ore ciascuno in cambiamenti di PBST 3-4 a temperatura ambiente.
3. Incubare il cervelletto notte a 4 ° C in soluzione ABC complessa in PBST.
4. Sciacquare il tessuto per 2-3 ore ciascuno atemperatura ambiente in 3-4 variazioni di PBS.
5. Incubare il tessuto appena preparata in soluzione DAB, come descritto sopra.
6. Quando la colorazione è ottimale, arrestare la reazione mediante lavaggio del cervelletto in PBS con 0,04% di sodio azide.

3. Imaging del Tissue Stained

1. Wholemount immagini possono essere catturate utilizzando, ad esempio, una macchina fotografica Leica DFC3000 FX montata su uno stereomicroscopio Leica MZ16 FA esecuzione Leica Application Suite software FX. Se desiderato, microscopia deconvoluzione può essere utilizzato per acquisire più immagini consecutive in differenti piani focali, con ogni immagine avente solo un singolo lobo a fuoco fresco. Poi, le immagini possono essere compressi in un unico stack e software reso per rimuovere la distorsione. L'immagine composita finale illustrerà cerebellari pattern di espressione superficie con tutti i patterning visibile in chiaro focus.
2. Tessuto tinto Wholemount deve essere ripreso mentre si è immersi in PBS (o altro supporto che darà unindice di rifrazione ottimale). Al fine di posizionare facilmente il wholemount per l'imaging, fare un gel di agar 1% in una capsula Petri di plastica. Tagliare piccoli fori nel gel. I fori che permettono il cervelletto di essere incuneato l'orientamento desiderato.
3. I dati grezzi vengono importati in Adobe Photoshop CS4 e rettificato per livelli di contrasto e luminosità.

Animali

Tutti gli studi sugli animali sono stati effettuati nel quadro di un protocollo approvato animale IACUC secondo le linee guida istituzionali di Albert Einstein College of Medicine. Maschio e femmina outbred svizzera Webster (Taconic, Albany, NY), i topi sono stati mantenuti nella nostra colonia e utilizzata per tutti gli studi. Ratti adulti eutanasia sono stati gentilmente forniti dal Dr. Bryen Jordan (Albert Einstein College of Medicine). Tutti gli animali sono stati almeno un mese.

4. Risultati rappresentativi

Il cervelletto è compartimentato mediante l'espressione molecolare in quattro zone trasversali:la zona anteriore (AZ: ~ lobuli IV), la zona centrale (CZ: ~ lobuli VI-VII), la zona posteriore (PZ: ~ lobuli VIII-IX dorsale) e la zona nodulare (NZ: ~ lobuli ventrale IX e X ) 5. Ogni zona contiene una serie unica di parasagittale strisce ^1,2,5,6 (Fig. 1). ZebrinII espressione in cellule di Purkinje rivela strisce in AZ e PZ (Fig. 2) e l'espressione uniforme in CZ e NZ (Fig. 2). L'organizzazione parasagittale delle cellule di Purkinje si riflette la topografia settore terminale delle fibre afferenti. Cocaina e anfetamine regolamentato trascrizione (CART) peptide è espresso in sottoinsiemi di fibre rampicanti (Fig. 3a) che il progetto di strisce di dendriti delle cellule di Purkinje nello strato molecolare della corteccia cerebellare ⁷ (Fig. 3b). Con le opportune modifiche, come amplificazione ^7, il protocollo wholemount permette la visualizzazione dei modelli olivocerebellar senza need per un laborioso che richiede tempo, ricostruzioni provenienti da sezioni di tessuto colorazione (Fig. 3b).

Figura 1. A. ZebrinII / aldolaseC espressione rivela bande sagittali in sezioni trasversali del cervelletto. Scala bar = 500 micron. B. ZebrinII / aldolaseC è espresso esclusivamente in somata cellule di Purkinje e dendriti. Scale bar = 150μm (gl = strato granulare; pcl = strato di cellule di Purkinje; ml = strato molecolare).

Figura 2. Un cervelletto wholemount colorate per ZebrinII / aldolaseC mostrando strisce di cellule di Purkinje in immagini la parte anteriore (AZ), centrale (CZ) e posteriori (PZ) zone del cervelletto. Qui mostriamo anche un esempio di conseguenza negativa di intaccare la cervelletto. La colorazione risultante artefatta è indicatacon asterischi rossi. Barra della scala = 1 mm (LS = simplex lobulus; PML = paramediana lobulo; COP = copula pyramidis).

Figura 3. CART A. è espresso in arrampicata terminali di fibre nello strato molecolare. Scala bar = 100 micron. (Ml = strato molecolare; pcl = strato di cellule di Purkinje, gl = strato granulare) B. Wholemount immunoistochimica di espressione CART in NZ. Barra della scala = 2 mm (COP = copula pyramidis; PML = paramediana lobulo; PFL = paraflocculus; FL = flocculo).

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Discussione

Abbiamo descritto i dettagli tecnici necessari per la colorazione wholemount successo con un approccio versatile immunoistochimica per l'espressione delle proteine ​​rivelatrici nel cervello in via di sviluppo e adulti. Usando questo approccio, complessi schemi di espressione molecolari possono essere analizzati e topografia cervello apprezzato senza la necessità di procedure tessuti laboriose e richiedono tempo sezionamento.

Questo protocollo è stato usato per rivelare l'espre...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiale	Funzione nel protocollo
Perfusione pompa (Fisher Scientific/13-876-2)	Consente di perfusione costante e lento.
Sharp punta-Forbici (FST/14081-08)	Uso generale della perfusione e dissezione.
Blunt-tip Pinza (FST/91100-12)	Per stabilizzare il cuore per l'inserimento dell'ago perfusione.
Pinza (FST da Dumont AA/11210-10)	Per l'uso durante la dissezione del cervello dal cranio e per separare il cervelletto dal resto del cervello. Questi sono essenziali perché hanno una punta leggermente arrotondata, che aiuta a minimizzare i danni al cervelletto durante la dissezione.
Nutator (Fisher Scientific)	Utilizzato per mantenere i tessuti in movimento durante i periodi di incubazione.
1,5 ml di tubo (Sarstedt / Tappo a vite Micro Tube)	Tutte le fasi del suotochemistry protocollo si svolgono in questi microprovette. Il fondo arrotondato assicura che il cervelletto rimane in movimento.
Mestolo forato (FST/10370-17)	Usato per mantenere wholemounts nelle microprovette mentre delicatamente decantazione la soluzione esausta.
Leica MZ16 FA microscopio	Utilizzato per esaminare la colorazione wholemount.
Leica DFC3000 fotocamera FX	Permette di catturare immagini wholemount.

Calendario Esempio di un esperimento tipico wholemount
Giorno 1	Dent fix, temperatura ambiente, 8 ore				Dent candeggina, 4 ° C, overnight
Giorno 2	100% MeOH, temperatura ambiente, 2x, ogni 30 min			MeOH 100%, gelo / disgelo, 4x, 30 min/15 min			n = "2"> 100% MeOH, -80 ° C, overnight
Giorno 3	50% MeOH/50% PBS, temperatura ambiente, 60-90 min	15% MeOH / 85% PBS, temperatura ambiente, 60-90 min		100% PBS, temperatura ambiente, 60-90 min		10μg/mL proteinasi K in PBS, temperatura ambiente, 2-3 min	100% PBS, temperatura ambiente, 3x, 10 min ciascuno	PMT, 4 ° C, overnight
Giorno 4-5	PMT + 1 ° anticorpo + 5% DMSO, 4 ° C, 48 ore
Giorno 6	PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 ore ciascuna			PMT + 2 ° anticorpo + 5% DMSO, 4 ° C, 24 ore (o iniziare fasi di amplificazione con ABC complesso)
7 ° giorno	PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 ore ciascuna		PBT, temperatura ambiente, 2 ore			Incubare in DAB fresco in PBS fino colorazione ottimale è visualizzato

Ricette (* = preparare fresca ogni volta)
PBS (tampone fosfato salino)	0.1M soluzione salina tampone fosfato in acqua deionizzata. pH 7.2 (Sigma compresse; P4417)
PFA (paraformaldeide)	Prodotto congelato e memorizzati come una soluzione al 20% e poi diluita al 4% in PBS per la soluzione di lavoro (Fisher Scientific, T353)
Dent Fissante 3 *	4 parti di metanolo 1 parte dimetilsolfossido (DMSO, Fisher Scientific, D159-4)
Dent Bleach 3 *	4 parti di metanolo 1 parte dimetilsolfossido (DMSO, Fisher Scientific, D159-4) 1 parte di perossido di idrogeno 30%
Digestione enzimatica	10 ug / ml di proteinasi K (Roche Diagnostics; 03.115.828,001 mila) in PBS.
PBST	PBS contenente: 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337, Triton può anche essere usato al posto di Tween-20 in tutti i casi).
PMT 25 *	PBS contenente: 2% senza grassi del latte scremato in polvere (Carnation preferito) 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
PBT 25 *	PBS contenente: 0,2% bovino (Sigma; B9001S) albumina sierica 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
DAB *	Sciogliere una compressa da 10 mg di 3,3-diaminobenzidina (Sigma-Aldrich, D5905) in 40 ml di PBS. Aggiungere 10 pl di perossido di idrogeno al 30% per iniziare la reazione).
ABC soluzione complessa	Vectastain kit (Vector Laboratories, Inc; PK-4000)