RNA-seq Analisi trascrittomi in trombina-trattati e di controllo dell&#39;uomo polmonari cellule endoteliali microvascolari

Dilyara Cheranova; Margaret Gibson; Suman Chaudhary; Li Qin Zhang; Daniel P. Heruth; Dmitry N. Grigoryev; Shui Qing Ye

doi:10.3791/4393

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Method Article

RNA-seq Analisi trascrittomi in trombina-trattati e di controllo dell'uomo polmonari cellule endoteliali microvascolari

DOI:

10.3791/4393

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February 13th, 2013

Dilyara Cheranova¹, Margaret Gibson¹, Suman Chaudhary¹, Li Qin Zhang¹, Daniel P. Heruth¹, Dmitry N. Grigoryev¹, Shui Qing Ye¹

¹Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

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Riepilogo

Questo protocollo presenta una procedura completa e dettagliata di applicare RNA-seq, una potente tecnologia di nuova generazione di sequenziamento del DNA, per trascrittomi profilo in umano cellule endoteliali microvascolari polmonari con o senza trattamento trombina. Questo protocollo è generalizzabile a varie cellule o tessuti colpiti da diversi reagenti o stati di malattia.

Abstract

La caratterizzazione di espressione genica in cellule attraverso la misurazione dei livelli di mRNA è uno strumento utile nel determinare come la macchina di trascrizione della cellula è influenzata da segnali esterni (per esempio trattamento di droga), o come cellule differiscono tra uno stato di salute e di uno stato di malattia. Con l'avvento e il perfezionamento continuo della prossima generazione di tecnologia di sequenziamento del DNA, RNA-sequenziamento (RNA-seq) è diventato un metodo sempre più popolare di analisi del trascrittoma di catalogare tutte le specie di trascrizioni, per determinare la struttura della trascrizione di tutti i geni espressi e di quantificare i livelli di espressione di cambiamento del set totale di trascritti in un dato ^1,2 cellula, tessuto o organismo. RNA-seq sostituisce progressivamente DNA microarrays come metodo preferito per l'analisi del trascrittoma perché ha i vantaggi di una profilatura transcriptome completa, fornendo un tipo di dato digitale (numero di copie di ogni trascrizione) e non basandosi su qualsiasi sequen genomica notace ^3.

Qui vi presentiamo un protocollo completo e dettagliato di applicare RNA-seq per trascrittomi profilo in umano cellule endoteliali microvascolari polmonari con o senza trattamento trombina. Questo protocollo si basa sul nostro recente studio pubblicato dal titolo "RNA-Seq rivela trascrittoma Romanzo di geni e loro isoforme umane in cellule endoteliali microvascolari polmonari trattati con trombina," ⁴ in cui abbiamo effettuato con successo la prima analisi completa del trascrittoma umane polmonari cellule endoteliali microvascolari trattate con trombina utilizzando RNA-seq. Ha prodotto le risorse senza precedenti per la sperimentazione ulteriore di acquisire conoscenze sui meccanismi molecolari alla base di trombina-mediata disfunzione endoteliale nella patogenesi di condizioni infiammatorie, il cancro, il diabete e le malattie cardiache coronariche, e fornisce nuovi indizi per potenziali bersagli terapeutici per queste malattie.

Il testo descrittivo di questo protocolloè diviso in quattro parti. La prima parte descrive il trattamento di polmonari umane cellule endoteliali microvascolari con trombina e isolamento dell'RNA, analisi della qualità e quantificazione. La seconda parte descrive la costruzione della libreria e sequenziamento. La terza parte descrive l'analisi dei dati. La quarta parte descrive una RT-PCR convalida. I risultati rappresentativi di diversi passaggi chiave vengono visualizzati. Consigli utili o precauzioni per aumentare il successo in passaggi chiave sono forniti nella sezione di discussione. Sebbene questo protocollo utilizza polmonari umane cellule endoteliali microvascolari trattate con trombina, può essere generalizzato a trascrittomi profilo sia nelle cellule di mammiferi e non mammiferi e nei tessuti trattati con differenti stimoli o inibitori, o per confrontare trascrittomi in cellule o tessuti tra uno stato di salute e uno stato di malattia.

Protocollo

Un diagramma di flusso che illustra questo protocollo è mostrato in Figura 1.

1. Il trattamento delle cellule con la trombina, l'RNA Isolation, della Qualità e di quantificazione di RNA

La cultura umana del polmone cellule endoteliali microvascolari (HMVEC-LBL) al 90-100% confluenza in piastre da 6 pozzetti in EGM-2 media al 5% di FBS, fattori di crescita e gli antibiotici (Lonza, cat # CC-3202).
Cambiare supporto ai media fame (0% FBS) 30 minuti prima del trattamento con trombina.
Trattare le cellule con 0,05 U / ml di trombina o lasciato non trattato come un controllo per 6 ore a 37 ° C e 5% di CO _2.
Isolare RNA totale dalle cellule trattate e di controllo con il Ambion mir Vana kit secondo le istruzioni del produttore.
Valutare la qualità del RNA con un eucariote Experion StdSense chip di RNA in base al protocollo standard Automated Stazione elettroforesi Experion (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
Quantificare l'RNA utilizzando un metodo standard spettrofotometrico.

2. Biblioteca Edilizia e Sequencing

Usare 1 pg di RNA di alta qualità totale per campione come materiale di partenza.
Per costruire la biblioteca, seguire la procedura standard da Illumina (protocollo # 15008136 Rev. A). In questo protocollo, due cicli di poly (A) dell'mRNA contenenti selezioni vengono eseguite per rimuovere rRNA per minimizzare il sequenziamento rRNA.
Valutare la qualità delle biblioteche utilizzando un chip di DNA 1K Experion secondo il protocollo standard sulla Stazione Experion elettroforesi automatica ( www.bio-rad.com ).
Quantificare la libreria utilizzando qPCR: Utilizzare una libreria che è già stato sequenziato da una curva standard e primer specifici per gli adattatori legato. Utilizzare una serie di diluizioni delle biblioteche sconosciute (cioè 1:100, 1:500 e 1:1000). Eseguire l'acco qPCRrding al protocollo SyberGreen MM e calcolare la concentrazione originale stock di ogni libreria.
Diluire le scorte di libreria a 10 nM e conservare a -20 ° C fino al momento di cluster di una cella di flusso.
Quando si è pronti a raggrupparsi una cella di flusso, scongelare la piastra CBOT reagente in un bagno d'acqua. CBOT è uno strumento Illumina utilizzato per semplificare il processo di generazione di cluster.
Lavare lo strumento CBOT.
Denaturare le librerie: Combinare 13 microlitri 1x TE e 6 microlitri 10 mM biblioteca e, al lato del tubo, aggiungere 1 ml di NaOH 1 N (fornito da Illumina). Vortex, spin down, incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e posizionare le librerie denaturati su ghiaccio.
Diluire le librerie: Diluire le librerie denaturato con pre-raffreddata tampone di ibridazione (HT1, fornito da Illumina) combinando 996 microlitri HT1 e 4 microlitri biblioteca denaturato per una concentrazione finale di 12 pM. Posizionare le librerie denaturati e diluito su ghiaccio.
Capovolgere ogni fila di tubi della piastra CBOT,assicurare che tutti i reagenti vengono scongelate. Centrifugare la piastra, rimuovere / forare le guarnizioni strisce e caricare sul CBOT.
Aliquotare 120 ml di diluito, le biblioteche denaturati a un cilindro delle strisce, etichetta 1-8. Aggiungere 1,2 microlitri diluito, denaturati biblioteca controllo PhiX (da Illumina) in ciascuna provetta come un picco-in controllo. Vortex e centrifugare le provette e caricarli sul CBOT con l'orientamento corretto (tubo # 1 verso destra).
Caricare una cella di flusso e collettore sul CBOT.
Completate il flusso di controllo e iniziare la corsa di clustering.
Una volta completata l'analisi, controllare la consegna dei reagenti in tutte le corsie. Prendere nota di eventuali anomalie. O iniziare la corsa di sequenziamento immediatamente o conservare la cella di flusso nel tubo fornito a 4 ° C.
Scongelare il sequenziamento per sintesi (SBS, Illumina) reagenti.
Caricare i reagenti ai punti giusti sui vassoi reagenti, facendo attenzione a non toccare gli altri reagenti dopo aver toccato il mix scissione.
Utilizzando un non-sequenziamento cella di flusso (vale a dire quello che è stato sequenziato in precedenza), le linee dei reagenti prime due volte.
Pulire accuratamente la cella di flusso di sequenza con il 70% EtOH e Kimwipes, seguito dal 70% EtOH e salviette. Ispezionare la cella di flusso per eventuali aloni. Re-pulirlo se necessario.
Caricare la cella di flusso sul sequencer ed eseguire un flusso di controllare che la tenuta tra il collettore e la cella di flusso è stretto.
Avviare la corsa di sequenziamento.
Valutare le metriche di qualità (ad esempio, la densità di cluster, i cluster di passaggio filtro, Q30, di intensità) che vengono resi disponibili durante la corsa.
Monitorare l'intensità per tutta la corsa.
Dopo 101 cicli sono completati, effettuare chimica turnaround per completare la seconda lettura: Scongelare i reagenti terminali accoppiati e il secondo tampone Incorporation lettura (ICB, un componente di reagenti SBS, Illumina) e caricare i reagenti.
Continua la corsa di sequenziamento, valutazione 2 ^° letto intensità, Q30 unmetriche di qualità nd altre i progressi di esecuzione.

3. Analisi dei dati

Utilizzare la versione più recente di casava (Illumina, attualmente 1.8.2) per convertire i file di base (chiamate. Bcl) file per file. Fastq, impostando fastq-cluster-count a 0 per garantire la creazione di un file fastq unico per ogni campione . Decomprimere i file fastq per l'analisi a valle.
Eseguire l'allineamento fine accoppiato con le ultime versioni di TopHat (1.4.1) ^5, che allinea l'RNA-seq legge di mammiferi di dimensioni genomi utilizzando l'ultra high-throughput allineatore breve lettura (, Bowtie 0.12.7) ⁶ e SAMtools (0.1. 17) ^7. SAMtools implementa varie utilità per la post-elaborazione allineamenti in formato SAM. Il trascrittoma umano di riferimento può essere scaricato dal iGenomes ( www.illumina.com ). In esecuzione TopHat, abbiamo usato tutte le impostazioni di default dei parametri tra cui l'opzione di libreria dei tipi come fr-unstranded (default).
Noizione del programma CuffDiff, parte dei gemelli (1.3.0) ⁸ pacchetto software, confronta le cellule trattate con trombina alle cellule controlli per escludere dei trascritti genici differenzialmente espressi nella ex basato sul trascrittoma umano di riferimento. Questo confronto rileva l'espressione differenziale dei trascritti noti. Utilizzare Microsoft Excel per visualizzare il risultato sotto forma di tabella. In esecuzione del programma Gemelli, abbiamo usato tutte le impostazioni di default dei parametri. Le trascrizioni del gene con FPKM <0,05 e p> 0,05 sono filtrati.
Per rilevare isoforme nuovi, eseguire Gemelli senza un trascrittoma di riferimento. Confronta i file di esempio trascrizione al genoma di riferimento usando Cuffcompare e testare l'espressione differenziale con Cuffdiff utilizzando i file combinati trascrizione della trombina come il genoma di riferimento per una analisi e le file di controllo combinati trascrizione come il genoma di riferimento per una seconda analisi. Utilizzare Microsoft Excel per visualizzare il risultato in formato tabulare. Nuovamente, thostrascrizioni elettroniche gene con FPKM <0,05 e p> 0,05 sono filtrati. Dopo questo passo, gli investigatori possono scegliere di caricare un elenco di trascrizioni segnalate di recente al sito UCSC Genome Browser ( http://genome.ucsc.edu/ ) per verificare la validità di un controllo manuale.
Presentazione delle liste di geni differenzialmente espressi Analisi Ingenuity Pathway (IPA, www.ingenuity.com ) per la caratterizzazione dei geni e le vie interessate dal trattamento trombina. In questa fase, gli investigatori possono scegliere di utilizzare cummerbund ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), un pacchetto di R che è stato progettato per aiutare e semplificare il compito di analizzare Gemelli RNA-seq uscita, per aiutare a gestire, visualizzare e integrare tutti i dati prodotti da una analisi Cuffdiff.

4. Validazione dei RNA-Seq Risultati della quantitativa in tempo reale-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)

Eseguire isolamento dell'RNA totale di controllo e la trombina trattati HMVEC-LBL cellule, RNA qualità di valutazione e quantificazione RNA descritto nei passi 1,4-1,6.
Generazione di DNA complementare da 1 mcg RNA totale di ciascun campione con SuperScript III First-Strand Synthesis Kit sistema RT, seguendo le istruzioni del produttore (Invitrogen, 18080-051).
Eseguire qRT-PCR su Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System utilizzando Taqman Assay-on-Demand oligonucleotidi progettati per l'individuazione di CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -associated factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1), e β-actina (ACTB, Hs99999903_m1). Ogni campione aveva un modello equivalente a 5 ng di RNA totale. Misurare quantificazione con il metodo DDCT e normalizzare per β-actina. Ogni saggio è stato eseguito in almeno tre repliche biologiche.