Analisi di Single-cell trascrizione del gene per l&#39;RNA fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH)

Riepilogo

Fluorescente In situ (FISH) per identificare trascritti di mRNA in cellule singole consente analisi dell'attività poligenici come la trascrizione simultanea di più di un membro della Var Multigene famiglia in Plasmodium falciparum Eritrociti infetti ¹. La tecnica è adattabile e può essere utilizzato su diversi tipi di geni, cellule e organismi.

Abstract

Adesione di Plasmodium falciparum eritrociti infetti (IE) per recettori umani endoteliali durante la malaria è mediato dall'espressione di PfEMP1 varianti proteiche codificate dai geni var.

Il aploide P. falciparum genoma ospita circa 60 differenti geni var di cui uno solo è creduto per essere trascritto per cella alla volta durante la fase di sangue dell'infezione. Come tale regolamentazione si escludono a vicenda della trascrizione genica var si ottiene non è chiaro, così come l'identificazione di singoli geni var o sotto-gruppi di geni associati con var diversi recettori e la conseguenza del legame differenziale sui risultati clinici di P. falciparum infezioni. Di recente, il paradigma trascrizione si escludono a vicenda è stata messa in dubbio da saggi di trascrizione sulla base di singoli P. falciparum identificazione trascrizione in inf singoloected cellule eritrocitari utilizzando RNA ibridazione fluorescente in situ (FISH) Analisi della trascrizione genica var dal parassita in singoli nuclei di P. falciparum IE ^1.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per effettuare la RNA-FISH metodologia di analisi della trascrizione genica var in single-nuclei di P. falciparum infettato eritrociti umani. Il metodo si basa sull'uso di digossigenina e biotina marcato con sonde di RNA antisenso utilizzando il sistema TSA Plus. Fluorescence Palette ² (Perkin Elmer), analisi al microscopio e appena selezionato P. falciparum IE. Il metodo in situ può essere utilizzato per monitorare la trascrizione e la regolazione di una varietà di geni espressi durante le diverse fasi del P. ciclo di vita falciparum ed è adattabile ad altre specie parassita della malaria e di altri organismi e tipi di cellule.

Protocollo

1. Generazione di appena selezionati eritrociti infetti

Per questo test, i risultati migliori si ottengono utilizzando colture appena selezionati per espressione di superficie di PfEMP1 proteine. In questo esperimento particolare, il P. 3D7 lineage falciparum è stato selezionato utilizzando anticorpi specifici come descritto in precedenza ^1.

Giorno 1

1. Harvest 200 pl di globuli confezionati da un P. falciparum coltura contenente 2-5% IE fase tardiva mediante centrifugazione a 800 xg per 8 minuti a temperatura ambiente.
2. Risospendere il pellet sangue in 2 ml di 37 ° C caldo soluzione 0,75% di gelatina in una provetta sterile 14 ml, e lasciare per 15-20 minuti a 37 ° C per consentire l'IE non infette e anello fase sedimenti.
3. Raccogliere il ritardo-fase IE, cioè la fase superiore, in una nuova provetta 14 ml e lavare due volte con 10 ml di 37 ° C caldi RBC-lavaggio media.
4. Diluire 50 ml di anticorpi specifici anti-PfEMP1 anticorpi in 2 ml di 37 ° C caldo RBC-lavaggio mezzi e filtro sterili.
5. Mescolare il lavato all'ultimo stadio IE con gli antisieri sterilizzato diluito in un tubo 14 ml sterile e incubare per 30 min a 37 ° C con agitazione.
6. Centrifugare a 800 xg per 8 minuti a temperatura ambiente, e lavate due volte con 10 ml di 37 ° C caldi RBC-lavaggio media.
7. Lavare 50 pl di proteina Dynabead Una sospensione due volte con RBC-lavaggio supporti tramite un DynaMaq-15 magnete.
8. Risospendere le Dynabeads in 300 ml RBC-lavaggio dei media e aggiungerli alla lavato fase avanzata di IE. Incubare per 30 min a 37 ° C con agitazione.
9. Trasferire il tubo al DynaMaq-15 magnete. Lasciare agire per 1-2 minuti e rimuovere tutto il liquido.
10. Risospendere le Dynabeads in 4-5 ml di RBC-lavaggio dei media. Trasferire il tubo sul magnete e lasciare per 1-2 minuti prima di rimuovere tutto il liquido. Ripetere la fase di lavaggio una volta.
11. Trasferire le perle lavate a un cm 25 ² f cultura sterileLASK contenente 200 ul cellule rosse del sangue appena confezionati. Aggiungere 5-6 ml di Albumax supporto nella cultura. Memorizzare una notte a 5% di CO ₂ a 37 ° C.

Giorno 2

12. Rimuovere i Dynabeads dalla cultura in cui il IE selezionato è reinvaded le cellule rosse del sangue fresco, trasferendo tutta la cultura in una provetta 14 ml sterile. Inserire il tubo sul DynaMaq-15 magnete e lasciar riposare per 1-2 minuti. Poi, versare tutto il liquido nuovamente ad un pallone di coltura.
13. Cultura per il minor numero possibile di cicli fino ad un parassitemia del 5-10% e parassiti sono al ringstage.
14. IE devono essere analizzate mediante FACS per assicurarsi che il fenotipo corretta superficie, cioè l'espressione della proteina di entrambi and/orPF11_0008 PFD1235w è stato ottenuto ^1.

2. Preparazione di sonde

Le sonde di RNA antisenso sono stati generati dalle regioni più variabili della PFD1235w e la var PF11_0008 </ Em> geni di P. falciparum 3D7 DNA genomico. DNA è stato amplificato mediante PCR e clonato nel vettore pSPT18 o 19 per la trascrizione, rispettivamente, secondo la descrizione del produttore (Roche). Le sonde (580 paia di basi (bp) e 590 bp di lunghezza) sono state marcate con digossigenina (DIG) o biotina mediante un kit DIG RNA etichettatura o biotina RNA Mix etichettatura, rispettivamente. Abbiamo confermato la specificità delle sonde sia mediante analisi Northern blot e da etichetta singola analisi FISH ^1.

3. Striscio sottile e la fissazione di parassiti Prima di ibridazione in situ

Giorno 1

Tutte le fasi vengono eseguite in un ambiente privo di RNasi e tutti i reagenti sono RNase-free o pre-trattato con dietil pirocarbonato (DEPC) o RNasi Zap (Invitrogen). Le diapositive e le marze di copertura devono essere puliti con alcool per rimuovere grasso residuo di produzione. È importante eseguire il protocollo senza pausa tra fasial fine di minimizzare il rischio di contaminazione nucleasi.

1. Fare un film sottile di sangue con il metodo standard diffusione ^3. Utilizzando la lente obiettivo 100x olio del microscopio, contare il IE e calcolare la percentuale di IE nella cultura. Verificare che le fasi parassiti sono in sincronia approssimativi, sul ring e prime fasi del ciclo di trofozoite IE. Questi sono i pre-replicazione, uni-nucleate fasi, esprimendo mRNA gene var e adatto per le prove singole di trascrizione FISH delle cellule di questo tipo.
2. Trasferire 50 microlitri della cultura parassita, ad una parassitemia del 5-10%, 1,5 ml di una RNase-free provetta Eppendorf. Centrifugare per 1 min a 2000 rpm a temperatura ambiente.
3. Rimuovere il supporto e aggiungere 50 microlitri di PBS pH 7.2 in DEPC-acqua trattata. Agitare delicatamente il tubo. Ripetere il passaggio centrifuga sedimentazione due volte per lavare le cellule prive di mezzi di comunicazione e detriti cellulari.
4. Fai quattro buona qualità strisci sottili. Per ogni striscio, fare uno striscio sul'altro di 11 mm di diametro e di una slitta 4 bene, vale a dire quattro lastre di vetro in totale, in una RNasi-free cofano (un passaggio fondamentale). Onda scivola brevemente in aria per asciugare. Effettuare tre diapositive supplementare per diapositiva controlli negativi-one per la colorazione singola sonda per qualsiasi altro gene irrilevante utilizzando una sonda specifica, un'altra diapositiva per il trattamento RNasi e una terza slitta contenente IE non esprime il gene di interesse. Lasciare i vetrini si asciughino in panchina per 10-20 min.
5. Fissare i film sottili aggiungendo 60 pl di soluzione di fissazione contenente paraformaldeide al 4% e il 5% di acido acetico glaciale nei pozzetti. Lasciare agire per 10 minuti in panchina a temperatura ambiente.
6. Lavare i vetrini in 2x SSPE tampone per 5 minuti agitando con prudenza a temperatura ambiente. Brevemente rimuovere il liquido in eccesso premendo i pozzetti contenenti le cellule delicatamente con un fazzoletto di carta.
7. Coprire i vetrini con il 0,01% di pepsina in HCl 0,01 M per 2 minuti a 37 ° C (un passo estremamente critico). Lavare i vetrini in 2x SSPE per 5 min a temperatura ambiente.
8. Diluire la soluzione RNasi ad una concentrazione finale di 10 pg / ml. Coprire gli strisci di controllo negativo con il 60 microlitri della soluzione del RNasi. Incubare per 30 min a 37 ° C e poi lavare i vetrini in 2x SSPE per 5 min a temperatura ambiente.
9. Procedere immediatamente alla fase di ibridazione.

4. Ibridazione di sonde di RNA a diapositive fisse

Giorno 1

1. Preparare la camera di ibridazione, come ad esempio un Thermostar HC4 100 o una scatola vuota puntale messo in un forno pulito, bagnandoli con RNasi Zap e asciugandosi pulirlo con un fazzoletto di carta. Riempire i canali della camera di ibridazione o il fondo della scatola con acqua trattata con DEPC per assicurarsi che i vetrini non si asciughino durante l'ibridazione. Chiudere la camera e preriscaldare a 48 ° C.
2. Diluire le sonde nella soluzione di ibridazione ad una concentrazione finale di 12 ng / pl. Denaturare la soluzione della sonda a 65 ° C per 5 minuti in un blocco di riscaldamento. Immediatamente raffreddare su ghiaccio.
3. Brevemente l'aria asciugare i vetrini dopo il lavaggio 2x SSPE. Rimuovere con cura il liquido in eccesso intorno ai pozzetti con un fazzoletto di carta.
4. Aprire la camera di ibridazione e posizionare i vetrini nella camera. Applicare una o entrambe le sonde in un volume totale di 60 microlitri per pozzetto. Coprire attentamente la goccia liquido con un RNasi-free coprioggetto utilizzando pinze sterili.
5. Chiudere la camera e ibridare i vetrini a 48 ° C per almeno 16 ore durante la notte.

5. Coniugazione anticorpo e Amplificazione Fluorescence

Giorno 2

Le seguenti operazioni sono basate sulla TSA Plus System Palette fluorescenza da Perkin Elmer. Tutti i passaggi sono eseguiti a temperatura ambiente.

1. Lavare i vetrini 3 volte in TNT tampone per 5 minuti con agitazione.
2. Bloccare i pozzetti in 150 ml di tampone per 30 min TNB.
3. Diluire il coniugato HRP-α-DIG anticorpo in tampone TNB in ​​un rapporto di 1:100 e il coniugato HRP-α-biotina in tampone TNB, con un rapporto di 1:500. Rimuovere il tampone in eccesso TNB dai vetrini con un fazzoletto di carta. Quando si rilevano due trascritti simultaneamente, entrambi gli anticorpi può andare in una sola volta. Applicare una quantità totale di 100 microlitri della soluzione di anticorpo-TNB per bene e coprire accuratamente con un vetrino coprioggetti. Incubare i vetrini per 2 ore.
4. Rimuovere i vetrini con attenzione. Lavare i vetrini in TNT tampone 3 volte per 5 min.
5. Diluire il FITC-fluoroforo nel reagente di amplificazione tiramide in un rapporto di 1:500 e applicare 100 pl della soluzione ad ogni pozzetto. Coprire i pozzetti con i vetrini coprioggetto e incubare per 12 min.
6. Togliere il coperchio scivola con cura e lavare i vetrini 3 volte per 5 min in tampone TNT agitando con prudenza.
7. Diluire il Cyan3-fluoroforo nel reagente di amplificazione tiramide ad un rapporto di 1:500. Aggiungere 100 microlitri perbene di questa soluzione. Coprire i pozzetti con i vetrini coprioggetto e incubare per 12 min.
8. Togliere il coperchio scivola attentamente e poi sciacquare i vetrini rapidamente per immersione in tampone TNT.
9. Lavare i vetrini 3 volte con tampone di TNT per 5 min.
10. Immergere rapidamente i vetrini in acqua trattata con DEPC.
11. Lasciare i vetrini asciugare all'aria. Montare i vetrini con anti-fade reagente contenente DAPI. Sigillare gli angoli dei vetrini coprioggetto con smalto.
12. I vetrini sono ora pronti per la microscopia. Conservare i vetrini coperti con un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C se l'esperimento deve essere completata il giorno successivo. Una sigillatura completa dei lati dei vetrini possono essere effettuati 24 ore dopo l'applicazione del reagente anti-fade. Ciò permetterà le diapositive da acquisire fino ad una settimana dopo il protocollo è stato completato.

6. Visualizzazione dei prodotti ibridati

1. Accendere il microscopio. Un microscopio standard di immunofluorescenza è sufficient per questo tipo di esperimento, ma se si ha accesso ad un microscopio confocale è possibile utilizzare anche questo per le immagini in 3D o per ottenere i video delle vostre cellule colorate. Lasciare microscopio per riscaldare per 15-30 min. Accendere il computer e il software.
2. Verificare la qualità della colorazione sul microscopio immunofluorescenza. Scegli un posto che contiene pochi parassiti.
3. Regolare il guadagno di ogni laser manualmente. Regolare il pixel sosta a 4-6 m ^{1 s-1} e le misure di 512 x 512 pixel.
4. Scattare una foto di prova con cornice Lambda. Regolare il guadagno laser.
5. Prendete un minimo di 20 belle foto di singole cellule fluorescenti. Almeno 2-5 immagini di un campo contenente 5-20 parassiti sono necessari al fine di ottenere un quadro delle percentuale di parassiti positivi.

Risultati

La figura 1 illustra un diagramma di flusso delle fasi principali e la durata dell'impulso del metodo FISH RNA.

Una serie di immagini rappresentative di bene e male esperimenti mRNA conservati colorate FISH utilizzando una singola P. falciparum IE sono mostrati in Figura 2. Questo protozoo intracellulare ha una piccola (1-1,5 micron di diametro), nucleo che è di colore blu con DAPI. Ventiquattro ore dopo l'invasione degli eritrociti in ...

Discussione

Analisi FISH RNA, a differenza di metodi come Northern blotting e RT-PCR, permette la discriminazione di mRNA trascritti specifici a livello di singola cellula. Ciò rende possibile discriminare tra cellule trascrizionalmente attiva e inattiva, in questo esempio, P. falciparum protozoi parassiti all'interno globuli rossi umani. Tali cellule intere osservazioni sono spesso necessari e possono svelare modelli trascrizionali importanti e nuovi ^1.

Sebbene altri metodi FIS...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido acetico	Sigma / Aldrich	338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 soluzione Glutammina	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml di soluzione di glutammina
Albumax media: Gentamicina solfato Albumax soluzione	Lonza	BE02-012E	2,5 ml di gentamicina solfato 50 ml di soluzione Albumax
Albumax-soluzione: ipoxantina	Sigma-Aldrich	H9377	0,8 g ipoxantina
Albumax-soluzione: Albumax II	Ionvitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax-soluzione: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 litro RPMI 1640 Sciogliere con magnete al max. 50 ° C. Filtro sterilizzare e conservare a -20 ° C in aliquote.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Resina deionizzare formammide.
Anti-biotina capra pAb Coniugato perossidasi	Calbiochem	203206
Anti-Dig anticorpo	Novus Biologicals	NB100-41330
Anti-fade reagente con DAPI	Invitrogen	P36931	I mezzi di montaggio deve curare per 24 h prima di sigillare il vetrino completamente.
Biotina RNA Labeling Mix	Roche	11685597910
Fotocamera digitale	Digitale Nikon vista DC-F11
Coprioggetto	Menzel-Glaser	631-1570
cultura pallone 25 cm 2 di superficie Nunclon	Nunc	156340
DEPC	Fluka / Sigma	32490-100ml	1 ml DEPC in 1000 ml di acqua deinonized. Aggiungere una barra di agitazione e mescolare per 12 ore. Autoclave per 30 min.
Macchina fotografica digitale	Digitale Nikon vista DC-F11
Dynabeads proteina A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Magnete	Invitrogen	123-01D
Formammide bioultra 99%	Fluka/ Sigma	47671-1l-F	Formammide deionizzata: 5 g di resina scambiatrice di ioni per 100 ml di formammide. Mescolare 30 min. Filtrare su carta Whatman.
. Gelatina 0 soluzione al 75%: Gelatina	Sigma-Aldrich	G2500	3,75 g di gelatina in 500 ml di RPMI 1640. Riscaldare a 56 ° C per sciogliere. Filtro sterilizzare quando 56 ° C. Conservare a -20 ° C in aliquote.
. Gelatina 0 soluzione al 75%: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3,75 g di gelatina in 500 ml di RPMI 1640. Riscaldare a 56 ° C per sciogliere. Filtro sterilizzare quando 56 ° C. Conservare a -20 ° C in aliquote.
Glutammina soluzione: L-glutamina	Sigma-Aldrich	G3126	14,6 g L glutammina in 500 ml di NaCl allo 0,9%. Sciogliere, filtro sterilize e conservare a -20 ° C in aliquote.
Glutammina soluzione: HCl	Sigma	H1758	14,6 g L glutammina in 500 ml di NaCl allo 0,9%. Sciogliere, filtro sterilizzare e conservare a -20 ° C in aliquote.
Ibridazione soluzione: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x	Fluka / Sigma	47671-1l-F	Totale 20 ml, mantenere congelato a -20 ° C in aliquote 10 ml di formammide deionizzata
Ibridazione soluzione: concentrato 50x Denhardt	Sigma	D2532	5ml 20xSSC
Ibridazione soluzione: reagente lievito tRNARoche blocco	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt 250 microlitri 20 mg al lievito tRNA ml
soluzione: DNA di sperma di salmone	Fluka / Sigma	31149-106GF	0.4g Roche blocco reagente 1 ml di 10 mg per ml DNA di sperma di salmone (Critical: denaturano salmone spermDNA a 96 ° C per 5 minuti prima di aggiungere alla soluzione di ibridazione)
Hybridizer Thermostar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Può essere sostituito da forno di ibridazione e camere di ibridazione RNasi libero imbottiti con acqua DEPC.
Olio di immersione UV trasparente fluorescenza libero	Sigma	10976-1EA
Microscopio confocale o Immunofluorescenza	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish	Disponibile in farmacia
PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deionizzata H 2 O			ASOLO pH a 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldeide 4%	Fluka / chemika	76240	4 g PFA in 80 ml di PBS / DEPC. Riscaldare a 65 ° C fino alla PFA dissolve. Aggiungere 20 ml di PBS, lasciare che la soluzione si raffreddi. Regolare il pH a 7,4. Filtro. Conservare in aliquote a -20 ° C.
Paraformaldeide al 4% / acido acetico al 5%			950 microlitri paraformaldhyde + 50 microlitri di acido acetico
Pepsina	Sigma / Aldrich	P7000
Perossidasi-coniugato anti-biotina	Calbiochem	203206
RBC-wash media: RPMI 1640 soluzione Glutammina	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml soluzione glutammina
RBC-wash media: Gentamicina solfato	Lonza	BE02-012E	2,5 ml di gentamicina solfato
RNasi	Sigma / Aldrich		Fai un 10 mg / ml di soluzione concentrata.
RNasi libero 1,5 ml tubo	Ambion	AM12450
RNasi Zap	Ambion	AM9780
Slides 4 pozzetti 11 millimetri	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma / AlAldrich	S9625	3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3 citrato x H 2 O (88 g / l) Regolare il pH a 7,0 con HCl 1M
SSC 20x: citrato di sodio diidrato	Sigma / Aldrich	W302600	3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3 citrato x H 2 O (88 g / l) Regolare il pH a 7,0 con HCl 1M
SSPE 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	175,3 g NaCl
SSPE 20x: NaH 2 PO 4	Sigma / Aldrich	S0751	27,6 g di NaH 2 PO 4.
SSPE 20x: 4 EDTA in polvere			9,4 g di polvere EDTA Aggiungere acqua DEPC, correggere il pH 7.4. Autospaccò per 20 min
TNB buffer: buffer di TNT			10 ml tampone TNT
TNB buffer: reagente di blocco			0,05 g di reagente di blocco Per sciogliere il reagente bloccante, riscaldare la soluzione a 60 ° C per un'ora sotto agitazione. Conservare a -20 ° C. (Derivato dalla Perkin Elmer TSA-protocollo.)
TNT tampone: Tris / HCl	Sigma	T1503	1M Tris / HCl, pH 8,0
TNT buffer: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
TNT buffer: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Portare il pH a 7,5 a temperatura ambiente. (Derivato dalla Perkin Elmer TSA-protocollo.)
TSA più Cyanine3 / fluoresceina sistema	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Leggi il protocollo dal TSA Plus System Palette fluorescenza con attenzione prima di iniziare l'esperimento.
Tubi 14 ml sterile	Almeco - CM Aps LAB	91016