Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Riepilogo

Qui sviluppiamo gli strumenti necessari per Ex vivo L'imaging dal vivo di tracciare divisioni cellulari singoli nel topo E8.5 neuroepitelio

Abstract

Abbiamo sviluppato un sistema che integra l'imaging dal vivo di marcatori fluorescenti e fette di coltura embrionale neuroepithelium mouse. Abbiamo approfittato di linee del mouse esistenti per la cellula genetica lineage tracing: una linea di Cre tamoxifene-inducibile e una linea giornalista Cre esprimendo DsRed su ricombinazione Cre-mediata. Utilizzando un livello relativamente basso di tamoxifene, siamo stati in grado di indurre ricombinazione in un piccolo numero di cellule, permettendo di seguire divisioni cellulari individuali. Inoltre, abbiamo osservato la risposta trascrizionale di Sonic hedgehog (Shh) di segnalazione utilizzando un Olig2-eGFP transgenico linea ^1-3 e abbiamo monitorato formazione di ciglia infettando la fetta colta con virus che esprime il marcatore di ciglia, SSTR3-GFP ^4. Per l'immagine del neuroepitelio, abbiamo raccolto gli embrioni a E8.5, isolato il tubo neurale, montata la fetta neurale in appropriate condizioni di coltura nella camera di imaging e di eseguita time-lapse imaging confocale. Il nostro exmetodo di imaging in vivo in diretta consente di tracciare divisioni cellulari singoli di valutare la relativa tempistica di formazione ciglia primarie e risposta Shh in modo fisiologicamente rilevanti. Questo metodo può essere facilmente adattato utilizzando marcatori fluorescenti distinti e fornisce il campo gli strumenti con cui monitorare il comportamento delle cellule in situ ed in tempo reale.

Protocollo

Topi adulti sono sacrificati per dislocazione cervicale meccanico. Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal IACUC e del Comitato Biosicurezza alla Emory University.

1. Generazione Embryo

1. Croce tamoxifene-inducibile Cre linea, CAGGCreER, e la linea giornalista dsRedCre (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figura 1) ^5,6. Per monitorare la relativa tempistica di risposta Shh nelle cellule figlie, croce CAGGCreER e DsRed linea con il Olig2-eGFP BAC topi transgenici (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Figura 1) ^7,8.
2. Sciogliere tamoxifene in 100% di etanolo, ed eseguire l'iniezione intraperitoneale di 2,5 mg di tamoxifene per 40 g di peso corporeo nelle femmine gravide a 6,5 ​​embrionale (E6.5) per indurre l'espressione Cre ed etichettatura DsRed in un piccolo sottogruppo di cellule.
3. 48 ore più tardi sezionare embrioni, identificare gli embrioni positivi DsRed utilizzando il microscopio a fluorescenza, trasferirli al piatto cultura e osservatoriposta divisioni cellulari singoli durante ex vivo imaging (vedi sotto).

2. Tutta mouse Embrione Cultura

1. Sezionare embrioni E8.5 nel medio lavaggio preriscaldata contenente DMEM/F12 (1:1) supplementato con 10% di siero di vitello neonato e 1% di penicillina / streptomicina (P / S) ^9.
2. Direttamente dopo la dissezione, posto embrioni sulla ° C fase di riscaldamento 37 al microscopio a fluorescenza e di identificare come GFP e / o DsRed positivo (vedi sotto).
3. Trasferire fino a 2 embrioni in 500 microlitri goccia di terreni di coltura pre-equilibrata contenente 50% siero di ratto da un maschio Sprague-Dawley e il 50% DMEM/F12 (1:1) senza rosso fenolo integrato con L-glutammina e 1% di 1 M HEPES in NaCl 0,85% e P / S ^9.
4. Applicare uno strato sottile (0.1 cm) di olio minerale leggero equilibrata nel medio per evitare l'evaporazione e trasferire il piatto di coltura contenente gli embrioni ai 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.

3.Infezione virale

1. Al fine di etichetta cilia nel neuroepitelio, aggiungere 5-10 ml di SSTR3-GFP lentivirus, circa 2 milioni di virioni, ad un 500 microlitri goccia equilibrata di terreno di coltura contenente un embrione E8.5.
2. Dopo 18 ore di coltura, il trasferimento di embrioni infetti in diverse gocce di mezzo di lavaggio per lavare il virus e preparare fetta del tubo neurale.

4. Del tubo neurale Slice Preparazione per Live Imaging

1. Sezionare tubo neurale del E8.5 embrione in media lavaggio pre-riscaldato utilizzando un formato micro-coltello 0,025 millimetri, su un piatto rivestito di agar 1%.
2. Posizionare il tubo laterale isolato neurale ventrale giù in una goccia 150 ml di terreno di coltura equilibrato senza rosso fenolo sulla mm rivestito di vetro piatto fondo di poli-L-lisina 35.
3. Mettere una piccola quantità di una miscela 1:1 realizzato da gelatina pura al 100% di petrolio e cera fusa (candela da IKEA) attorno al tubo neurale montato, e premere delicatamente da una stretta lingua di coprioggetto di vetro, al fine diimmobilizzare il campione.
4. Coprire il piatto con un sottile strato (~ 0,1 centimetri) di olio minerale leggero equilibrata (Figura 2).

5. Vivere Imaging e Time-lapse Microscopia confocale

1. Luogo piatto sotto la Nikon A1R confocale microscopio invertito dotato di una camera climatica che regola la temperatura, impostata a 37 ° C, e il 5% di CO _2.
2. Utilizzare 60x obiettivo ad immersione in olio a registrare GFP ciglia etichettati e cellule positive DsRed, mentre l'uso obiettivo ad immersione in olio 40x per monitorare Olig2-GFP e cellule positive DsRed.
3. Aprire il software NIS Elements per creare le condizioni di imaging lasso di tempo. Ogni 10 min acquisire z-stack fino a 25 micron con una spaziatura di 1,5 micron (obiettivo 40x) e fino a 8 micron con una spaziatura di 0,4 micron (60x obiettivo). Usare 488 e 561 nm, la lunghezza d'onda di eccitazione e di canali trasmessi, se necessario. Acquisire immagini in formato 512 x 512. Impostare più regioni definite dall'utente di interest per eseguire la registrazione simultanea.
   Ottima esposizione al potere del laser e la luminosità dell'immagine è stata regolata mediante l'uso del laser a bassa intensità (fino al 11% per mCherry 561 e fino al 4,5% EGFP 405/488), velocità di scansione 1, media linea 2 e la dimensione del foro del perno (61 micron per DsRed; 28,1 micron per Olig2; 72 micron per SSTR3GFP; 61,3 micron per DsRed e SSTR3GFP; 58 micron per DsRed e Olig2). L'uso di giornalisti fluorescenti geneticamente codificati ci ha permesso di rilevare la luminosità con basso potere del laser.
4. Analizzare i dati registrati utilizzando Imaris software di ricostruzione 3D.

6. Immunofluorescenza

1. Fissare gli embrioni o tubi neurali isolate in paraformaldeide al 4% / 0,1 M tampone fosfato sul ghiaccio (4 ° C) per 1 ora in un piatto di vetro.
2. Lavare i campioni 2 ore in PBS su ghiaccio (4 ° C) (cambiamento PBS un paio di volte) e mettere nel 30% di saccarosio / 0,1 M tampone fosfato durante la notte o fino a quando gli embrioni lavandino.
3. Incorpora in ottobre, congelare in ghiaccio secco e conservare in -80 ° C. Peffettuare la giusta sezionamento sul criostato (10 mm).
4. Lavare i vetrini per 10 min in soluzione di lavaggio contenente siero ovino inattivato al calore 1% e 0,1% Triton X-100 in PBS.
5. Diluire gli anticorpi primari in soluzione di lavaggio a seguito di concentrazioni: Rat monoclonale anti-RFP (5F8,) 1:200; coniglio anti-ARL13B siero 1:1500 e topo monoclonale anti-ARL13B 01:05 (295B/54); coniglio anti-Olig2 1:300; monoclonali mouse Pax6, Shh e Nkx2.2-all 1:10; ed policlonale di coniglio Ki67 1:500. Aggiungere circa 150 ml per diapositiva nel piatto camera umidificata, coprire con parafilm per evitare la disidratazione e lasciare tutta la notte a 4 ° C.
6. Lavare i vetrini nella soluzione di lavaggio per tre volte, ogni volta 20 min a temperatura ambiente.
7. Diluire gli anticorpi secondari Alexa Fluor 488, 568, 350 nelle soluzioni di lavaggio a 1:200 concentrazione. Utilizzare Hoechst 1:3000 o TO-PRO-3 1:500 a macchia nuclei. Aggiungere 150 microlitri per vetrino, lasciare 1 ora a temperatura ambiente in camera umidificata al riparo dalla luce.
8. Lavare i vetrini nella soluzione di lavaggio two volte, ogni volta 30 min a temperatura ambiente.
9. Monte scivola nel 80% Prolungare Oro reagente anti-sbiadimento e la vista entro 24 ore.

Risultati

Qui abbiamo effettuato ex vivo imaging dal vivo di divisioni cellulari singoli all'interno del E8.5 del mouse neuroepitelio. Per etichettare singole celle, abbiamo indotto ricombinasi Cre in un sottogruppo di cellule contenenti una linea giornalista Cre che esprimevano DsRed upon ricombinazione ^5,6 (Figura 3A). Così, 48 ore dopo siamo stati in grado di osservare le divisioni cellulari singoli durante ex vivo imaging (Figure 4A-D). Allo stesso tempo, abb...

Discussione

Il nostro sistema ex vivo permette di osservare direttamente divisioni cellulari singoli all'interno del neuroepitelio in tempo reale via di sviluppo. Come esempio abbiamo esaminato divisioni cellulari entro il mouse embrionale tubo neurale e vigilato o formazione ciglio o risposta Shh. Abbiamo confermato i nostri risultati di imaging (n = 24) erano coerenti con i risultati di sezioni fisse (n = 178) che indicano la nostra tecnica fornisce dati fisiologicamente rilevanti.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J	Jackson Laboratory	005438
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd	MMRRC,	010555-UCD
CAGGCreER	Jackson Laboratory	003724
Tamoxifen	Sigma	T5648
DMEM/F12 (1:1)	GIBCO	21041-025
Newborn calf serum	Lonza	14-416F
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Rat Serum SD male	Harlan Bioproducts	4520
1M Hepes	BioWhittaker	17-737E
L-Glutamine	GIBCO	21041-025
Light mineral oil	Sigma	M8410
Sstr3-GFP lentivirus	Emory Viral Core
Micro-knife, size 0.025 mm	Electron Microscopy Sciences	62091
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish	MatTek	P35GC-0-10-C
100% Petroleum Jelly	Kroger	FL9958c
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope	Nikon
NIS Elements software	Nikon
Imaris 3D software	Bitplane AG	Imaris 7.2.3
OCT	Tissue-Tek	4583
Cryostat	Leica	CM1850
Heat-inactivated sheep serum	Invitrogen	16210-072
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Parafolmaldehyde	Sigma	P6148
Phosphate Buffer	Lab made
Rat monoclonal anti-RFP (5F8)	Chromotek	110411
Rabbit anti-Arl13b serum	NeuroMab
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5	NeuroMab
Rabbit anti-Olig2	Chemicon	AB9610
Mouse monoclonals Pax6	Developmental Hybridoma Bank	Pax6
Mouse monoclonalsShh	Developmental Hybridoma Bank	5E1
Mouse monoclonals Nkx2.2	Developmental Hybridoma Bank	74.5A5
Rabbit polyclonal Ki67	Abcam	AB15580
Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029
Alexa Fluor 568	Molecular Probes	A11031
Alexa Fluor 350	Molecular Probes	A11046
H–chst	Fisher	AC22989
TO-PRO-3	Invitrogen	T3605
ProLong Gold anti-fade reagent	Invitrogen	P36934