Procedura per decellularizzazione del Cuore di suino da retrograda perfusione coronarica

Riepilogo

Un metodo per rimuovere rapidamente e completamente componenti cellulari da un cuore suino intatta attraverso perfusione retrograda viene descritto. Questo metodo fornisce uno specifico sito cardiaca matrice extracellulare ponteggio che ha il potenziale per l'utilizzo in molteplici applicazioni cliniche.

Abstract

Perfusione basata decellularizzazione intero organo ha recentemente guadagnato interesse nel campo dell'ingegneria dei tessuti come mezzo per creare sito-specifici scaffold della matrice extracellulare, mentre gran parte conservando l'architettura nativa del ponteggio. Ad oggi, questo approccio è stato utilizzato in una varietà di sistemi di organi, compreso il cuore, polmone, fegato e ^1-5. Decellularizzazione metodi precedenti per tessuti senza una rete facilmente accessibile vascolare hanno invocato esposizione prolungata del tessuto a soluzioni di detergenti, acidi, o trattamenti enzimatici come mezzo per rimuovere i componenti cellulari e nucleari dall'ambiente circostante extracellulare ^6-8. Tuttavia, l'efficacia di questi metodi incernierato sulla capacità delle soluzioni di permeare il tessuto tramite diffusione. In contrasto, la perfusione di organi attraverso il sistema vascolare naturale ridotto efficacemente la distanza di diffusione e trasporto facilitato di decellularizatisugli agenti nel tessuto e componenti cellulari dal tessuto. Qui, si descrive un metodo per decellularize pienamente un cuore intatto suino attraverso perfusione coronarica retrograda. Il protocollo ha prodotto completamente decellularizzato cardiaca matrice extracellulare (ECM-c) scaffold con la struttura tridimensionale del cuore intatto. Il nostro metodo utilizzato una serie di enzimi, detergenti e acidi accoppiato con risciacqui ipertoniche e ipotoniche per facilitare la lisi delle cellule e la rimozione. Il protocollo utilizzato una soluzione di tripsina per staccare celle della matrice seguito da Triton X-100 e sodio desossicolato soluzioni per aiutare nella rimozione di materiale cellulare. Il protocollo descritto utilizza anche velocità di perfusione maggiore di 2 L / min per lunghi periodi di tempo. L'elevata portata, accoppiato con soluzione cambia accettati trasporto di agenti al tessuto senza contaminazione di detriti cellulari e assicurato efficace risciacquo del tessuto. Il metodo descritto rimosso tutto il materiale nucleare da native suina tessuto cardiaco, creando un sito-specifico cardiaca ECM scaffold che può essere utilizzato per una varietà di applicazioni.

Protocollo

1. Preparazione di tessuto ed esperimento di installazione

1. Harvest organo suina immediatamente dopo l'eutanasia da un impianto di macellazione o di ricerca e risciacquare sangue in eccesso. Tagliare il cuore di grasso in eccesso e tessuto, mantenendo gli atri e aorta intatto. Tagliare via il grasso per separare l'arteria polmonare dall'aorta. Se ci sono dei tagli nel tessuto, eliminare in modo appropriato.
2. Avvolgere ogni cuore singolarmente in carta freezer e memorizzare tutti i tessuti in un congelatore a -80 ° C per almeno 24 ore per garantire congelamento completo.
3. Quando si è pronti per l'uso (di solito meno di 3 mesi), scongelare un cuore intatto suino congelato di tipo 1 acqua per una notte immersi in un bicchiere 4 L a 4 ° C.
4. Dopo che il cuore è completamente scongelato, accarezzare il cuore arido, pesare il cuore, e registrare il peso. Il cuore di un maiale del peso di mercato dovrebbe pesare circa 375-450 g.
5. Collegare taglia 18 tubo Masterflex alla fine ¼ "di un riduttore spinato. Inserire il riduttore spinato etubo dentro l'aorta. Luogo 2 fascette o fascette sicure in tutto il aorta, appena sotto il tronco brachiocefalico. Il riduttore e la tubazione deve rimanere al di sopra della valvola aortica, così le arterie coronarie possono essere perfuso (Figura 1).
6. Utilizzare una siringa da 30 o 60 ml per riempire il tubo con acqua di tipo I. Inserire il tubo all'interno della cartuccia di una pompa a rulli Masterflex nel suo punto medio approssimativo. Immergere l'estremità del tubo di afflusso nel fondo di un bicchiere 4 L riempito con 2,5 L di acqua e fissare il tubo.
7. Posizionare il cuore nel becher riempito con acqua, e adescare la pompa per rimuovere le bolle d'aria. Se si osservano bolle proveniente dalla aorta dove è inserito il tubo, l'aorta può essere necessario riposizionare o fissato con legami aggiuntivi. Una chiusura ermetica è importante per mantenere la pressione necessaria durante il processo di decellularizzazione (Figura 2).
8. Posizionare i 4 becher contenente L 3 L di un 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 soluzione sul piatto mescolare e riscaldare a 37 ° C, in preparazione del processo di decellularizzazione.

2. Tissue Risciacqui

1. Impostare la pompa ad una portata di 400 ml / min, assicurando che la misura del tubo sia selezionata. Lavare il cuore di tipo I acqua per 15-25 minuti. Poiché la pompa viene avviata, il cuore deve gonfiarsi e effonderà sangue dai ventricoli. Soluzione fresca dovrebbe essere sostituito ogni 5-10 minuti, o quando necessario sulla base della quantità di sangue prelevato dal cuore. Se il sangue non è effuso dal cuore, regolare il tubo e morsetti sufficiente.
2. Arrestare la pompa e trasferire il cuore in un becher separato riempito di 2X Phosphate Buffered Saline (PBS). Dopo il tubo viene immerso in soluzione, avviare la pompa e aumentare il flusso di 700 ml / min. Il cuore dovrebbe rimanere in soluzione per 15 minuti, cambiando la soluzione ogni 5 min. Ogni cambiamento soluzione richiede la pompa da arrestare temporaneamente mentre il tessuto e il tubo viene spostatonel becher nuovo.
3. Trasferire il cuore di tipo I di acqua per 10 min e aumentare il flusso di 750 ml / min.

3. Decellularizzazione e soluzione di perfusione

1. Trasferire il cuore nel becher contenente 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ a 37 ° C. Aumentare la velocità della pompa a 1.200 ml / min e avviare la pompa. Utilizzare un agitatore posizionato sul fondo del bicchiere per far circolare la soluzione nel becher. Il cuore deve rimanere nella Trypsin/0.05% 0,2% EDTA/0.05% NaN ₃ soluzione a 37 ° C per un totale di tre ore. Dopo 1 h, aumentare la velocità della pompa a 1.500 ml / min. Dopo un'altra ora, aumentare la velocità della pompa a 1800 ml / min. Il tessuto è sottoposto a lenta velocità di perfusione aumento alla condizione del tessuto e prevenire la rottura dei vasi. Il cuore si gonfiano e quasi raddoppia durante questa fase del protocollo. Il tessuto perderà il suo colore naturale, procedendo dagli atri ai all'apice tutto °e protocollo (Figura 3).
2. Dopo ogni soluzione di perfusione, in due fasi di risciacquo viene eseguita per rimuovere i detriti cellulari, residui chimici, e lisi cellulare aiuto. Ogni lavaggio è costituito da un risciacquo 10 min in acqua di tipo I seguita da 10 min risciacquo con soluzione 2X PBS a temperatura ambiente. Ogni lavaggio consiste nella rimozione della soluzione dal recipiente originale, aggiungere soluzioni di risciacquo, e la circolazione del perfusato nel becher contenente il cuore sommerso. Dopo il 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ soluzione, acqua profumato a 1.900 ml / min e quindi perfondere 2X PBS a 1950 ml / min.
3. Trasferire il cuore ad una soluzione di 3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ a temperatura ambiente. Aumentare la velocità della pompa a 2.000 ml / min e profumato soluzione per un'ora. Rimuovere la soluzione dal bicchiere e sostituire con soluzione fresca, aumentare la velocità della pompa a 2100 ml / min, e perfondere la soluzione fresca per un'altra ora e mezzo, portando il tempo totale in3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN _3-2,5 ore.
4. Risciacquare il tessuto in acqua di tipo I a 2150 ml / min e 2X PBS a 2180 ml / min per 10 min.
5. Trasferire il cuore di una soluzione di sodio desossicolato 4% a temperatura ambiente. Aumentare la velocità della pompa a 2200 ml / min e profumato soluzione per 3 ore.
6. Risciacquare il tessuto in acqua a tipo I e 2X PBS a 2.200 ml / min per 15 min ciascuna, cambiando le soluzioni dopo 5-10 minuti per ogni soluzione. Le fasi di perfusione descritti possono essere suddivisi su più giorni eseguendo la fase di lavaggio due volte e memorizzazione del cuore con tubo attaccato notte a 4 ° C e sommersa in acqua Tipo I.
7. Il giorno seguente, eseguire un 5 min risciacquo con acqua di tipo I a 750 ml / min, seguito da un risciacquo 5 min in 1X PBS a 1.500 ml / min. Il protocollo può essere continuato con la portata descritto nella soluzione adeguata.

4. Disinfezione e trattamento finale

1. Trasferire il cuore ad un Perac 0,1%ETIC acido / soluzione di etanolo al 4% e la soluzione profumato per 1,5 ore a 2.200 ml / min.
2. I risciacqui finali per i tessuti sono tutti eseguiti in 2.200 ml / min. Perfondere il tessuto con 1X PBS per 15 minuti, seguito da due lavaggi 5 min in acqua di tipo I. Questa serie di risciacqui viene ripetuta ancora una volta, per completare la procedura di perfusione soluzione.
3. Spegnere la pompa e rimuovere il cuore da soluzione di scendere al cuore. Tagliare i legami della aorta, rimuovere tutti i tubi, e posizionare il cuore in un bicchiere vuoto a sgocciolare per 1 ora. Liquido in eccesso deve essere svuotato periodicamente. Gettare il cuore su un cuscinetto assorbente per drenare completamente il cuore (Figura 4).
4. Dopo la maggior parte dell'acqua viene rimossa, registrare il peso della matrice extracellulare cardiaca (C-ECM). Il cuore può aspettare di perdere circa il 20-25% del suo peso iniziale durante il processo di decellularizzazione.
5. Sezionare i ventricoli destro e sinistro, così come il setto ventricolare per DNA quantificatie il trattamento istologico per confermare decellularizzazione completa del tessuto (Figura 5).
6. Congelare il C-ECM a -80 ° C per almeno 2 ore prima della liofilizzazione.

Risultati

L'effetto di decellularizzazione sui cuori suina tutto varia naturalmente a causa delle differenze in termini di dimensioni, pressioni, e la disposizione del serbatoio. Pertanto, la composizione esatta degli scaffold derivati ​​matrice extracellulare non sarà lo stesso da cuore a cuore. Il completamento del protocollo descritto produrrà un cuore che appare bianco o traslucido, indicando la perdita di materiale cellulare. Tuttavia, è ampiamente accettato che un tessuto può essere considerata "decellulari...

Discussione

Lo studio attuale metodologia descritta per decellularizzazione coerente ed efficace di un cuore suino. Il protocollo era una modifica a un precedentemente pubblicato con il rapporto ^1, e comprendeva più l'esposizione al flusso e aumento della pressione, che ha fornito risultati più ripetibili. Il tessuto risultante decellularizzato soddisfatto tutti i criteri pubblicati per decellularizzazione successo del tessuto ^2. Soluzione cambia frequenti sono stati eseguiti per limitare la reintroduzio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tripsina	Gibco	15090
EDTA	Pescatore	BP120-500
NaN 3	Sigma	S2002-500G
Triton X-100	Sigma	X100-1L
10X PBS	Pescatore	BP399-20
Sodio desossicolato	Sigma	D6750-500G
Acido peracetico	Pfaltz e Bauer	P05020	35% CAS # 79-21-0
Etanolo	Pharmco	111000200
Masterflex azionamento della pompa	Cole Parmer	SI-07.524-50
Masterflex Tubi	Cole Parmer	96400-18	Size 18
Riduttore spinato	Cole Parmer	EW-30612-20
Beaker 4L	Fisher Scientific	02-540T