Controllata cervicale lesioni lacerazione nei topi

Riepilogo

Una nuova tecnica per creare una riproducibile In vivo Modello di lesione lacerazione del midollo spinale cervicale nel topo è descritto. Questa tecnica si basa sulla stabilizzazione colonna vertebrale fissaggio delle faccette cervicali e lacerazione del midollo spinale utilizzando una lama oscillante con una precisione di ± 0,01 mm.

Abstract

Uso di topi geneticamente modificati, migliora la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base di molti disturbi neurologici come una lesione del midollo spinale (SCI). Controllo manuale mano libera utilizzato per produrre un modello di lacerazione SCI crea lesioni incoerenti spesso associati a un componente di schiacciamento o contusione e, quindi, una nuova tecnica è stata sviluppata. Il nostro modello di lacerazione cervicale SCI ha risolto le difficoltà inerenti con il metodo a mano libera, incorporando 1) cervicale stabilizzazione vertebrale del fissazione vertebrale sfaccettatura, 2) l'esposizione maggiore del midollo spinale, e 3) la creazione di una lacerazione riproducibile del midollo spinale con una lama oscillante con una precisione di ± 0,01 mm di profondità senza contusione associata. Rispetto ai metodi standard di creazione di una lacerazione SCI come l'uso a mano libera di un bisturi o forbici, il nostro metodo ha prodotto una lesione coerente. Questo metodo è utile per studi sulla rigenerazione assonale di corticospinale, rubrospinal e dorsali tratti ascendenti.

Introduzione

La disponibilità di topi geneticamente modificati è un potente strumento per identificare gli effetti dei geni specifici che svolgono un ruolo nei meccanismi di SCI. Lacerazione SCI è un importante modello utilizzato per esaminare gli agenti terapeutici o molecole che possono fornire un trattamento efficace a seguito di questo infortunio ^8. Fissazione dei processi spinosi durante la creazione della lesione lacerazione nei topi è impreciso a causa della difficoltà nel cogliere i processi spinosi sottili e fragili coinvolti con il mantenimento fissazione spinale ^5,11. Variabilità nella profondità della lacerazione di solo 0,2 mm (10% del diametro del midollo spinale topo) causa fuorviante interpretazione dei dati. La natura e l'estensione del midollo spinale lacerazione lesione devono essere definiti con precisione ^10. Per affrontare questa sfida, abbiamo sviluppato una nuova tecnica composta da stabilizzazione vertebrale e usato lame fabbricati collegati alla Louisville Injury Sistema Apparatus (LISA) per produrre una lacerazione SCI ^7,14. Questo pregiudizio è stato creato utilizzando una lama oscillante tagliente che evita la deformazione del tessuto durante il processo di lacerazione. La profondità della lacerazione è stato preciso con una precisione di 0,01 mm utilizzando micro-driver che controllano la profondità lacerazione. Lame di taglio sono su ordine alle forme e larghezze specifiche per creare la lacerazione desiderato contorno ^9. Dimostriamo 1) il metodo di esposizione colonna cervicale, 2) la tecnica di stabilizzazione vertebrale utilizzando un dispositivo di fissaggio bilaterale sfaccettatura, e 3) la creazione di una lesione lacerazione cervicale utilizzando una lama vibrante.

Protocollo

1. Preparazione degli animali e di applicazione dello stabilizzatore Spine

Il mouse rachide cervicale è concava ventralmente come si vede dalla vista laterale. I processi spinosi da C3 a T1 sono piccoli e friabili e, pertanto, non sono adatti per la stabilizzazione vertebrale come comunemente descritto ^3,4. Si consiglia di stabilizzazione della colonna vertebrale essere eseguita da fissazione faccetta laterale. Il dispositivo di fissaggio è costituito da una barra metallica a forma di U per sostenere il mouse e due bracci regolabili in acciaio inox che serrano a ciascuna sfaccettatura lateralmente. Questo fornisce un'eccellente immobilizzazione della vertebra bersaglio. Dopo la fissazione spinale, la colonna vertebrale è leggermente elevata per appiattire la colonna vertebrale cervicale curvatura per fornire una migliore esposizione del midollo spinale.

1. Sterilizzare i seguenti strumenti chirurgici: 2-3 paia di pinze, 2 paia di microscissors, un porta 30 ago G, sutura e ago, clip della pelle, e clip applicatore. Disinfettare lo stabilizzatore della colonna vertebrale. Anesthetize il mouse utilizzando un cocktail intraperitoneale di ketamina / xylazina (100 mg / 10 mg / kg). Radersi i capelli dal collo del mouse.
2. Dopo la pulizia della pelle con una soluzione di povidone-iodio e il 70% di alcol, spostare il mouse sul tavolo operatorio riscaldato con una piastra elettrica. Coprire gli occhi dell'animale con pomata oftalmica per evitare l'essiccazione della cornea.
3. Dopo induzione dell'anestesia (raggiunto quando il mouse non risponde a un pizzico di coda), fare una incisione cutanea mediana cervicale posteriore dall'occipite al grasso sottocutaneo-pad della colonna cervicale inferiore. Sotto ingrandimento, eseguire una incisione mediana tra i muscoli del trapezio in C2 e dividere i muscoli del capo semispinale. Identificazione del cuscinetto adiposo sottomuscolare facilita dissezione nello strato corretto.
4. Estendere la dissezione muscolare linea mediana caudalmente al processo spinoso T2 che serve come un punto di riferimento affidabile. Tagliare i muscoli attaccati alle vertebre T2 e rimuovere la porzione cartilaginea del T2processo spinoso.
5. Sezionare i muscoli paravertebrali dalla C2 attraverso le lamine T2 utilizzando una coppia di micro-forbici. Dissezione muscolare inizia adiacente ai processi spinosi e si estende bilateralmente alle faccette articolari. Separare i muscoli immediatamente adiacenti ai processi spinosi e lamine (nello strato periostale) per ridurre al minimo il sanguinamento. Dopo le sfaccettature laterali sono esposti, posizionare il mouse sul canale a forma di U della fase LISA.
6. Fissare i bracci in acciaio inox sotto le sfaccettature esposti bilateralmente. Una volta che le braccia sono in posizione, serrare le viti ad alette delle braccia di acciaio per immobilizzare la colonna vertebrale. Questo mantiene ferma la fissazione della vertebra di destinazione e fornisce ottima esposizione. I bracci possono essere regolati per fornire orientamento orizzontale precisa della colonna vertebrale.
7. Incidere il legamento giallo tra C5 e C6 per esporre alla base dura. Tra lo spazio interlaminare, usare un ago 30 G per creare un piccolo durotomia attraverso la quale sono posti a microscissorsestendere il durotomia. Il midollo spinale è ora pronto a subire la lacerazione lesione controllata.

2. La lacerazione del midollo spinale cervicale Uso del dispositivo LISA

1. La larghezza dell'allargamento midollo spinale cervicale varia a diversi livelli. Effettuare una lesione hemisection dorsale all'altezza C5-6 usando una lama piatta 2,3 mm, impostare l'ampiezza di vibrazione per coprire l'intera larghezza del midollo spinale. Le lame sono ottenuti da Belle Science Tools Inc. (Foster City, CA) e modificate per lacerazione del midollo spinale. Mantenere l'ampiezza dell'oscillazione lama ≥ 0,5 mm come bassi livelli di ampiezza diminuirà la facilità di lacerazione cavo.
2. Posizionare lo stabilizzatore della colonna vertebrale e il mouse sul palco LISA. La lama è attaccato al LISA con la sua posizione controllata dal micro-coni capaci di tre archi di movimento. Componenti del LISA e le loro funzioni sono descritte in Figura 1.
3. Accendere lo switch blade-vibrazione su. Sotto magnificazione, spostare il mouse in modo che il midollo spinale esposti sia posizionato direttamente sotto la lama vibrante.
4. Elevare la fase di supporto del mouse verso la lama oscillante. La posizione "0" viene registrata quando la lama tocca appena la vena dorsale del midollo spinale. Misurare la profondità della lacerazione del midollo spinale rispetto alla posizione "0".
5. Elevare la posizione di fase per il controllo micro-pilota: un giro di 360 ° della manopola micro-pilota eleva il palco da 0,25 mm. Così, una dorsale mm hemisection lesione 0,75 viene creato ruotando la manopola micro-pilota 3 volte. La precisione della lesione è ± 0,01 mm. Come la lama inizia a lacerare il midollo spinale, lubrificare il campo chirurgico con soluzione salina. La profondità di taglio del midollo spinale è controllata dal micro-pilota verticale ed è indipendente guida visiva.
6. Una volta che la profondità predeterminata è raggiunta, ruotare l'interruttore a vibrazione off. Idealmente, la lama oscillante è posizionata nella ldivario esion senza evidenza di deformazione del tessuto. Abbassare il palco dalla lama di taglio e rimuovere il sangue e soluzione salina dal campo operatorio utilizzando cotone Q-tips. Emostasi avviene spontaneamente in <1 min.
7. Rilasciare il mouse dalla stabilizzatore della colonna vertebrale. Approssimative dei muscoli paravertebrali con 6-0 sutura di seta e chiudere la pelle ferita usando l'acciaio inossidabile Michel clip.

3. Animal Care

1. Iniettare per via sottocutanea per un totale di 1-2 ml di soluzione fisiologica per mantenere un'adeguata idratazione e posizionare il mouse nella gabbia di recupero su una piastra elettrica, mentre riprendere conoscenza.
2. Fornire acqua e morbido ad lib cibo e somministrare analgesici per 48 ore dopo l'intervento. Non vi è alcuna necessità di cure vescica seguendo emisezione dorsale del midollo spinale.

Risultati

Immobilizzazione della vertebra bersaglio è di grande importanza nel generare lesioni precisi del midollo spinale mouse. Il nostro dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale di superare i problemi anatomici di brevi processi spinosi e lordosi ventrale del mouse del rachide cervicale. Le vertebre cervicali sono ben esposti utilizzando la nostra colonna vertebrale cervicale stabilizzatore (Figura 2). La nostra colonna vertebrale topo dispositivo stabilizzatore è una tecnica affidabile per preparare la colonna vertebrale per procedure cervicali del midollo spinale. La profondità della lesione utilizzando il LISA è preciso a 0,01 mm ^6,13. La lacerazione non causa precisa contusione all'interfaccia lesione / tessuto (Figura 3). La precisione delle lesioni hemisection dorsali stata dimostrata in topi C57BL / 6 in uno studio sulla rigenerazione assonale in cui una profonda lacerazione 0,9 millimetri estende appena oltre il canale centrale in ciascun campione confermato da sezioni patologiche del midollo spinale ^1. Locomozione di tutti questi animali recuperareed a seguito di questo infortunio lacerazione del midollo spinale.

Figura 1. (A) il mouse nella colonna vertebrale stabilizzatore posto sul palco LISA. La lama vibrante è diretta verso il midollo spinale ad essere lacerato. Controlli micro-driver si trovano sotto il palco e sono progettati per posizionare il mouse nel sito appropriato. Il micro-pilota verticale controlla la profondità della lesione, e la manopola inclinando controlla il piano orizzontale del midollo spinale per prevenire angolazione della lacerazione. L'interruttore on-off controlla il motore di vibrazione, e un'altra manopola regola la sua ampiezza. (B) A 0,75 millimetri emisezione dorsale lacerazione lesione tagliato sotto archi lamellari intatte.

Figura 2. (A) Lo stabilizzatore dorso topo costituito da una canalina a U e due bracci e connettori. Il mouse viene posizionato nel trogolo C utilizzato per SCI cervicale e nel trogolo per T toracica SCI. (B) La colonna cervicale è fissato posizionando le braccia sotto le sfaccettature laterali e poi bloccando le viti ad alette. La dura madre è esposto tra le lamine di C5-6, C6-7, e C7-T1 senza asportazione di osso.

Figura 3. Quattro lacerazioni dorsali del midollo spinale a profondità di 0.5, 0.8, 1.1 e 1,4 millimetri osservati nella vista sagittale (cresolo-viola ed eosina), raffigurante l'elevato grado di precisione utilizzando questa tecnica.

Discussione

Stabilizzazione vertebrale prima lacerazione lesioni al midollo spinale è stato ottenuto fissazione dei processi spinosi. Sia la colonna vertebrale curva di lordosi cervicale e l'attaccamento dei morsetti ai friabili brevi processi spinosi cervicali C3 attraverso T1 nel topo impediscono la stabilizzazione della colonna vertebrale efficace. Inoltre, l'uso di una lametta o microscissors utilizzati sotto controllo manuale provoca deformazione dei tessuti significativo che crea variabilità nella profondità della lesione ^6. Questo può portare alla errata interpretazione dei dati in particolare quando la rigenerazione assonale di percorsi specifici è studiato. Ad esempio, risparmiate dorsali assoni cortico possono essere erroneamente interpretati come assoni rigenerati se il dorsale tratto corticospinale non è stato completamente sezionato al momento della lesione. Queste sfide possono essere superate usando un dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale con la fissazione per le sfaccettature di un unico livello e precisa lesione del midollo spinale. Inoltre, utilizzando ahigh frequenza lama oscillante produce una lacerazione affilato senza schiacciare o contusing l'adiacente midollo spinale. Questo metodo è stato utilizzato per produrre lesioni spinali lacerazione spinale in ratti ^9,12,14, con successive modifiche per produrre lacerazioni toracici midollo spinale nei topi ^6. Nella presente comunicazione, si descrive il metodo di creazione affidabili lesioni cervicali lacerazione nel topo.

Nella misura in cui il diametro anteroposteriore del midollo spinale è <2 mm nel topo, profondità precise della lesione lacerazione sono fondamentali nella creazione di un modello sperimentale affidabile. Variabilità minima nella profondità della lesione si altera in modo significativo i risultati di esperimenti che valutano la rigenerazione degli assoni e studi volumetrici e comportamentali. La precisione della profondità lesione utilizzando questo metodo è ± 0,01 millimetri perché abbiamo usato microtrasduttori alta precisione per controllare la posizione della lama di taglio. Questo metodo ha ridotto l'incoerenzaherent in altri modelli di creazione di una lacerazione SCI. Questo metodo è particolarmente utile nello studio rigenerazione assonale del midollo spinale lungo vie di trova nella metà dorsale del midollo spinale, come il tratto corticospinale, il tratto rubrospinal, e il tratto ascendente dorsale. Con questo metodo, questi tratti di fibre possono essere completamente affidabile e sezionato. A questo riguardo, errori di interpretazione dati sono minimizzati, migliorando così l'affidabilità della comunicazione di studi sperimentali sulla SCI.

In sintesi, abbiamo descritto una nuova tecnica per creare un modello in vivo riproducibile di lesione del midollo spinale cervicale lacerazione nel topo. Questa tecnica si basa sulla stabilizzazione colonna vertebrale fissaggio delle faccette cervicali e lacerazione del midollo spinale utilizzando una lama oscillante. Utilizzando questo metodo in una toracico del midollo spinale dorsale modello lacerazione nei topi ^6, abbiamo dimostrato una stretta correlazione tra la profondità lacerazione, istologia, erecupero di comportamento. Tale tecnica è stata trovata anche per essere affidabili da molti altri laboratori di ^{2,12 componenti.}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice vertebral stabilizer	Louisville Impactor System		Stabilize and expose the cervical vertebra
LISA vibraknife	Louisville Impactor System		Produce the laceration injury of the cervical spinal cord
Spring Scissors	Fine Science Tools (USA)	15013-12	Skin and trapezius muscle incision
Spring Scissors	Fine Science Tools (USA)	15023-10	Separate muscles from the laminae
Spring Scissors	Fine Science Tools (USA)	15002-08	Incision of dura
Graefe forceps	Fine Science Tools (USA)	11154-10	Retract skin
Dumont #7 forceps	Fine Science Tools (USA)	11274-20	Muscle retraction (tip modified)(Fig. A)
Dumont SS forceps	Fine Science Tools (USA)	11203-25	Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B)
30G needle	Becton Dickenson	305106	Create a dural opening
6-0 suture	Ethicon	8806H	Close muscle and fascial layers
wound clip	Fine Science Tools (USA)	12031-07	Skin closure
Tribrom–thanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	90710-10G	Anesthetic agent
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com
Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps.