La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

Riepilogo

Gli effetti di attivazione di proteina chinasi C (PKC) isoenzimi sulle funzioni mitocondriali associate respirazione e fosforilazione ossidativa e sulla vitalità cellulare sono descritti. L'approccio si adatta tecnica adenovirale per sovraesprimere selettivamente isoenzimi PKC in coltura primaria e una varietà di saggi per determinare le funzioni mitocondriali e lo stato energetico della cellula.

Abstract

La proteina chinasi C (PKC) famiglia di isoenzimi è coinvolta in numerosi processi fisiologici e patologici. I nostri dati recenti dimostrano che la PKC regola la funzione mitocondriale e lo stato di energia cellulare. Numerosi rapporti hanno dimostrato che l'attivazione della PKC-a e PKC-ε migliora la funzione mitocondriale nel cuore ischemico e cardioprotettivo media. Al contrario, abbiamo dimostrato che PKC-α e ε-PKC sono coinvolte in nephrotoxicant indotta disfunzione mitocondriale e morte cellulare in cellule renali. Pertanto, l'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un modello in vitro di cellule renali mantenere attive le funzioni mitocondriali in cui isoenzimi PKC potrebbe essere selettivamente attivati ​​o inibiti per determinare il loro ruolo nella regolazione della fosforilazione ossidativa e la sopravvivenza cellulare. Colture primarie di cellule renali del tubulo prossimale (RPTC) sono state coltivate in condizioni migliori con conseguente respirazione mitocondriale e l'attività di mitomitocondriale enzimi simili a quelli in RPTC in vivo. Poiché le tecniche di transfezione tradizionali (Lipofectamine, elettroporazione) sono inefficienti in colture primarie e avere effetti negativi sulla funzione mitocondriale, PKC-ε cDNA mutanti sono state consegnate ai RPTC attraverso vettori adenovirali. Questo approccio risulta in trasfezione di oltre il 90% RPTC colta.

Qui, vi presentiamo i metodi per valutare il ruolo della PKC-ε in: 1. regolazione della morfologia mitocondriale e funzioni associate alla sintesi di ATP, e 2. sopravvivenza della RPTC in coltura primaria. PKC-ε viene attivato overesprimono la costitutivamente attivo PKC-ε mutante. PKC-ε è inibita dalla sovraespressione della mutante inattivo di PKC-ε. Funzione mitocondriale viene valutata esaminando la respirazione, l'integrità della catena respiratoria, attività dei complessi respiratori e F ₀ F _1-ATPasi, tasso di produzione di ATP, e il contenuto di ATP. La respirazione è unssessed in digitonina permeabilizzate RPTC come stato 3 (respirazione massima in presenza di substrati in eccesso e ADP) e respirazioni disaccoppiati. Integrità della catena respiratoria è valutata misurando attività di tutti e quattro complessi della catena respiratoria nei mitocondri isolati. Capacità di fosforilazione ossidativa viene valutata misurando il potenziale di membrana mitocondriale, tasso di produzione di ATP, e l'attività di F ₀ F _1-ATPasi. Stato energetico del RPTC viene valutata determinando il contenuto intracellulare di ATP. Morfologia mitocondriale in cellule vive è visualizzato utilizzando MitoTracker Red 580, un colorante fluorescente che si accumula in particolare nei mitocondri, e monostrati vivi vengono esaminati al microscopio a fluorescenza. Vitalità RPTC è valutato in base annessina V / colorazione ioduro di propidio seguita mediante citometria di flusso per determinare apoptosi e oncosis.

Questi metodi consentono di attivazione selettiva / inibizione della PKC individuale isoenzimiper valutare il loro ruolo in funzioni cellulari in una varietà di condizioni fisiologiche e patologiche che possono essere riprodotti in vitro.

Protocollo

1. Isolamento dei tubuli prossimali renali per la cultura primaria

1. Anestetizzare il coniglio, accise entrambi i reni e metterli in una piastra di Petri riempita con tampone di preparazione sterile (DMEM/F12 media) in una cappa a flusso laminare.
2. Perfondere ogni rene con 50 ml di tampone prep seguiti da 50 ml di soluzione sterile salina tamponata con fosfato, pH 7,4 (PBS), e la soluzione di PBS-ossido di ferro (45 ml + 5 ml). De-capsulati reni e trasferirli al buffer di preparazione contenente deferoxamina.
3. Harvest la corteccia di ciascun rene.
4. Omogeneizzare il tessuto utilizzando un ml 15 Dounce omogeneizzatore. Versare l'omogeneizzato in 2 setacci a rete sterili (85 micron nella parte inferiore e 235 micron in alto) poste sopra un bicchiere 1 L sterile. Sciacquare i setacci con deferoxamina contenente buffer.
5. Raccogliere qualsiasi tessuto lasciato sul setaccio di 85 micron in una provetta sterile da centrifuga conica riempita con 35-40 ml di tampone contenente deferoxamina. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare.
6. Inserire un forte magnet all'esterno del tubo per rimuovere il ferro riempito glomeruli e lasciare che la sospensione depositarsi. Aspirare ferro dal magnete con una pipetta Pasteur. Ripetere questo processo.
7. Preparare 1 ml di mezzo di digestione contenente collagenasi 2,400-2,500 unità di I e 0,6 mg di inibitore di tripsina di soia dissolto nel tampone contenente deferoxamina. Filtrare-sterilizzare il mezzo digestione.
8. Regolare il volume della sospensione cellulare a 40 ml, e aggiungere 1 ml di mezzo di digestione. Incubare a temperatura ambiente per 17 min delicatamente miscelazione della sospensione, centrifugare a 50 xg per 2 minuti a 4 ° C, aspirare il terreno, e aggiungere tampone fresco deferoxamina.
9. Ripetere la procedura per la rimozione di ferro con il magnete più volte, centrifugare la sospensione di nuovo, aspirare a medio, e aggiungere 46 ml di terreno che non contiene glucosio.
10. Mescolare delicatamente e misurare 500 microlitri della sospensione in due tubi pre-pesati Eppendorf. Spin celle in basso a 10.000 xg per 1 minuto, aspirare i media, e pesare il pellet. Calcolare il rendimento complessivo della massa umida e proteine.
11. Piastra le cellule in piatti millimetri sterili 35 di coltura in densità di 1 mg di proteina / piatto con glucosio-free DMEM/F12 media. Cellule di coltura in 2 ml di glucosio terreno privo DMEM/F12 sempre su un agitatore orbitale in incubatore a 37 ° C (95% aria / 5% CO _2). ^1,2

2. Renale prossimale Tubulo Colture Cellulari

1. Il mezzo di coltura è una miscela 50:50 di DMEM e Ham F-12 mix nutrienti senza rosso fenolo, piruvato, e glucosio, supplementato con 15 mM NaHCO _3, 15 mM di HEPES, e 6 lattato mM (pH 7,4, 295 mosmol / KGH ₂ O). I supporti sono integrati con L-ascorbico-2-fosfato (50 mM), insulina bovina (10 nM), transferrina umana (5 mg / ml), idrocortisone (50 nM), e selenio (5 ng / ml) immediatamente prima di supporti giornaliero cambiamento.
2. Aspirare vecchi media da piatti a base di una tecnica sterile. Aggiungere 2 ml di caldo, mezzi freschi per ogni piatto utilizzando una tecnica sterile. Renali cellule del tubulo prossimale (RPTC) raggiungere la confluenza in circa 5-6 giorni dopo la placcatura. ^1,2

3. L'infezione adenovirale di RPTC

1. Infezione adenovirale viene effettuata in colture confluenti, quiescenti di RPTC dopo la variazione giornaliera media. Dominante negativo PKC-ε mutante (dnPKC-ε) è stato costruito dalla sostituzione di: 1) con lisina arginina alla posizione 436 del sito di legame e 2) alanina con glutammato in posizione 159 del dominio pseudosubstrate. Queste mutazioni distrutto l'attività di chinasi del costrutto senza modificare la conformazione attiva della PKC-ε. ³ PKC-ε è stato fatto costitutivamente attivo dalla cancellazione dei residui 154-163 del proprio dominio pseudosubstrate inibitorio ^4.
2. Aggiungere soluzione di riserva della adenovirus portare caPKC-ε cDNA o dnPKC-ε cDNA per ogni piatto per ottenere molteplicità desiderato di infezione (MOI) con conseguente aumento significativo della PKC-& epsilon; livelli di proteine. Incubare RPTC con adenovirus per 24 ore. Modificare i media e le cellule di coltura per un altro 24 h. Livelli significativamente aumentati di fosforilate e totali PKC-ε proteine ​​può essere ottenuta utilizzando 25-50 MOI di vettore adenovirale codificante caPKC-ε. Maggiori risultati in MOI aumenti ancora maggiori dei livelli di attività PKC-ε, ma non è raccomandato in RPTC a causa della rapida morte cellulare e la perdita. Livelli significativamente aumentati di inattive PKC-ε proteina può essere ottenuta utilizzando 50-100 MOI in RPTC senza produrre effetti negativi. ⁵
3. A 48 ore dopo l'infezione, i media aspirato, lavare i monostrati con PBS, e raccogliere le cellule per l'analisi immunoblot per determinare i livelli di proteina PKC-ε. ⁵

4. Misura della respirazione RPTC

1. Preparare un tampone di saggio per misurare lo stato 3 della respirazione (120 mM KCl, 5 mM KH ₂ PO _4, HEPES 10 mM, 1 mM MgSO _4, e 2 mM EGTA, pH 7,4). Per la misurazione del complesso I-accoppiato stato 3 della respirazione, integrare il tampone di saggio con 5 mM glutammato, 5 mM malato e 0,1 mg / ml digitonina. Per complesso II-coupled stato 3 della respirazione, integrare il tampone di saggio con 10 mM succinato, rotenone 0,1 pM, e 0,1 mg / ml digitonina. Per complesso IV-coupled stato 3 della respirazione, integrare il tampone di saggio con 1 mM ascorbato, 1 mM di N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilendiammina (TMPD), e 0,1 mg / ml digitonina. Mettere le soluzioni in un bagno d'acqua a 37 ° C.
2. Aspirare multimediali da un piatto di coltura contenente monostrato RPTC, aggiungere 2 ml di un caloroso stato 3 buffer di respirazione, raschiare delicatamente le cellule dalla piastra utilizzando un poliziotto in gomma, e trasferire la sospensione alla camera di consumo di ossigeno dotato di un Clark-elettrodo.
3. Misura lo stato 2 respirazione (in assenza di ADP). Avviare stato 3 della respirazione aggiungendo ADP ad una concentrazione finale di 0,4 mM. Avviare stato 4 respirazione aggiungendo oligomicina ad un Conc. finalezione di 0,5 ug / ml. Respirazione disaccoppiata viene misurata aggiungendo 0,5 FCCP pM di cellule respirano allo stato 3. ^6,7
4. Raccogliere la sospensione di cellule dalla camera, precipitato proteico con acido perclorico, e centrifugare il precipitato. Determinare la concentrazione di proteina nel pellet cellulare.

5. Analisi del potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm)

1. Preparare 0,5 mM JC-1 soluzione nel mezzo di coltura sterile.
2. Aggiungere lentamente 20 ml di soluzione di JC-1 ad ogni piatto per ottenere la concentrazione finale di 5 mM. Agitare il piatto per mescolare accuratamente il colorante. Riportare le piastre nel termostato per 30 minuti.
3. Mettere i piatti sul ghiaccio, media aspirato, monostrati e lavare due volte con PBS freddo ghiaccio. Aspirare il PBS, aggiungere 1 ml di PBS fresco, raschiare cellule dal piatto e trasferirli in una provetta Eppendorf. Break up monostrati in cellule singole pipettando su e giù.
4. Centrifugare la sospensione fino a 1.000 xg per 2 minuti, aspirate il surnatante, aggiungere 1 ml di PBS al pellet e risospendere di ottenere una sospensione di cellule singole. Ripetere l'operazione se necessario.
5. Spin celle in basso a 1.000 xg per 2 minuti, aspirare il surnatante, aggiungere 0,5 ml di PBS e risospendere il pellet. Analizzare fluorescenza mediante citometria di flusso con eccitazione da un 488 nm argon-laser a ioni. Leggere l'emissione in due canali separati, FL1 a 525 nm ed a 590 nm FL2. Potenziale di membrana mitocondriale è espresso come rapporto di fluorescenza FL2/FL1. ⁶

6. Isolamento dei mitocondri

1. Preparare i buffer di isolamento: tampone A (10 mM HEPES, 225 mM mannitolo, saccarosio 75 mM, EGTA 0,1 mM, pH 7,4), Tampone B (tampone A contenente inibitori delle proteasi, 1 mM Na VO _{3 4,} 1 mM NaF), e Buffer C (HEPES 10 mM, saccarosio 395 mM, 0,1 mM EGTA, pH 7,4). Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio.
2. Lavare due volte con monostrati RPTC ghiacciata PBS. Raschiare monostrati in provette Eppendorf e spina 500 xg per 5 min. Lavare il pellet in 1 ml di tampone A.
3. Risospendere il pellet in 1 ml di tampone B, e trasferire la sospensione in un 2 ml Dounce omogeneizzatore.
4. Omogeneizzare cellule nel omogeneizzatore Dounce finché la maggior parte delle cellule del omogenato sono rotti quando controllati al microscopio.
5. Centrifugare l'omogeneizzato a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e spin giù a 15.000 xg per 10 min a 4 ° C.
6. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet greggio contenente mitocondri in 1 ml di tampone C. Spin supernatanti giù a 15.000 xg per 10 min a 4 ° C. Ripetere il lavaggio dei due tempi a pellet più ^5.
7. Per misurare le attività dei complessi respiratori, risospendere pellet mitocondriale in 50-100 microlitri del tampone di saggio e congelamento in azoto liquido. Scongelare i campioni lentamente sul ghiaccio.

7. Misura di attività della NADH-ubichinone ossidoreduttasi (Complesso I)

1. Preparare il tampone di saggio: 10 mM KH ₂ PO _4, 5 mM MgCl _2, pH 7,2. Aggiungi acidi grassi senza BSA e NADH per ottenere concentrazioni finali di 0,25% e 0,25 mm, rispettivamente. Aggiungere 2 ml di soluzione di Antimicina A (1 mg / ml) ad una concentrazione finale di 2 mg / ml.
2. Eseguire i campioni a 48-pozzetti trasparente. Includere un campione in bianco che dispone di tutte le aggiunte, ma non mitocondri. A ciascun pozzetto, aggiungere 500 microlitri del tampone di saggio con aggiunte e mitocondri, ed incubare la piastra a 30 ° C in agitazione per 5 min.
3. Avviare la reazione aggiungendo 10 pl di ubichinone 3,25 mM a ciascun pozzetto. Registrare l'assorbanza (340 nm) per 3 min a intervalli di 20 secondi. Aggiungere 5 ml di soluzione di rotenone (1 mg / ml) ad ogni pozzetto e registrare l'assorbanza per ulteriori 2 min. Calcola il complesso I come il rotenone sensibile all'ossidazione NADH ^7.

8. Misura di attività della succinato-ubichinone ossidoreduttasi (Complesso II)

1. Preparare il tampone di dosaggio contenente 0,25% di acido grasso privo di BSA, succinato di potassio 20 mM, 0,25 mM 2,6-dichloroindophenol, 2 ug / ml antimicina A, e 10 ug / ml rotenone.
2. Eseguire i campioni in duplicato in 48 pozzetti trasparente compreso un campione in bianco che dispone di tutte le aggiunte, ma non mitocondri. A ciascun pozzetto, aggiungere 500 microlitri del tampone di saggio con aggiunte e mitocondri, ed incubare la piastra a 30 ° C in agitazione per 2 min.
3. Avviare la reazione aggiungendo 10 pl di ubichinone 3,25 mM a ciascun pozzetto. Registrare l'assorbanza (595 nm) per 3 min a intervalli di 20 secondi. Calcola attività del complesso II in seguito alla riduzione di 2,6-dichloroindophenol ^7.

9. Misura di attività di ubiquinolo-citocromo c ossidoreduttasi (Complesso III)

1. Preparare il tampone di analisi contenente 0,1% di acido grasso privo di BSA, succinato di potassio 80 mM, 10 pg / ml rotenone, e 0,24 mM cianuro di potassio.
2. Eseguire i campioniin duplice esemplare a 48 pozzetti trasparente compreso un campione in bianco che dispone di tutte le aggiunte, ma non mitocondri. A ciascun pozzetto 291 microlitri del tampone di saggio con aggiunte e mitocondri, ed incubare la piastra a 30 ° C in agitazione per 5 min.
3. Avviare la reazione aggiungendo 3 ml di 6 mM ossidato citocromo c in ciascun pozzetto. Registrare l'assorbanza (550 nm) per 3 min a intervalli di 20 secondi. Aggiungere 5 ml di soluzione di Antimicina A (1 mg / ml) ad ogni pozzetto e registrare l'assorbanza per ulteriori 2 min. Calcola complessa attività III A-sensibile riduzione antimicina citocromo c ^7.

10. Misura di attività della citocromo ossidasi (Complesso IV)

1. Preparare ridotti citocromo c aggiungendo ascorbato di sodio a 9 mM soluzione di citocromo c dialisi e la soluzione per una notte a 4 ° C in 1 L di tampone fosfato (10 mM KH ₂ PO _4, pH 7,2) contenente 5 mM MgCl _2. Preparare il tampone di dosaggio contenente0,1% di acido grasso privo di BSA e antimicina A (2 mg / ml).
2. Eseguire i campioni a 48-pozzetti trasparente compreso un campione in bianco che dispone di tutte le aggiunte, ma non mitocondri. A ciascun pozzetto 233 microlitri del tampone di saggio con aggiunte e mitocondri, ed incubare la piastra a 30 ° C in agitazione per 5 min.
3. Avviare la reazione aggiungendo ridotta citocromo c (90 pM concentrazione finale). Registrare l'assorbanza (550 nm) per 3 min a intervalli di 20 secondi. Aggiungere 2 ml di soluzione di KCN (8 mg / ml) ad ogni pozzetto e registrare l'assorbanza per altri 2 minuti. Calcola complessa attività IV, secondo il KCN sensibile ossidazione citocromo c ^7.

11. Misura di attività di F ₀ F _1-ATPasi (ATP sintasi)

1. Preparare F ₀ F _1-ATPasi tampone di saggio (10 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 2 _mM MgCl2, pH 8,2). Risospendere pellet mitocondriale nel tampone di saggio, congelare i campioni mitocondriali in liquidazioned azoto e scongelare i campioni lentamente sul ghiaccio.
2. Eseguire gli esempi in triplice copia in un 48-pozzetti trasparente. Per ciascun gruppo di trattamento, 2 pozzi verrà eseguito per misurare l'attività totale ATPasi (275 microlitri del tampone di saggio, 5 microlitri di sospensione mitocondriale, e 5 ml di etanolo al 95%) ed 1 pozzetto per misurare oligomicina-insensitive ATPasi (275 pl di il tampone di saggio, 5 microlitri di sospensione mitocondriale, e 5 microlitri di 1 mg / ml soluzione oligomicina in 95% etanolo).
3. Incubare i campioni a 31 ° C per 10 minuti con agitazione costante. Aggiungere 16 ml di soluzione 100 mM ATP (pH 7,0) e incubare a 31 ° C per 5 minuti con agitazione costante.
4. Trasferire 200 microlitri della miscela di incubazione in una provetta contenente 50 ml di 3 M TCA. Incubare campioni in ghiaccio per 10 min e spin giù a 10.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Utilizzare supernatanti e pellet per determinare fosfato e contenuto proteico, rispettivamente.
5. Determinare il contenuto di fosfato nel supernatante utilizzando l'fosfato inorganico dosaggio. Preparare 100 ml di reagente Sumner aggiungendo 0,88 g FeSO ₄ a 10 ml di 3,75 MH ₂ SO ₄ e regolando a 90 ml con H ₂ O. Aggiungere 10 ml di soluzione di molibdato di ammonio (0,66 g/10 ml H ₂ O) alla soluzione di FeSO ₄ in H ₂ SO _4. Proteggere dalla luce.
6. Carico piastra a 96 pozzetti con 50 microlitri di ogni standard fosfato (0 - 1.000 pM KH ₂ PO ₄₎ e 50 pl di ciascun supernatante in duplicati. Aggiungere 250 microlitri di reagente Sumner in ciascun pozzetto ed incubare la piastra a 30 ° C per 15 minuti con agitazione costante.
7. Registrare l'assorbanza a 595 nm a temperatura ambiente. F ₀ F _1-ATPasi è determinata misurando la oligomicina sensibile rilascio di P _i da ATP come descritto in precedenza. ^7,8 Calcolo totale e oligomicina-insensitive F ₀ F _1-ATPasi attività. Per calcolare il oligomicina sensibile ATPasi actività, sottrarre oligomicina-insensitive attività dal ATPasi totale. ^8,9

12. Misurazione di contenuto intracellulare ATP

1. Luogo piastre di coltura contenenti monostrati RPTC su ghiaccio, medie aspirato, e lavare i monostrati due volte con tampone PBS freddo ghiaccio. Aggiungere 1 ml di PBS per ciascun monostrato, raschiare ciascun monostrato in PBS, e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta Eppendorf. Spin le provette Eppendorf in microcentrifuga per 5 sec.
2. Determinare il contenuto di ATP in ciascun campione RPTC dal metodo luciferasi utilizzando la bioluminescenza ATP Assay Kit HS II (Roche) e il protocollo del produttore. Determinare la concentrazione di proteina in ciascun campione e calcolare la concentrazione di ATP per mg di proteina. ⁸

13. Visualizzazione di Morfologia mitocondriale

1. Cambia terreni di coltura. Aggiungere 2 ml di soluzione 100 mM di MitoTracker Red 580 a ogni piatto (conc finale. 100 nM) e restituire i piatti al incubator per 30 min.
2. Esaminare i monostrati vivere sotto un microscopio a fluorescenza con un obiettivo di immersione in acqua ^5.

14. Analisi della vitalità cellulare

1. A 24 ore prima di iniziare il test preparare 50ml di soluzione mM di cisplatino per il trattamento di cellule che serviranno come controllo positivo per l'apoptosi (annessina V-positive cellule). Inoltre, preparare una soluzione 500 mM di tert-butilidroperossido per il trattamento di cellule che serviranno come controlli positivi per oncosis (ioduro di propidio cellule positive).
2. Trattare 2 piatti con 2 ml di 50 mM cisplatino e 2 piatti con 2 ml di 500 mM terz-butilidroperossido. Dedicare 1 piatto per un no-macchia controllo.
3. A 24 ore dopo il trattamento con cisplatino e TBHP, preparare il tampone di legame (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 1,8 mM CaCl ₂₎ e ioduro di propidio (PI) soluzione (50 mg / ml) nel tampone di legame.
4. Lavare monostrati una volta con il buff vincolanteer. Aggiungere 1 ml di tampone ghiacciato e 50 pl di soluzione di PI per ogni piatto tranne per i non-macchia e annessina V-positive cellule. Coprire i piatti e incubare in ghiaccio per 15 minuti con gentile agitazione orbitale.
5. Lavare monostrati con il tampone di legame (10 min) e aggiungere 1 ml di tampone di legame e 2 microlitri di annessina V-FITC soluzione per ogni piatto tranne per cellule non-macchia e PI-positive. Coprire i piatti e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti con delicata agitazione orbitale.
6. Aspirare il tampone e lavare i monostrati con 1 ml di tampone ghiacciato vincolante in ghiaccio per 10 min con delicata agitazione orbitale. Ripetere la fase di lavaggio.
7. Aspirare il tampone di legame e aggiungere 500 ml di tampone di legame per ogni piatto. Raschiare delicatamente le cellule utilizzando un poliziotto in gomma e trasferire le cellule a scorrere i tubi di citometria. Disperdere le cellule in una sospensione di cellule singole pipettando campioni su e giù. Suddividere i cluster cellulari.
8. Quantificare PI e annessina V-FITC immediatamente flocitometria w usando eccitazione a 488 nm ed emissione a 590 e 530 nm per PI e FITC, rispettivamente. Conta 10.000 eventi per ciascun campione.
9. Mettere la fluorescenza FITC sulla asse X e la fluorescenza PI sulla Y dei citometria figure dot plot. Cellule positive per annessina V e negativo per PI sono considerati apoptotico. Le cellule positive per PI e negativo per annessina V sono considerati oncotica. ^10,11

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Risultati

La Figura 1 mostra che la consegna adenovirale di cDNA codificante le costitutivamente attivo (caPKC-ε) e inattivi (dnPKC-ε) mutanti di PKC-ε si traduce in livelli di proteine ​​significativamente aumentati di PKC-ε in RPTC e nei mitocondri. Le cellule infettate con cDNA che porta il caPKC-ε vettore sovraespresso il fosforilata (attiva) sotto forma di PKC-ε mentre le cellule infettate con cDNA codificante dnPKC-ε overexpressed PKC-ε che è stato inattivo (non fosforilata) (Figura 1)....

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Discussione

L'approccio qui presentato consente di sovraespressione di isoenzimi singoli PKC nella coltura primaria di cellule del tubulo prossimale renale. Ci sono diversi punti di forza di questo approccio: 1. Permette di studiare meccanismi di regolazione in una popolazione omogenea di cellule (cellule del tubulo prossimale renale) che sono l'obiettivo primario per insulti vari (ischemia, ipossia, stress ossidativo), farmaci e nephrotoxicants all'interno del rene. 2. Funzioni mitocondriali in questo modello in vi...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
Cappa a flusso laminare	Thermo Electron Corporation	FORMA 1104
2 ml e 15 ml smerigliatrice Dounce tessuto	WHEATON	989-24607, 357.544
85 e 235 micron maglia di nylon	Piccole parti	CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
50 ml provetta sterile	BIOLOGIX	BCT-P 50BS
1,5 ml micro tubo	Sarstedt	72.690.001
35 x 10 mm piastre di coltura sterili	Corning	430165
Jouan Centrifuga	Jouan	Jouan CR3 11175704 Rotori: Jouan T40
Regolabile micro-centrifuga	SIGMA	Modello 1-15
Monitor di ossigeno biologica	YSI Incorporated	YSI modello 5300A
Singolo Ossigeno Sistema Camerale Micro	YSI Incorporated	5356S
Sonda di ossigeno	YSI Incorporated	5331A
Bagno di circolazione	YSI Incorporated	5310
KCl e Kit membrana standard	YSI Incorporated	5775
Agitatore magnetico	YSI Incorporated	5222
Registratore Flatbed	Kipp & Zonen	BD 11E
48 pozzetti e piastre da 96 pozzetti trasparenti	Costar	3548, 3679
Thermomixer R	Eppendorf	5355 21919
Agitatore orbitale MaxQ 2000	Thermo Scientific	SHKA 2000
Spectra FLUOR Plus (assorbanza / fluorescenza / luminescenza lettore)	Tecan	F129005
Camicia d'acqua degli Stati Uniti Autoflow automatica di CO 2 incubatore	Nuaire	NU 4850
12x75 mm in polistirolo Provette di coltura per citometria a flusso	Fisher Marca	14-961-20
Axioskop Obiettivo a immersione in acqua 63x / 0,90 W	Carl Zeiss	114846 Achroplan 44 00 67
DMEM / F12	Cellgro	99-830 - PB
DMEM / Ham F12	Sigma	D 2906 - 1L
Deferoxamina Mesylate	Hospira	D110
Collagenasi Tipo I	Worthington	4196
Inibitore della tripsina	Sigma	T 6522 - 500mg
5,5 ', 6,6'-tetracloro-1, 1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine ioduro (JC-1)	Invitrogen	T3168
Mitotracker Red	Invitrogen	M22425
ATP bioluminescenza Assay Kit HS II	Roche	11 699 709 001
Annessina V - FITC soluzione	BioVision	1001 - 200
Citometro di flusso	BD Biosciences	BD FACSCalibur