Studio Locomotion quantitativa di Liberamente Nuoto microorganismi Uso diffrazione laser

Riepilogo

Organismi microscopici, come il free-nuoto nematode C. elegans, Vivere e comportarsi in un complesso ambiente tridimensionale. Riportiamo su un nuovo approccio che fornisce un'analisi di C. elegans Con pattern di diffrazione. Questo approccio consiste inseguimento periodicità temporale di diffrazione generati dirigendo la luce laser attraverso una cuvette.

Abstract

Suolo e acquatici organismi microscopici vivere e comportarsi in un complesso ambiente tridimensionale. La maggior parte degli studi sul comportamento organismo microscopico, al contrario, sono stati eseguiti utilizzando microscopio approcci, che limitano il movimento e il comportamento di una stretta, campo quasi bidimensionale focale. ¹ Vi presentiamo un nuovo approccio analitico che fornisce analisi in tempo reale di liberamente nuoto C. elegans in una cuvetta senza dipendenza da microscopio a base di attrezzature. Questo approccio consiste inseguimento periodicità temporale di diffrazione generati dirigendo la luce laser attraverso la cuvetta. Misuriamo frequenze di oscillazione per i nematodi liberamente nuoto.

Analisi dei campo lontano pattern di diffrazione rivela indizi sulla forme d'onda dei nematodi. Diffrazione è il processo di deflessione della luce attorno ad un oggetto. In questo caso la luce viene diffratta dagli organismi. Le onde luminose interferiscono e possono formare adiffraction modello. Un campo lontano, o Fraunhofer, diffrazione è formato se lo schermo a distanza oggetto è molto più grande dell'oggetto diffrazione. In questo caso, il modello di diffrazione può essere calcolata (modellato) utilizzando una trasformata di Fourier. ²

C. elegans sono a vita libera nel terreno nematodi che navigano in tre dimensioni. Si muovono sia su una matrice solida come il suolo o agar in un andamento sinusoidale locomotoria chiamato scansione e in liquido in un modello diverso chiamato nuoto. ³ I ruoli svolto dalle informazioni sensoriali fornite da mechanosensory, chemiosensoriali, e le cellule che regolano thermosensory cambiamenti plastici in locomotoria i modelli e gli interruttori dei modelli stanno solo iniziando a chiarire. ⁴ Abbiamo descrivere un approccio ottico per misurare locomozione nematode in tre dimensioni che non richiede un microscopio e ci permetterà di iniziare ad esplorare la complessità di locomozione nematode in co diversonditions.

Protocollo

1. C. Preparazione elegans per l'analisi video

1. Spostare 10-20 nematodi adulti gravide a nuove NGM agar pieni di piastre di Petri con un sottile, appiattito scelta filo di platino. I piatti Petri riempite con l'agar NGM contengono una piccola macchia circolare di E. coli (un ceppo crescita limitata, OP50, dà i migliori risultati) per i nematodi da mangiare. Lasciare i nematodi a deporre le uova per 3-5 ore e quindi rimuovere gli adulti, stabilendo così un piccolo, cultura evolutivamente sincronizzata di 50-150 nematodi. Lasciare i nematodi a crescere alla prima età adulta incubando le piastre Petri a 20 ° C per 4-5 giorni. Questi metodi di coltura sono basati su procedure stabilite Stiernagle (2006) ^5.
2. Il giorno della video analisi, lavare un piatto di nematodi giovani adulti con 1 ml di acqua deionizzata, acqua distillata, quindi raccogliendo 50-150 vermi dalla cultura sincronizzato. Una soluzione tampone PBS come M9 o può anche essere usato. Utilizzare una microcentrifuga per far girare il wORM al fondo del tubo, o perché possano stabilirsi per gravità per circa 15 min. Rimuovere la maggior parte dell'acqua dal tubo e sostituirlo con 1 ml di acqua deionizzata, acqua distillata per lavare i batteri aderenti ai nematodi.
3. Trasferire nematodi in acqua o tampone in una cuvetta di quarzo con una micropipetta. È importante lavorare con un numero piccolo, circa 5-10 nematodi in totale in una sola volta o anche meno in modo che un nematode alla volta può essere illuminata dal laser. Se il numero di nematodi sulle piastre di coltura è troppo grande, diluire i vermi in acqua o tampone fino a densità desiderata. È anche possibile scegliere nematodi singoli una goccia d'acqua o tampone su una piastra di agar fresco per lavarli e trasferire vermi individuali nella cuvetta. Nel nostro studio, abbiamo utilizzato 1 mm, 2 mm e 5 formati cuvette mm per esaminare gli effetti dei vincoli fisici a nuotare comportamento.

2. Configurazione ottica per l'analisi dell Videos

1. Eseguire l'installazione come indicato nella figura 1 con una 543 nm (verde) elio-neon (HeNe) laser, due front-superficie specchi in alluminio, un supporto cuvetta, uno schermo di proiezione, e una telecamera ad alta velocità (High Speed ​​Exilim Casio) in grado di riprese a ~ 240 fps. I due specchi sono utilizzati per dirigere il fascio laser attraverso la cuvetta. Di dimensioni diverse cuvette può essere utilizzato a seconda della natura dello studio. A titolo di esempio, abbiamo usato le cuvette spessore di 5 mm per mostrare gli effetti dei vincoli spaziali sulle frequenze di nuoto. Il raggio laser deve soddisfare i requisiti di sovracampionamento,. Cioè, l'organismo deve ostruire non più di un terzo del raggio laser. Per C. elegans, il laser deve essere di circa 2 mm di diametro quando interagisce con un nematode. Il raggio laser non dovrebbe essere maggiore di 5 mm di diametro in quanto il modello di diffrazione sarà difficile da individuare. La distanza dal microrganismo diffrazione alla schermata dovrebbe essere molto più grandel'organismo stesso.
2. Parafilm posto sopra la parte superiore della cuvetta e capovolgere per miscelare i nematodi nella colonna d'acqua. Posizionare la cuvetta in un porta cuvette in modo che i vermi sono inizialmente vicino alla parte superiore della cuvetta. Utilizzando gli specchi, dirigere il raggio laser attraverso il centro della cuvetta. Poiché i nematodi sono più pesanti dell'acqua, essi lentamente cadono sul fondo della vaschetta, mentre allo stesso tempo nuotando nella colonna d'acqua.
3. Sulla proiezione schermo, colore posto corrispondente al fascio laser trasmesso nero per ridurre la dispersione del fascio trasmesso incontra lo schermo di proiezione (Figura 2). Alternativamente mettere un'apertura nello schermo di proiezione per consentire al fascio trasmesso a passare attraverso lo schermo. Eliminando o riducendo dispersione dal fascio trasmesso manterrà la matrice CCD della telecamera dalla saturazione dovuta al fascio trasmesso.
4. Per catturare una misura delle dimensioni del modello di diffrazione, tracciare una linea dicirca 5 cm sullo schermo di proiezione vicino al punto del fascio laser trasmesso senza interferire con l'immagine luce diffratta.
5. Avviare la registrazione con la fotocamera, mentre la luce della stanza è accesa in modo che la linea a 5 cm è lo stesso filmato su come le immagini di diffrazione. Spegnere il luce della stanza. Diffrazione registrare le immagini sullo schermo con la macchina fotografica come vermi passano attraverso il raggio laser.

3. Video Preparazione dei dati

1. Installare il programma di analisi video (Logger Pro: http://www.vernier.com/products/software/lp/ ) sul computer. Importare il video nel programma di analisi video
2. Impostare l'origine a coincidere con il punto laser trasmesso. Imposta la scala utilizzando i 5 cm linea sullo schermo di proiezione.
3. Monitorare lo spostamento angolare dell'immagine diffrazione formata da ciascuna nematode utilizzando il software di analisi video (Figura 3)
4. Per trovare l'angolazionespostamento r prendendo la arctan (y / x), copiare e incollare i dati in un foglio di calcolo (Excel) e aggiungere 180 gradi o π per tutti gli angoli negativi per produrre un grafico continuo (Figure. 4).

4. Acquisizione dati in tempo reale per l'osservazione istantanea delle frequenze Nuoto

1. Utilizzando la stessa impostazione per l'analisi video, inserire un fotodiodo (DET10A da Thorlabs) con una piccola area (~ 1 mm ²⁾ fuori centro nella figura di diffrazione di fronte allo schermo di proiezione.
2. Collegare il fotodiodo per l'oscilloscopio digitale (PicoScope fatto da Pico Technology) che si collega al computer tramite porta USB. Osservare i modelli thrashing sullo schermo del computer.
3. Salva set di dati acquisiti in formato ASCII o di testo.

5. Analisi dei dati

1. Importare i dati acquisiti mediante video o il fotodiodo in un programma di analisi dei dati in grado di forme d'onda raccordo con chi quadrato minimizzazione. Il programma usato è di origine ( http://www.originlab.com/ ). Adattare una curva sinusoidale per determinare la frequenza thrashing (figure 4 e 5).
2. Frequenze nuoto media di vari campioni e di determinare la varianza. Per questo studio, i dati sono stati analizzati statisticamente utilizzando un singolo fattore ANOVA seguita dal test di Bonferroni comparazioni multiple. Un p-value <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

6. Modello Motivi di diffrazione utilizzando Mathematica come esempio

Nota: i modelli di diffrazione può essere modellato utilizzando molti strumenti diversi di calcolo. Questa procedura sarà diverso per i diversi strumenti di calcolo come Matlab, Excel, Origin, ecc

1. Crea immagine: Prendere le immagini di nematodi su un vetrino da microscopio utilizzando un microscopio tradizionale.
2. Binarizzare immagine: importare 'Worm' l'immagine di vite senza fine into Mathematica trascinando l'immagine in Mathematica. Convertire l'immagine in un'immagine in bianco e nero (binarizzare). Ciò può essere ottenuto con il comando 'binarizzare' in Mathematica: BlackandWhiteImage = binarizzare [Worm]. L'immagine può quindi essere vista come una immagine in bianco e nero.
   In alternativa, utilizzare il comando 'EdgeDetect' per creare un BlackandWhiteImage: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], dove i due numeri finali controllare la grossolanità dei bordi che ne derivano.
3. Convertire un'immagine in una matrice di zeri e di uno: Ciò può essere ottenuto con il comando 'ImageData' in Mathematica: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage].
4. Trasformata di Fourier matrice: Utilizzare il 'Fourier' comando in Mathematica per trasformata di Fourier della matrice utilizzando le FourierParameters indicati: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -> {0, -2}].
5. Modulo quadrato della matrice per ottenere la matrice di diffrazione e di migliorare il contrasto dell'immagine: Square l'assolutovalore della matrice e visualizzare l'immagine risultante, che è la figura di diffrazione corrispondente all'immagine originale. Inoltre, utilizzare la funzione 'Log' per scalare il contrasto dell'immagine: ImageContrast = Immagine [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5].
6. Ridimensiona immagine per una facile visualizzazione: Ritaglia il modello centrale di diffrazione e ridimensionare a piacere: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500].
7. Confronta i pattern di diffrazione modellati con figure di diffrazione ottenuti da vermi liberamente nuoto. (Figura 6)

Risultati

Come esempio, abbiamo studiato C. elegans in una cuvetta di quarzo larghe 1 cm, 5 mm di spessore e 4 cm di altezza cuvette. Campionare un verme singolo utilizzando analisi video, la frequenza media di nuoto ottenuto dall'analisi video in una cuvetta di 5 mm di spessore è di circa 2,5 Hz (Figura 4). Analogamente, il campionamento di un verme unico usando il reale tempo di acquisizione dati metodo, si ottiene una frequenza di circa 2,7 nuoto Hz (Figura 5), utilizzando l'oscilloscopio digitale (PicoScope). Questa procedura può essere ripetuta per molti vermi. Uno studio dettagliato di vermi liberamente nuoto rivelato una frequenza media di 2,37 Hz nuoto in una cuvetta 5 mm. ⁶ Come previsto, la frequenza nuoto è superiore a quella di un verme strisciare (~ 0,8 Hz). ³ Usando questo metodo di diffrazione, la nuoto frequenze medie di una C. elegans, che si limita a un vetrino da microscopio, è stato trovato in modo che corrisponda al valore precedentemente pubblicato di 2 Hz.. ^1,7

ve_content "> 3 procedure seguenti.) e poi a 6.) consente la modellazione di nuoto modelli di diffrazione con l'aiuto di immagini verme ottenute con un microscopio convenzionale. I pattern di diffrazione modellate sono utilizzati per simulare un ciclo nuotata del C. elegans ( Figura 6). Modello efficace consiste fisicamente realizzabili modelli nuotata successive corrispondenti frequenze nuoto. Il verme dovrebbe essere nella stessa forma al termine di un ciclo di nuotata poiché era all'inizio di un ciclo nuotata.

Figura 1. Un verde HeNe laser è stato usato per creare un modello di diffrazione dinamica utilizzando vivo C. elegans. Questo pattern di diffrazione è stato girato a 240 fps.

Figura 2. Dra ala un punto nero aumenta l'assorbimento del fascio trasmesso. Saturazione della telecamera per la luce diffusa viene ridotta e il modello di diffrazione diventa visibile.

Figura 3. Schermata del software di analisi video (Logger Pro) con un pattern di diffrazione worm che viene monitorata. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4. Dati video corrispondente al ciclo di nuotata nematodi in una cuvetta di 5 mm. La curva rivela una frequenza nuoto di ~ 2,5 Hz.

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Figura 5. Dati in tempo reale corrispondente al ciclo di nuotata di un nematodi in una cuvetta di 5 mm. La curva rivela una frequenza nuoto di ~ 2,7 Hz.

Figura 6. La riga superiore rappresenta le figure di diffrazione reali e corrisponde ai modelli di diffrazione modellate nella riga in basso. I pattern di diffrazione modellati sono stati prodotti utilizzando i vermi su un vetrino da microscopio (riga centrale).

Discussione

Abbiamo sviluppato un nuovo approccio per la misurazione in tempo reale di movimento e semplici comportamenti locomotore in organismi microscopici come i nematodi, che non richiedono l'uso di microscopi. ⁸ Questo approccio metodologico potrebbe essere utilizzato anche per lo studio di numerosi organismi microscopici come i protisti. Questo metodo è limitato solo dalla lunghezza d'onda della luce utilizzata. L'organismo non deve essere inferiore alla lunghezza d'onda della luce. Oltre al risparmio di costi e portabilità del dispositivo necessario, uno dei principali vantaggi di questo approccio è la capacità di misurare il comportamento in tempo reale e in tre dimensioni, senza i vincoli stretti di piani di immagini al microscopio. È anche possibile con questa tecnica per esaminare influenze di forze gravitazionali o numerose altre condizioni sul comportamento che non possono essere studiati utilizzando microscopio approcci. ⁹ Così, si può ottenere una migliore comprensione del microrganismo naturale locomotoria Behaviors liberati dai confini della goccioline vetrino da microscopio o specializzati camere microfluidici (Park et al, 2008). ¹⁰

La mancanza di informazioni di fase in un modello di diffrazione non consente il recupero diretto dell'immagine corrispondente all'oggetto diffrazione poiché il campo lontano modello di diffrazione è proporzionale al quadrato del valore assoluto della trasformata di Fourier. Siamo quindi calcolando diffrazione da verme immagini in modo che possano essere confrontati con i modelli di diffrazione di nematodi liberamente nuoto (Figura 6).

Questo metodo ha prodotto risultati per davvero nuotare liberamente C. elegans e può essere applicato a qualsiasi specie microscopiche che manovre in un ambiente otticamente trasparente come acqua o diverse soluzioni ioniche. Microscopi convenzionali consentono solo studi con una profondità focale dell'ordine di micrometri. ¹¹ Questo è dovuto alla limitataprofondità di campo per mettere a fuoco la luce:

dove il numero f N ha un rapporto reciproco con il cerchio di confusione (c) in modo che una breve lunghezza focale è associata ad un grande c. ^12,13 Mentre questo metodo di diffrazione non è certamente un sostituto per microscopia convenzionale, è in grado per fornire risultati quantitativi rapidamente, in modo che le specie possono anche essere manipolati in tempo reale a basso costo. I pattern di diffrazione può essere ottenuta con qualsiasi puntatore laser. I pattern di diffrazione può essere filmato con una risoluzione temporale ridotta utilizzando una normale fotocamera digitale. Mentre l'utente non può avere un microscopio o un fotodiodo prontamente disponibile, le parti principali di questo esperimento come misurare frequenze thrashing e valutare modelli di diffrazione può essere completata a costi estremamente bassi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
543 nm Laser HeNe	Melles Griot	LGX1	Qualsiasi laser nel visibile con meno di 5 mW può essere utilizzato.
2 superficie frontale in alluminio Specchi	Thorlabs	PF10-03-F01
Macchina fotografica ad alta velocità Exilim	Casio
Quarzo Cuvette	Starna Cells	21/G/5
LoggerPro (Software)	Verniero		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Wolfram		http://www.wolfram.com/