Profiling Glycan dei polimeri cellula vegetale da parete usando i microarrays

Riepilogo

Una tecnica chiamata C Omprehensive M Icroarray P Profiling (CoMPP) per la caratterizzazione dei glicani della parete delle cellule vegetali è descritto. Questo metodo combina la specificità degli anticorpi monoclonali diretti ad epitopi definiti glicano-miniatura con una piattaforma microarray analisi di screening che consente di occorrenza glicano in un'ampia gamma di contesti biologici.

Abstract

Pareti delle cellule vegetali sono matrici complesse di glicani eterogenee che svolgono un ruolo importante nella fisiologia e sviluppo di impianti e di fornire le materie prime per le società umane (ad esempio, industria del legno, della carta, tessile e biocarburanti) ^1,2. Tuttavia, la comprensione la biosintesi e la funzione di tali componenti rimane difficile.

Glicani parete cellulare sono chimicamente e conformazione diversa a causa della complessità dei loro elementi costitutivi, i residui di glicosil. Questi legami modulo in più posizioni e differiscono in struttura ad anello, configurazione isomerica anomerico, e in aggiunta, sono sostituiti con un array di non-zucchero residui. Glicano composizione varia in cella e / o tipi di tessuto o anche sottodomini di una singola cella parete ^3. Inoltre, la composizione è anche modificato durante lo sviluppo ^1, o in risposta a stimoli ambientali ^4.

In excesso di 2.000 geni hanno pareti cellulari vegetali sono matrici complesse di glicani eterogenei stati previsti di essere coinvolti nella biosintesi della parete cellulare glicano e la modifica in Arabidopsis ^5. Tuttavia, relativamente pochi dei geni biosintetici sono stati caratterizzati funzionalmente ^4,5. Reverse approcci genetica sono difficili perché i geni sono spesso differenzialmente espressi, spesso a livelli bassi, tra i tipi di cellule ^6. Inoltre, gli studi mutanti sono spesso ostacolati da ridondanza genica o meccanismi di compensazione per garantire un'adeguata funzione della parete cellulare è mantenuta ^7. Così nuovi approcci sono necessari per caratterizzare rapidamente la vasta gamma di strutture glycan e per facilitare approcci di genomica funzionale per la biosintesi della parete cellulare comprensione e la modifica.

Gli anticorpi monoclonali (mAb) ^8,9 sono emersi come un importante strumento per definire l'assetto glicano e la distribuzione negli impianti. Questi riconoscono distepitopi inct presenti all'interno di classi principali di glicani delle cellule delle piante da parete, comprese le pectine, xyloglucans, xylans, mannani, glucani e arabinogalactans. Recentemente il loro uso è stato esteso a grandi esperimenti di screening per determinare la quantità relativa di glicani in una vasta gamma di tipi di tessuto vegetale e contemporaneamente ^9,10,11.

Qui vi presentiamo un microarray basato su metodo di screening glicano chiamato completa Microarray Profiling Polymer (CoMPP) (Figure 1 e 2) ^10,11 che consente più campioni (100 sec) per essere schermati con una piattaforma microarray miniaturizzato con il reagente ridotta e volumi di campione. I segnali piatte su microarray può essere formalmente quantificato per dare semi-quantitativi i dati relativi verificarsi glicano epitopo. Questo approccio è adatto per tenere traccia delle modifiche glycan in sistemi biologici complessi ¹² e fornendo una visione globale della composizione della parete cellulare in particolare quando prima conoscenza of questo non è disponibile.

Protocollo

1. Raccolta e preparazione dei tessuti

1. Raccogliere 100 mg di peso fresco tessuti vegetali (almeno 10 mg di peso secco) almeno in triplicato per ogni tessuto di interesse. I passaggi seguenti descrivono la preparazione di materiale della parete cellulare nei tessuti vegetali. Nel caso di tessuti di stoccaggio, un-wanted amido viene enzimaticamente rimosso prima di procedere con l'estrazione di polimeri della parete cellulare come descritto in precedenza ^13.
2. Omogeneizzare i campioni ad una polvere fine con azoto liquido utilizzando un Qiagen TissueLyser II, con 24 set di tubi adattatori e 3 millimetri perline carburo di tungsteno (30 Hz, 2 x 30 sec). In alternativa, se solo pochi campioni vengono elaborati, un mortaio e pestello viene utilizzato.
3. Trasferire gli omogenati in 10 ml provette coniche di plastica.
4. Preparare parete materiale cellulare lavando i omogenati in 10 ml di 80% v / v di etanolo a temperatura ambiente e vortexando energicamente per 2 minuti.
5. Centrifugare i campioni a 3.500 xg ed eliminare il surnatante. Ripetere l'etanolo 70% lava almeno tre volte o finché il supernatante è chiara, particolarmente per tessuti contenenti clorofilla.
6. Eseguire un lavaggio finale con il 100% di acetone e lasciare le palline contenenti residui di alcool insolubili (AIR) per asciugare durante la notte.
7. Sieve i campioni AIR con a mm 0,4 ² maglie per ottenere una polvere fine, omogenea e di togliere più grande, mal particelle di terra che a volte rimangono nel omogeneizzato.
8. Pesare 10 mg di campione di aria in microprovette, ognuna contenente 3 mm perle di vetro per facilitare la miscelazione dei campioni.

2. Estrazione di glicani parete cellulare

1. Pectine, e polimeri associati pectine sono estratti dai campioni aggiungendo 500 pl di 50 mM CDTA (pH 7,5) per ogni campione.
2. Brevemente vortex le provette per assicurare il solvente è in contatto con il campione e quindi miscelare con il TissueLyser per 3 ore a 8 Hz.
3. Centrifugare i campioni a 12.000 xg, accuratamente rTogliete il surnatante e conservare a 4 ° C.
4. Lavare pellet in 1 ml di acqua deionizzata per diluire e rimuovere qualsiasi residuo di solvente, vortex e centrifugare a 13.000 x g. Ripetere questo passo senza disturbare il pellet e rimuovere il liquido da tutte le provette prima di procedere alla fase successiva.
5. Reticolanti glicani sono sequenzialmente estratte dal rimanente parete cellulare pellet con 500 ml di NaOH 4M con 0,1% w / v NaBH4, utilizzando la stessa procedura descritta nei passaggi 2,1-2,4 per l'estrazione CDTA. NaBH ₄ viene aggiunto per ridurre l'aldeide (o cheto) gruppo alla fine ridurre i polisaccaridi ad un alcool impedendo così di base di polisaccaridi peeling.
6. Dopo centrifugazione, supernatanti vengono nuovamente rimosso, conservato a 4 ° C, e il pellet lavato due volte in acqua deionizzata prima di procedere alla prossima estrazione.
7. Come passaggio facoltativo, polimeri residui, quali cellulosa sono estratte con 500 ul cadoxen (31% v / v 1,2-diaminoethane con 0,78 M CdO), utilizzando la stessa procedura descritta nei passaggi 2,1-2,4. In alternativa, assoluta contenuto cellulosico in pellet rimanenti può essere determinato mediante saggi acetico / nitrico (vedi la discussione).

3. Stampa Microarrays

1. Surnatanti centrifuga contenente estratto polimeri della parete cellulare a 13.000 xg per rimuovere particelle.
2. Carico 50 pl di ciascun campione in un polipropilene 384 ben micropiastra utilizzando un pre-progettati layout personalizzato in cui sono disposti i campioni secondo il tipo di tessuto e del tipo di estrazione.
3. Diluire il campione della parete cellulare di polimero in una serie di diluizione × 0, 5 e 25 in serie con acqua deionizzata.
4. Parametri come altezza perno, la raccolta e il tempo di permanenza, e fasi di lavaggio sono impostati sul software controllo del micro-distributore.
5. L'umidità della camera di stampa è controllata al 60% per evitare l'evaporazione del campione.
6. Il lavoro di stampa viene avviato utilizzando LabNEXT Software e un programma che corrisponde al layout microarray.
7. Il robot utilizza sugli canali capillari per stampare soluzioni del campione nella piastra 20 x 20 centimetri membrana di nitrocellulosa che è attaccata ad una piastra piana nella macchina. Ogni punto della matrice contiene 15 nl di soluzione ed è stampato in triplice copia.
8. Microarrays identiche sono stampate una accanto all'altra sulla membrana e tagliate in singoli array dopo il processo di stampa.
9. In ogni esperimento le matrici possono essere modificati per ospitare campioni più o meno, diluizioni o replicati.

4. Probing di Microarrays glicano

1. Dopo la stampa, bloccare i singoli microarray in 5% w / v latte scremato in polvere sciolto in tampone fosfato (MPBS) a temperatura ambiente per 2 ore per ridurre il legame non specifico.
2. Microarrays sonda con anticorpi monoclonali specifici per parete cellulare glicano epitopi per 2 ore in MPBS. La maggioranza dei antib monoclonaleodies contro glicani della parete cellulare sono disponibili in commercio da tre società; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Servizi Carbosource ( www.carbosource.net ) e PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
3. Comprendono un controllo negativo, un microarray incubate con MPBS e non solo anticorpo primario.
4. Lavare le microarrays 3 volte in tampone fosfato salino (PBS) per 5 minuti per rimuovere il legame non specifico.
5. Misurare i microarrays con anticorpo secondario coniugato a perossidasi di rafano (HRP) in MPBS per 2 hr. La maggior parte di anticorpi monoclonali contro glicani della parete cellulare richiede anti-mouse o anti-topo anticorpi secondari.
6. Ripetere le fasi di lavaggio per 3 volte con PBS per 5 minuti per rimuovere il legame non specifico.
7. Sviluppare i microarray utilizzando cromogenico (3,3-diamminobenzidina) o chemiluminecent (luminol) substrati.

5. Quantificazione

1. Dopo lo sviluppo, la scansione dei microarray individuali usando ad alta risoluzione (1.200 dpi) scanner desktop e salvare le immagini come negativi, file a 16 bit TIFF (Figura 3).
2. Calcola l'intensità integrale di ogni macchia con Xplore Software Image Processing (LabNEXT) dotato di uno strumento di griglia automatico. L'intensità macchia integrale deriva dalla somma dei pixel nell'area circostante ogni punto della griglia.
3. I dati della griglia per ogni microarray viene esportato come un file txt e può essere importato manualmente in un foglio di calcolo Excel per l'analisi. Uno strumento online ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) è stato sviluppato per tradurre automaticamente ed elaborare i dati di singoli file txt.
4. L'intensità media integrale è posto in tutta la stampa si replica e le diluizioni per ottenere una 'macchia mediaintensità 'valore per ciascun campione (Figura 2). In alternativa, i segnali corrispondenti posto ad un solo valore di diluizione sull'array vengono utilizzati per quantificare la relativa abbondanza epitopo glicano per ogni campione.
5. Le intensità relative dei posti medi tra diversi campioni sono presentati come una mappa termica (Figura 4) utilizzando la formattazione condizionale in strumenti heatmapper excel o online ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). I dati per ciascun tipo di anticorpo è corretta a 100 e un valore del 5% è imposto per rimuovere segnale di fondo e falsi positivi.

Risultati

La relativa abbondanza di glicani in sei tipi di tessuto (filamenti antera, polline, ovaie, petali, sepali e lo stigma) di Nicotiana alata fiori è stata determinata utilizzando CoMPP. La Figura 3A mostra un microarray rappresentante che è stato sondato con mAb specifico per JIM5 parzialmente (basso) methylesterified homogalacturonan (HG), un epitopo che si verifica su polisaccaridi pectiche ^14. Il JIM5 epitopo viene rilevato in estratti CDTA di tutti i tessuti floreali è tuttavia più alta e più ...

Discussione

CoMPP è un metodo rapido e sensibile per la profilatura della composizione glicano di centinaia di piante derivate da campioni in una questione di giorni. Questo metodo integra le piattaforme di batteri o mammiferi già disponibili matrice glycan for high-throughput screening di interazioni di carboidrati composti da glicano proteine ​​leganti, come lectine, recettori e anticorpi ^16. Con una grande diversità di sonde disponibili per rilevare glicani parete cellulare, è possibile ottenere informazioni d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
3 millimetri perline in metallo duro	Qiagen	69997
Microprovette Collection (1,2 mm)	Qiagen	19560	Provette da 1,5 ml microcentrifuga può anche essere usato
Qiagen TissueLyser II	Qiagen	85300
3 biglie di vetro millimetri	Sigma Aldrich	Z143928
CDTA	Sigma Aldrich	34588
Ossido di cadmio	Sigma Aldrich	202894
1,2-diamminoetano	Sigma Aldrich	03550
Nitrocellulosa membrana (dimensione dei pori 0,22 um)	GE-acqua & Process Technologies	EP2HY00010	diverse membrane pori di dimensioni sono adatte per i tipi di pin diversi
Xact II micro-distributore robot	Labnext	001A	la Xact II robot è stato dotato di un costume 20 x 20 cm Piatto ceramica a cui è attaccata la membrana di nitrocellulosa
Xtend perni microarray RM	Labnext	0037-350	perni devono essere idonei per individuare sulle membrane
384 micropiastra pozzetti (polipropilene)	Greiner	781207
Anticorpi monoclonali anti-glicani	Sonde vegetali / CarboSource / Biosupplies		Siti; PlantProbes ( www.plantprobes.net ), Carbosource (ww.carbosource.net "target =" _blank "> www.carbosource.net) e Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ).
Anti-IgG Rat (molecola intera) - anticorpi perossidasi prodotto in capra.	Sigma	A9037	il tipo di anticorpi secondari dipende l'anticorpo primario utilizzato (ad esempio sollevata in ratto, topo, ecc capra).
SIGMA VELOCE 3,3 '-diaminobenzidina compresse	Sigma	D4293	il tipo di reagente sviluppo dipende anticorpi secondari utilizzati e il metodo di rilevamento (colorimetrica, o chemiluminecent).
SuperSignal Ovest Substrato Pico Chemiluminescente	Thermoscientific	34080	vedi sopra
Xplore Software Image Processing	LabNext	008	molti tipi di software con gli strumenti automatici di gridding sono disponibiliper misurare il valore di pixel di spot microarray.
Polisaccaridi vegetali	Sigma / Megazyme