Sintesi di fase-shift nanoemulsioni con distribuzioni di dimensioni strette per vaporizzazione Droplet acustico e Bubble-enhanced Ultrasound-mediata Ablazione

Riepilogo

Phase-shift nanoemulsioni (PSNE) può essere vaporizzato con ultrasuoni focalizzati ad alta intensità per migliorare il riscaldamento localizzato e migliorare la termoablazione nei tumori. In questa relazione, la preparazione di PSNE stabile con una distribuzione di dimensione stretta è descritto. Inoltre, l'impatto di PSNE vaporizzato su ultrasuoni-mediata ablazione è in tessuti che imitano fantasmi.

Abstract

Ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HIFU) è usato in clinica per l'ablazione termica dei tumori. Per migliorare riscaldamento localizzato e migliorare ablazione termica nei tumori, lipidi rivestite goccioline perfluorocarburiche sono stati sviluppati che possono essere vaporizzato da HIFU. La vascolarizzazione in molti tumori è anormalmente perde a causa della loro rapida crescita, e nanoparticelle sono in grado di penetrare le fenestrazioni e passivamente accumulano all'interno del tumore. Pertanto, controllando la dimensione delle goccioline può migliorare accumulo all'interno del tumore. In questa relazione, la preparazione di gocce stabili in un sfasamento nanoemulsione (PSNE) con una distribuzione granulometrica ristretta viene descritto. PSNE stati sintetizzati da sonicating una soluzione lipidica in presenza di perfluorocarburo liquido. Una distribuzione dimensionale ristretta è stato ottenuto estrudendo i tempi PSNE multipli utilizzando filtri con pori di 100 o 200 nm. La distribuzione delle dimensioni è stata misurata in un periodo di 7 giorni con Dynamic Light Scattering. Polyacidrogel rylamide contenenti PSNE sono stati preparati per esperimenti in vitro. Goccioline PSNE nei idrogel sono stati vaporizzati con gli ultrasuoni e le bolle risultano migliorate riscaldamento localizzato. Vaporizzato PSNE permette un riscaldamento più rapido e riduce anche l'intensità ultrasuoni necessari per l'ablazione termica. Così, PSNE dovrebbe migliorare ablazione termica nei tumori, migliorando potenzialmente risultati terapeutici di HIFU-mediate trattamenti di ablazione termica.

Protocollo

1. Preparazione della fase-shift nanoemulsione (PSNE)

1. Sciogliere 11 mg e 1,68 mg DPPC DSPE-PEG2000 in cloroformio
2. Si evapora il solvente organico per formare un film secco lipide in un pallone di vetro a fondo rotondo
3. Dessicate il film lipidico durante la notte
4. Reidratare il film lipidico con 5,5 ml di tampone fosfato salino (PBS)
5. Soluzione di calore in un bagno di acqua a 45 ° C fino a quando si scioglie film lipidico, vortex periodicamente
6. Trasferire la soluzione lipidica in 7 ml Fiala
7. Sonicare soluzione lipidica per 2 min a 20% dell'ampiezza
8. Dividere la soluzione in due flaconcini da 2,5 ml (scartare restante 0,5 ml)
9. Aggiungere 2,5 ml di soluzione salina in ogni fiala
10. Posizionare ciascun flacone con un 0 ° C bagno di acqua ghiacciata
11. Aggiungere 50 microlitri DDFP ad ogni flacone
12. Sonicare ogni flacone nel bagno di acqua ghiacciata utilizzando le seguenti impostazioni: 25% di ampiezza, modalità pulsata (10 sec a 50 sec spento), 60 secondi sul tempo totale
13. Transfer soluzioni PSNE a 20 fiale da scintillazione ml
14. Aggiungere 5 ml di soluzione salina in ogni fiala, con conseguente in 10 ml di volume finale
15. Montare indicazioni seguenti estrusione forniti dal produttore
    1. Lavare ogni parte con acqua deionizzata
    2. Posizionare il disco di supporto in acciaio inox al centro della base di supporto filtro
    3. Posizionare la maglia di acciaio inossidabile sulla parte superiore del disco di sostegno dell'acciaio inossidabile
    4. Con una pinzetta, posizionare una membrana di scarico estrusore disco (su lato lucido) sulla rete di acciaio inossidabile
    5. Con una pinzetta, posizionare il filtro estrusore (il lato lucido) sulla membrana disco di scarico
    6. Posizionare con cura il piccolo O-ring sul filtro e posizionare il thermobarrel e top estrusore al di sopra della base d'appoggio
    7. Serrare parzialmente ogni ala-primo dado, quindi serrare a fondo le ali-dadi a mano, in modo alterno
    8. Collegare l'estrusore auna linea di gas azoto
    9. Per caricare il, estrusore pipetta da 10 ml di acqua deionizzata alla porta di esempio, chiudere l'apertura, e serrare la valvola di sfiato
    10. Aprire lentamente la linea di gas azoto per aumentare la pressione, costringendo il campione attraverso le membrane, e raccogliere il campione dal tubo di uscita
    11. Dopo l'uso, smontaggio in ordine inverso, sciacquare le parti dell'estrusore con acqua deionizzata, e gettare il filtro a membrana e scarico disco membrana
16. Per 100 nm goccioline solo, pre-condizione PSNE per estrusione di 10 volte con filtro a 200 nm
17. Estrusione PSNE 16 volte in 100 nm o 200 nm di filtro per ottenere una distribuzione ristretta dimensione

2. Preparazione di Hydrogel poliacrilammide contenente PSNE

1. Preparare una soluzione al 24% di BSA diluendo 1,2 g BSA polvere in 5 ml di acqua deionizzata
2. Preparare la soluzione APS 10% diluito 0,1 g di polvere in 1 ml APS deionizzata water
3. Nel seguente ordine, miscelare 2,1 ml di soluzione di acrilammide, 1,2 ml di tampone Tris, 0,1 ml APS 10%, 4,5 ml di soluzione al 24% di BSA e 3,6 ml di acqua deionizzata in camera di plastica
4. Riscaldare a 40 ° C e posto sotto vuoto per 1 ora
5. Aggiungere 480 ml di PSNE e mescolare bene agitando con delicatezza la camera di plastica.
6. Aggiungere 12 microlitri TEMED e posizionare la camera in un bagno di acqua 12 ° C per 2 ore

3. Risultati rappresentativi

Un schematico della configurazione per esperimenti ultrasuoni con tessuti che imitano fantasmi idrogel è mostrato in Figura 1. Questo protocollo risulta in lipidi rivestite goccioline perfluorocarburiche con una distribuzione di dimensione ristretta che sono stabili in soluzione per almeno una settimana. La distribuzione della dimensione misurata con light scattering dinamico (Particle Analyzer 90Plus Size, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) è mostrato in Figura 2 per PSNE estrusi con 100 e 200nm filtri. Il diametro PSNE efficace nel tempo, misurato utilizzando dispersione dinamica della luce, è riportata nella Tabella 1, dimostrando che PSNE sono stabili per almeno una settimana. B-mode immagini di PSNE prima e dopo vaporizzazione in un idrogel di poliacrilamide sono mostrati in Figura 3. Inoltre, una lesione formata da 15 sec di HIFU-mediata riscaldamento in un idrogel di poliacrilamide contenente albumina e PSNE è mostrato in Figura 4. La forma asimmetrica della lesione è il risultato del riscaldamento prefocal che si verifica a causa della presenza della nube bolla nel percorso ultrasuoni. È importante notare che il riscaldamento prefocal e formazione di lesione a causa dispersione da bolle può essere minimizzata riducendo la potenza acustica trasmessa.

Figura 1. Schema del setup sperimentale per ultrasuoni esperimenti con tessuto-mimIcking idrogel.

Figura 2. Dimensione distribuzione di PSNE estruso attraverso 100 nm o 200 nm filtri, misurata con Dynamic Light Scattering. Le unità degli assi delle ordinate sono basati sull'intensità della luce diffusa dalle particelle di una certa dimensione relativa alla intensità totale della luce diffusa dal campione.

Figura 3. Immagini B-mode (a) prima e (b) dopo la vaporizzazione PSNE in un idrogel di poliacrilamide. La freccia indica la regione focale dove è formata una nube bolla per vaporizzazione PSNE.

Immagini Figura 4. Del polyacrylamide idrogel contenente albumina e PSNE (a) prima e (b) dopo la vaporizzazione e la sonicazione con HIFU, dimostrando formazione di lesione a seguito di ultrasuoni indotta riscaldamento. La frequenza centrale degli ultrasuoni è stata del 3,3 MHz. Il segnale ad ultrasuoni consisteva in un ciclo iniziale di 30, 6,4 W impulsi per vaporizzare PSNE, immediatamente seguito da 15 secondi di ultrasuoni continuo a 0,77 W.

Giorni dopo estrusione	Estruso con filtro a 200 nm		Estruso con filtro 100 nm
	Media Dia. (Nm)	Std. Dev. (Nm)	Media Dia. (Nm)	Std. Dev. (Nm)
1	182,9	4,9	118,0	0,9
7	177,7	2,5	124,8	3,1

Tabella 1. Diametro medio e la deviazione standard di PSNE a uno e sette giorni dopo l'estrusione con 100 nm e 200 nm filtri.

Discussione

Ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HIFU) è usato clinicamente per l'ablazione termica tumori. ¹ Per migliorare riscaldamento localizzato e migliorare ablazione termica nei tumori, lipidi rivestite goccioline perfluorocarburiche sono stati sviluppati che possono essere vaporizzato da HIFU. La vascolarizzazione in molti tumori è anormalmente perde a causa della loro rapida crescita. ² Così, nanoparticelle sono in grado di penetrare le fenestrazioni e passivamente accumulano all'int...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome comune	Fabbricante	Cat. Numero	Nome e Cognome / Descrizione
DPPC	Lipidi Avanti, Alabaster, AL, Stati Uniti d'America	850355P	1,2-dipalmitoil-sn-glycero-3-phosphocholine
DSPE-PEG2000	Lipidi Avanti, Alabaster, AL, Stati Uniti d'America	880120P	1,2-distearoil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[metossi (polietilene glicole) -2000] (sale di ammonio)
DDFP	Fluoromed, Round Rock, TX, Stati Uniti d'America	CAS: 138495-42-8	Dodecafluoropentano (C 5 F 12)
PBS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d'America	P2194	PBS
Cloroformio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d'America	372978	Cloroformio
Acrilamide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d'America	A9926	40% 19:01 acrilammide / bis-acrilamide
Tampone Tris	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d'America	T2694	1M, pH 8, cloridrato trizma e trizma di base
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d'America	A3059	Albumina di siero bovino
APS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d'America	A3678	Ammonio persolfato soluzione
TEMED	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d'America	87689	N, N, N ', N'-tetrametiletilendiammina
			Attrezzatura
Sonicator (3 punta mm)	Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT, Stati Uniti d'America	Vibra-Cell
Bagnomaria	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti d'America	Neslab EX-7
Estrusore	Lipidi del Nord, Burnaby, BC, Canada	Lipex
Estrusori Filtri	Whatman, Piscataway, NJ, USA	Nuclepore # 110605 e # 110606
Estrusore di scarico del disco	Sterlitech Corporation, Kent, WA, Stati Uniti d'America	# PETEDD25100
Camera di plastica	US Plastic Corporation, Lima, OH, Stati Uniti d'America	# 55288, 1 3/16 "x 1 3/16" x 2 7/16 "