In Vivo Imaging Systems (IVIS) il rilevamento di un neuro-invasiva Virus encephalitic

Allison Poussard; Michael Patterson; Katherine Taylor; Alexey Seregin; Jeanon Smith; Jennifer Smith; Milagros Salazar; Slobodan Paessler

doi:10.3791/4429

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Method Article

In Vivo Imaging Systems (IVIS) il rilevamento di un neuro-invasiva Virus encephalitic

DOI:

10.3791/4429

⸱

December 2nd, 2012

Allison Poussard*¹, Michael Patterson*¹, Katherine Taylor¹, Alexey Seregin¹, Jeanon Smith¹, Jennifer Smith¹, Milagros Salazar¹, Slobodan Paessler¹

¹Experimental Pathology, University of Texas Medical Branch

* Questi autori hanno contribuito in egual misura

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Riepilogo

Utilizzando luciferasi e sistemi di imaging in vivo (IVIS) come un nuovo mezzo per identificare terminazioni malattia prima sviluppi clinici verificarsi. IVIS ci ha permesso di visualizzare in tempo reale l'invasione di virus encefalitiche più giorni, fornendo un modello di malattia più accurato per lo studio futuro. E ci ha anche permesso di identificare le caratteristiche potenziali di protezione di antivirali e vaccini più veloce rispetto ai modelli animali attualmente utilizzati. La capacità di utilizzare singoli animali più intervalli di tempo multipli assicura condizioni di polizia, i costi ridotti, e morbilità generale per gli animali utilizzati garantire un mezzo più umane e più scientifico di studio della malattia.

Abstract

Progressi moderni in tecnologia di imaging incoraggiare l'ulteriore sviluppo e perfezionamento nel modo in cui si compie la ricerca virale. Inizialmente proposto da Russel e Burch nel 3R Hume (sostituzione, riduzione, perfezionamento), l'utilizzo di modelli animali nella ricerca scientifica è costantemente sotto pressione per individuare nuove metodologie per ridurre l'uso degli animali, migliorando la precisione scientifica e velocità. Una sfida importante per principi di Hume tuttavia, è come garantire gli studi sono statisticamente accurate, riducendo la morbilità della malattia degli animali e numeri complessivi. Studi di efficacia vaccino attualmente richiedono un gran numero di animali per essere considerato statisticamente significativo e spesso comportano elevata morbilità e mortalità endpoint per l'identificazione di protezione immunitaria. Abbiamo utilizzato in vivo imaging sistemi (IVIS) in combinazione con un enzima bioluminescente lucciola per monitorare progressivamente l'invasione del sistema nervoso centrale (CNS) da un mentophalitic virus in un modello murino. Tipicamente, la malattia progredisce in modo relativamente lento, tuttavia replicazione del virus è rapido, soprattutto nel SNC, e può portare ad un spesso, esito letale. A seguito di infezione intranasale dei topi con TC83-Luc, un ceppo attenuato equina venezuelana, virus dell'encefalite modificate per esprimere un gene di luciferasi, siamo in grado di visualizzare la replicazione del virus all'interno del cervello, almeno tre giorni prima della comparsa dei sintomi clinici di malattia. Utilizzando invasione del SNC come endpoint chiave encephalitic sviluppo della malattia, siamo in grado di identificare rapidamente terapeutico e protezione del vaccino contro TC83-Luc infezione prima che i sintomi clinici si sviluppano. Con la tecnologia IVIS siamo in grado di dimostrare il test rapido e preciso di terapie farmacologiche e di vaccini, riducendo il numero degli animali e la morbilità.

Protocollo

1. Preparazione degli animali

Animal arrivo: All'arrivo al livello animale biosicurezza 2 (ABSL2) servizi, consentire che gli animali un minimo di 2 giorni per acclimatarsi al nuovo ambiente. Dopo questo periodo di riposo, al controllo degli animali per valutare la loro salute e in generale l'aspetto fisico.
1. Quando si utilizza reporter fluorescenti è importante mettere tutti i soggetti animali su una dieta di erba medica libero di limitare la quantità di autofluorescenza GI e segnale di fondo.
Shave animali: Per migliorare il segnale bioluminescente rilevato dal cranio durante l'esposizione; radere le teste di tutti gli animali. Anestetizzare gli animali con una miscela di ossigeno e gas vaporizzato isoflurano. Una volta che gli animali sono completamente anestetizzati, utilizzare tagliatori elettrici a radersi la testa. Una volta finito con rasatura, riportare gli animali nelle loro gabbie e osservare per un completo recupero dagli effetti dell'anestesia.
Bio Medic datiSystems (BMDS) inserimento transponder (che si terrà dopo la rasatura dei topi, mentre gli animali sono completamente anestetizzati): Per un mezzo meno invasivo per monitorare la temperatura di un impianto pre-programmato BMDS transponder wireless per via sottocutanea nella regione dorsale di ogni topo. Questi transponder permettere di identificare wireless e registrazione della temperatura. Dopo l'impianto del transponder, applicare un veterinario qualità del tessuto adesivo alla ferita.
Collezione di base: prima infezione, registrare una temperatura basale e il peso per tutti gli animali. Prelevare il sangue per la riduzione della placca prova di neutralizzazione (PRNT) analisi attraverso retro-orbitali (RO) spurgo, mentre i topi sono sotto anestesia. Dopo il prelievo del sangue, applicare pomata antibiotica veterinaria occhio per ridurre il potenziale infezione batterica secondaria. Questa raccolta di base deve essere completato con considerazione il numero di volte che gli animali sono sottoposti in anestesia da stress sui topi. Future collezioni RO should essere completato dopo l'imaging, mentre il mouse è ancora sotto anestesia. Il sangue raccolto da un massimo RO dovrebbe essere di circa 200 pl.
Infezione: topi posto sotto anestesia come descritto in precedenza. Inoculare per via intranasale utilizzando una dose di 5x10 ⁶ a 5x10 ⁷ pfu TC83-luciferasi in un volume totale di 40 microlitri diluito soluzione tampone fosfato (PBS) attraverso infezione intranasale. A seguito di infezione, posizionare i topi all'interno della loro gabbia di alloggiamento e osservare il recupero.

2. Animal Imaging

Disclaimer: Mantenere topi all'interno della loro unità abitativa, l'armadio biosicurezza (BSC), o la scatola di contenimento XIC in ogni momento. Le BSC approvati per questo protocollo sono una classe di tipo II B1 o B2.

Iniettare tutti gli animali con 10 ml per grammo di peso corporeo di intraperitoneale (IP) luciferina ad una concentrazione di 15 mg / ml.
1. I topi trattati con Ampligen devono essere injecteIP d alla dose di 12,5 mg / kg di peso corporeo al messaggio infezione -4 ore o 48 ore dopo l'infezione in base al loro gruppo.
Prima dell'iniezione con luciferina, separare i topi in gruppi di tre per garantire un posizionamento adeguato all'interno del XIC-3 scatola di contenimento.
1. Per tutte imaging, utilizzano unguento oculare / lubrificante per impedire l'essiccazione della cornea durante tutta la procedura.
Aprire il software LivingImage e premere Inizializza per preparare la casella di imaging, auto risparmio di serie, tempo di esposizione di auto (tempo di esposizione su auto è una nuova funzione del software LivingImage 3.2 e successivi), vedi campo C, e filtro per aprire; campo di vista si basa sul numero di topi sei imaging; e il filtro può essere ottimizzato come necessario per progetti imaging.
Verificare che i filtri dell'aria a carbone non è scaduto, il serbatoio è pieno di ossigeno, e il serbatoio viene riempito isoflurano. Mettere piccole strisce di nastro isolante nel XIC-3 icasella di consolazione che aiuta a ridurre il movimento degli animali durante l'esposizione.
Iniettare i topi con IP luciferina come descritto nella sezione 2.1 e posto all'interno della camera di induzione isoflurano (con coperchio aperto) per 3-5 min.
Dopo 5 min, chiudere il coperchio della camera di induzione e avviare il flusso di isoflurano. L'anestetico viene utilizzata a circa 3-5% del valore di frequenza di flusso di ossigeno di circa 2,0 L / min. Una volta completamente inconscio attendere un ulteriore 30 sec e trasferire i topi al XIC-3 box di isolamento. Assicurarsi che l'armadio biosicurezza stati utilizzati consente per la sicurezza evacuazione di isoflurano poiché tale procedura comporterà la perdita di isoflurano dalla camera di induzione (l'unità IVIS contiene i propri contenitori passivi Fiera e la XIC-3 scatola di contenimento si collega direttamente alla in / out prese garantire contenute flusso anestetico).
1. Trasferire i topi basate su chip / numero del gruppo nel XIC-3 box di isolamento con il connettore isoflurano allegato und aprire. Posizionare i topi in modo che sono previste in decubito sternale con la testa delicatamente appoggiate sulle strisce di nastro.
Pulire la scatola XIC contenimento con etanolo, le mani a spruzzo e il fondo del XIC-3 con CaviCide, e trasferire alla camera IVIS imaging. Ricollegare l'anestesia alla scatola di contenimento, una volta dentro l'unità di riproduzione.
Dopo 10 minuti dopo l'iniezione di luciferina, l'immagine dei topi attraverso il software di immagine vivente.
A seguito di imaging iniziale con un filtro aperto, avviare una DLIT 3-Dimensional immagini utilizzando l'analisi di sequenza guidata di installazione Immagine per bioluminescente luciferasi lucciola. Questo processo di imaging avrà min 4-5 e deve essere eseguita da un campo di vista rilevante per il numero di topi desiderati.
1. Ex-vivo analisi è possibile necroscopia seguente e raccolta del cervello. Mettere il cervello su una piastra di Petri sterile, gocciolamento 50-100 ml di magazzino luciferina sulla parte superiore, e il luogo all'interno del imaging box.
Finalizzare una seconda immagine aperta filtro a 15-17 minuti dopo l'infezione al termine di imaging DLIT. Assicurarsi che l'analisi di sequenza è spento e il campo di vista e impostazioni del filtro Vengono ripristinati i valori precedenti.

3. I topi di ritorno e analisi dei dati

Spegnere il vaporizzatore isoflurano e trasferire il recipiente di contenimento XIC torna al mobile biosicurezza.
Mettere i topi indietro all'interno della loro unità abitativa, chiudere il coperchio superiore, spruzzare l'esterno con un disinfettante appropriato e rimetterlo sul rack custodia.
1. Assicurarsi che i topi hanno pienamente recuperato dall'anestesia.
Ripetere la procedura di cui sopra come l'esperimento è necessario fino a quando l'imaging è stata completata.
Disinfettare il BSC, spegnere l'apparecchio e trasferire tutti i dati in una posizione laboratorio esterno per ulteriori analisi.
Analizzare i dati e generare 3 immagini tridimensionali basate su IVIS risultati utinalizzare il software LivingImage.
1. Assicurarsi che l'immagine sia orientato correttamente e illuminazione / bilanciamento del colore è impostato. All'interno della tavolozza degli strumenti le opzioni includono Regolazione immagine, correzioni, informazioni sull'immagine, e Strumenti ROI.
2. Utilizzare forme ROI per identificare i punti di forza del segnale specifici basati su posizione.
3. Ricostruire la topografia della superficie per evidenziare il corpo del mouse, inizializzare ricostruzione 3D DLIT, e utilizzare in forma lineare per impostare la mappa organo alla ricostruzione topografica.
Ulteriori analisi titolazione virale può essere completato attraverso la raccolta di sangue e di organi. Titolazione in questo studio è stato completato attraverso l'omogeneizzazione del tessuto cerebrale nella modificato aquile medio (MEM). L'omogenato è stato diluito serialmente e abbiamo infettato una piastra ben 6 di cellule Vero per 1 ora. Le cellule sono state coperte con una sovrapposizione agarose/2xMEM 1,5% ed incubate per 2 giorni a 37 gradi. Cellule sono state fissate con formalina al 10% per 30 minuti e trattata concristallo viola.