Misura della durata della vita in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Nancy J. Linford; Ceyda Bilgir; Jennifer Ro; Scott D. Pletcher

doi:10.3791/50068

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In questo articolo

Riepilogo
Abstract
Protocollo
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Discussione
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Materiali
Riferimenti
Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Drosophila melanogaster è un organismo modello potente per esplorare le basi molecolari della regolazione longevità. Questo protocollo discuterà i passaggi necessari per generare una riproducibile, basato sulla popolazione, la misurazione della longevità e gli eventuali rischi potenziali e come evitarli.

Abstract

L'invecchiamento è un fenomeno che si traduce in costante deterioramento fisiologico in quasi tutti gli organismi in cui è stato esaminato, con conseguente riduzione delle prestazioni fisiche e aumento del rischio di malattia. Invecchiamento individuale si manifesta a livello di popolazione, come un aumento della mortalità età-dipendente, che viene spesso misurata in laboratorio osservando la durata della vita in ampie coorti di individui di pari età. Gli esperimenti che cercano di quantificare la misura in cui le manipolazioni genetiche o ambientali impatto durata della vita in organismi modello semplici hanno riscosso un notevole successo per la comprensione degli aspetti dell'invecchiamento che si conservano in taxa e per ispirare nuove strategie per estendere la durata della vita e la prevenzione della malattia associata all'età nei mammiferi .

La mosca dell'aceto, Drosophila melanogaster, è un organismo modello attraente per lo studio dei meccanismi di invecchiamento a causa della sua relativamente breve vita, allevamento conveniente, e la genetica facili.Tuttavia, le misure demografiche di invecchiamento, tra cui l'età-specifica e la mortalità, sono straordinariamente sensibili a variazioni anche minime nel disegno sperimentale e l'ambiente, e il mantenimento di pratiche di laboratorio rigorose per tutta la durata degli esperimenti di invecchiamento è richiesto. Queste considerazioni, insieme con la necessità di praticare un attento controllo dei background genetico, sono essenziali per la generazione di misure robuste. In effetti, ci sono molte controversie notevoli circondano inferenza da esperimenti longevità in lievito, vermi, mosche e topi che sono stati tracciati di artefatti ambientali o genetici ^1-4. In questo protocollo, si descrive una serie di procedure che sono stati ottimizzati per molti anni per misurare la longevità in Drosophila con fiale di laboratorio. Abbiamo anche descrivere l'uso del software dLife, che è stato sviluppato dal nostro laboratorio ed è disponibile per il download ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / software). dLife accelera la produttività e promuovere le buone pratiche, integrando design ottimale sperimentale, semplificare la gestione e la raccolta dei dati mosca, e la standardizzazione delle analisi dei dati. Discuteremo anche le numerose insidie potenziali nella progettazione, raccolta e interpretazione dei dati di durata della vita, e mettiamo a disposizione misure per evitare questi pericoli.

Protocollo

Si consiglia la conservazione di alimenti, pasta di lievito sperimentali, e piastre di agar uva che appaiono nel protocollo a 4 ° C e il loro utilizzo entro 1-2 mesi fino a quando la muffa e l'aridità non sono impostare in condizioni ambientali standard sia per la larve e adulti fase di manutenzione comportano mosche in un incubatore a 25 ° C con un ciclo luce 12:12 hr scuro e 60% di umidità relativa.

1. Preparazione di alimenti Sperimentale

Per la crescita delle larve, si usa una versione modificata del Caltech Media ^5, che è abbreviato in questo protocollo come CT.
Si consiglia una dieta per adulti Drosophila (SY), che consiste di zucchero (saccarosio) e lievito (lievito liofilizzato di birra intero) in una base di agar al 2%, che è stata bollita, integrato con antibiotici e anti-fungine agenti, e distribuito (10 ml per flaconcino) ^6. Alimentare dovrebbe essere consentito di solidificare e far evaporare per 12-24 ore prima del rimessaggio. Perché l'ambiente nutriente può sostanzialmente longevità impatto, la coerenza nei processi di cottura è essenziale sia all'interno di un esperimento e per il confronto tra esperimenti.
Se un agente farmacologico deve essere aggiunto al cibo per adulti, questo farmaco può essere miscelato in un piccolo lotto di alimenti e stratificato (2 ml) sulla superficie alimentare, con le fiale di controllo ricevono strati contenenti il solo veicolo.

2. Preparazione di una pasta di lievito vivo

Unire 5-6 ml di acqua con 3 g di lievito secco attivo e mescolare bene. La consistenza della pasta di lievito dovrebbe essere quella di un burro di arachidi liscia.

3. Preparazione di una piastra di agar Grape

Aggiungere un pacchetto di una premiscela agar uva in 500 ml di acqua distillata in un matraccio tarato da 1000 ml e seguire le istruzioni sulla confezione di sciogliere l'uvaggio agar.
Versare con cautela uno spesso strato della miscela in piastre di Petri da 100 mm, evitando la formazione di bolle. Una bustina di premix produce circa 14 grape piastre di agar.
Ai media raffreddare e solidificare a temperatura ambiente con coperchi per 15 min. Piastre può essere conservato a 4 ° C, avvolto nella pellicola, o utilizzato immediatamente.

4. Raccolta di uova sincronizzato

Tutti i mezzi utilizzati in questo protocollo, vale a dire lievito, piastre di agar uva, CT e il 10% il cibo SY, devono essere a temperatura ambiente.

Stendere uno strato di 2-3 cm di diametro di lievito in pasta su una piastra di agar uva e mettere da parte.
Mettere una grande gabbia di raccolta delle uova su un CO ₂ pad con la maglia sul lato verso il basso per anestetizzare le mosche. A base di azoto anestesia è un'alternativa a CO _2, utilizzato da alcuni laboratori, che può produrre risultati di alta qualità ^7.
Usando un imbuto, trasferire 150-200 coppie di mosche nella gabbia raccolta delle uova.
Posizionare la piastra di agar dell'uva per coprire l'estremità aperta della gabbia e fissare con un cappuccio terminale.
Posare la gabbia su un lato fino mosche svegliarsi.Quindi, assicurarsi che il gabbia uva lato piastra di agar verso il basso, in incubatrice durante la notte.
Il giorno dopo, scambiare la piastra d'uva con una piastra di uva appena yeasted. Solo mettere circa 1 cm di diametro di pasta di lievito sulla superficie della piastra. Eliminare il giorno 1 ^° piatto d'uva.
Lasciare embrioni a raccogliersi sulla superficie della piastra di agar uva per 16-22 ore. Una volta fatto, raccogliere l'uva piastra agar ed eliminare le mosche padre.
Lavare la superficie delle piastre di agar uva con 1x tampone fosfato isotonico (PBS). Le uova possono essere trasferite da raschiando delicatamente con un batuffolo di cotone. Fare attenzione a non graffiare, danneggiare o raschiare sottili pezzi di agar sulla superficie della piastra. Con l'aiuto di un imbuto, versare le uova lavate in una provetta conica da 15 ml.
Lasciate che le uova si depositano sul fondo della provetta e versare il surnatante, facendo attenzione a non perdere tutte le uova. Il volume rimanente dovrebbe essere di circa 2-3 ml.
Aggiungere 8-10 ml di PBS al tubo e ripetere il precedente passo 2-3 morvolte posta di lavare accuratamente le uova fino a quando il surnatante è chiara. Come liberarsi di lievito residuo è la chiave in questa fase.
Dopo il lavaggio, prosciugare surnatante fino rimanente volume è di 2 ml. Aliquotare 32 pl di uova in bottiglie CT con un ampio foro punta della pipetta. Uova nel puntale della pipetta deve essere compatto, con poco o nessun liquido aspirato. Questo può essere ottenuto inserendo la punta della pipetta profondità nella composizione uovo e rilasciando lo stantuffo per aspirare.
Luogo testa di serie CT imbottiglia torna in incubatrice durante tutto lo sviluppo mosca.

5. Raccolta di pari età Adulto Flies

Gli adulti in genere Eclose dal giorno 9 in poi. Eliminare le mosche emerse il primo giorno e bottiglie posto di nuovo in incubatrice durante la notte. Questa pratica sarà evitare la selezione involontaria per Emergents precoci e consentire la raccolta di un numero massimo di mosche sincronizzati.
16-22 ore più tardi, trasferire il giorno di vita adulto vola into 10% SY alimentari bottiglie. Se necessario, un altro lotto possono essere raccolti il giorno successivo.
Ritorno vola di nuovo nel incubatore e consentire in linea per raggiungere la maturità sessuale e compagno per due giorni. Registrare il giorno del trasferimento al 10% bottiglie SY come il primo giorno di adulta.

6. Ordinamento mosche e impostazione esperimento Longevità

Anestetizzare piccoli gruppi di mosche sul pad anestetico, poi maschi e femmine di ordinamento in due gruppi utilizzando un pennello. Se si utilizza CO _2, è fondamentale ridurre al minimo l'esposizione di prevenire possibili duraturi problemi di salute che possono compromettere l'integrità dell'esperimento longevità.
Posto 30 mosche dello stesso sesso in fiale singole. Supponendo che non cromosomi bilanciatori nella popolazione e progenie sana, ogni bottiglia dovrebbe produrre circa 3-4 fiale di ciascun sesso. Aliquotandolo mosche in fiale singole non dovrebbe richiedere più di 3-4 minuti, in modo che, in totale, le mosche sono solo esposti ad anestesia per un massimo di9-10 min.
Ripetere i passaggi 6,1-6,2 fino a quando ci sono 8-10 flacone replicati per ogni genere e trattamento sperimentale.

7. Impostazione del foglio di calcolo Excel per tenere traccia dell'esperimento Longevità

Si consiglia di randomizzazione posizione fiala piuttosto che fiale di raggruppamento di condizioni sperimentali, al fine di evitare distorsioni associate alla posizione flaconcino in incubatrice e di oscurare l'identità fiala per lo sperimentatore. Per fare questo, prima assegnare un ID numerico casuale ad ogni flacone in un programma di foglio di calcolo, quindi disporre i flaconi in vassoi per numero ID. Se si utilizza il software di esperimento dLife gestione, seguire il tutorial sulla configurazione di esperimento per generare il numero di ID per ogni flacone.
(Facoltativo) Se si utilizza un lettore di RFID o lettore di codici a barre in associazione con dLife, collegare un codice a barre o tag RFID per ogni flacone e associare l'etichetta con l'ID numerico del flaconcino in dLife. Il programma riconosce ogni flacone durante la scansione con un lettoree guidare uno per registrare i dati nella posizione corretta in un foglio. Utilizzo di un lettore di tag in combinazione con dLife riduce significativamente il tempo di raccolta di dati e l'errore di registrazione.

8. Mantenere l'esperimento Longevità

Le fiale contenenti alimenti freschi devono essere a temperatura ambiente per ogni trasferimento.

Durante il periodo di sperimentazione, mosche trasferimento su nuovi flaconi contenenti cibo fresco ogni 2 giorni (donne giovani), o 3 volte a settimana (maschi o femmine> 3 settimane di età). Questo passaggio farà in modo che l'ambiente di alimentazione per le femmine giovani non viene interrotto dalla presenza di larve. Questo trasferimento dovrebbe essere completato senza anestesia, che può indurre la mortalità acuta, in particolare nei vecchi mosche (Pletcher, osservazioni personali).
Nel corso di ogni flacone di trasferimento, registrare l'età, contare le mosche morte nel flacone vecchio, e le mosche morte che vengono trasportati al nuovo flacone. Registrare tali informazioni separatamente neldue colonne in un foglio di calcolo (sia dLife o il tuo foglio di calcolo). Questo farà sì che le mosche non sono effettuati due volte. Il numero totale di morti (morti + effettuata) dovrebbe almeno uguale al numero di mosche effettuate dal trasferimento precedente. Sottrarre il numero di mosche precedentemente svolte dal numero totale di decessi per determinare il numero di morti nuove.
Una mosca è considerata destro censurata se lasciato l'esperimento prima della morte naturale attraverso la fuga o la morte accidentale. Animali in uscita l'esperimento in questo modo deve essere inserito in una colonna a parte il giorno in cui la mosca è uscito l'esperimento. Mosche censurati non sono registrati come morti (vedi sotto).
Continuare a ripetere i passaggi 8,1-8,2 fino a quando l'ultimo sopravvissuto è morto. Essere consapevoli del fatto che, come l'età mosche, alcune mosche può mentire sulla schiena e sembrano morti a causa della loro inactiveness. Pertanto, quando il conteggio mosche realizzate (morto), toccare il lato delle fiale per determinare se ci sono movimenti delle gambe. Se è così, thesmosche E sono ancora vivi. Nel caso in cui rimangono attaccate mosche per il cibo nel flaconcino vecchio ma vivo, non devono essere considerate come morta e deve essere salvato da un'ulteriore maschiatura del flaconcino per rimuovere al volo. Censura mosche dovrebbero essere usati con cautela in quanto può causare pregiudizi sperimentale.

9. Analisi dei dati

La curva di sopravvivenza mostra la probabilità che un individuo sopravvive a una certa età ed è di solito calcolato utilizzando un metodo Kaplan-Meier (Figura 1) ^8. In assenza di dati censurati destro, la formula può essere semplificata in modo tale che l'età-specifica sopravvivenza all'età x _(x S) è determinata dividendo il numero di individui viventi all'inizio di un tempo censimento all'età x (N _x) per il numero totale di mosche nell'esperimento (N _0); S _x = _x N / N _0. 9.2) le curve di sopravvivenza sono la forma più comune di presentazione dei dati, epuò essere testato per la parità tra i gruppi con un log-rank test. Ragionevole deduzione si può trarre da un minimo di 50-100 individui in una coorte. Sopravvivenza è una misura cumulativa, tuttavia e quindi morti che non sono legate all'invecchiamento, come quelli nella prima infanzia, si deprimono sopravvivenza per tutta la durata rendendo difficile riscontrare specifici all'invecchiamento.
Un secondo metodo di visualizzazione dei dati è l'età-specifica funzione di mortalità, che visualizza il rischio di morire per ogni intervallo di età e presenta una descrizione più sfumata dei dati di sopravvivenza ^9,10. Misure mortalità sono indipendenti da un'età all'altra, e la forma della curva di mortalità è utile per inferenza circa le dinamiche di invecchiamento, in particolare quando i trattamenti sono regolate durante la vita adulta. Le stime di mortalità specifica per età, tuttavia, mancano sia la precisione e l'accuratezza con campioni di piccole dimensioni, e spesso richiedono molti-a-molti centinaia di individui per coorte per un es affidabiletimate ^11.
Altri metodi per la stima delle differenze di longevità sono parametrici (ad esempio Gompertz) e semi-parametrici (ad esempio, della regressione di Cox) modelli. Questi modelli possono essere potenti, ma deve essere applicato con cautela a causa delle ipotesi formulate circa la forma delle curve di mortalità e la natura degli effetti del trattamento, che potrebbe portare a deduzione errata ^11,12.