Misure rigidezza flessionale di biopolimeri usando saggi Gliding

Riepilogo

Un metodo per misurare la lunghezza di persistenza o rigidezza flessionale di biopolimeri è descritto. Il metodo utilizza una chinesina-driven saggio microtubuli planata per determinare sperimentalmente la lunghezza di persistenza di microtubuli singoli ed è adattabile a actina saggi basati scorrimento.

Abstract

I microtubuli sono polimeri del citoscheletro che svolgono un ruolo nella divisione cellulare, cellulari, meccanica e mezzi di trasporto intracellulare. Ciascuna di queste funzioni richiede microtubuli che sono rigidi e dritti abbastanza per occupare una frazione significativa del diametro della cellula. Come risultato, la lunghezza di persistenza microtubuli, una misura della rigidità, è attivamente studiati negli ultimi due decenni ^1. Tuttavia, restano questioni aperte: microtubuli brevi sono 10-50 volte meno rigido rispetto microtubuli lunghi ^2-4, e anche lungo i microtubuli hanno misurato lunghezze persistenza che variano da un ordine di grandezza ^5-9.

Qui, vi presentiamo un metodo per misurare la persistenza lunghezza microtubuli. Il metodo si basa su un saggio microtubuli chinesina-driven scorrimento ^10. Grazie alla combinazione di scarsa marcatura fluorescente dei microtubuli singoli con servizio di monitoraggio singola particella di fluorofori singoli collegati al microtubulo, il Glidintraiettorie g di microtubuli singoli vengono tracciati con precisione a livello di nanometri. La lunghezza di persistenza delle traiettorie è uguale alla lunghezza di persistenza del microtubulo nelle condizioni utilizzate ^11. Una routine di rilevamento automatico viene utilizzato per creare traiettorie microtubuli da fluorofori collegati microtubuli singoli, e la lunghezza di persistenza di tale traiettoria è calcolata utilizzando routine scritte in IDL.

Questa tecnica è attuabile rapidamente, e in grado di misurare la lunghezza di persistenza di 100 microtubuli in un giorno di sperimentazione. Il metodo può essere esteso per misurare la lunghezza di persistenza sotto una varietà di condizioni, tra lunghezza di persistenza in funzione della lunghezza lungo i microtubuli. Inoltre, le routine di analisi utilizzate può essere esteso a miosina basati azione saggi scorrimento, per misurare la lunghezza di persistenza dei filamenti di actina pure.

Introduzione

Il citoscheletro, una rete di biopolimeri presenti nella maggior parte delle cellule eucariotiche, svolge un ruolo nella organizzazione cellulare, trasporto intracellulare, e meccanica delle cellule. Le caratteristiche meccaniche dei biopolimeri del citoscheletro (principalmente actina e microtubuli) svolgono un ruolo significativo nel determinare le caratteristiche meccaniche della cellula nel suo complesso ^12. Poiché meccanica cellule intere possono caratterizzare cellule sane e malate ^13,14 ed è coinvolto nella motilità cellulare ^15, le proprietà meccaniche dei componenti citoscheletrici sottostanti sono un'area attiva di studio per gli ultimi due decenni ^1.

La flessibilità (o rigidità) di biopolimeri è caratterizzato dalla lunghezza di persistenza, la lunghezza del polimero che si piega per circa un radianti sotto fluttuazioni termiche a temperatura ambiente. Un certo numero di tecniche sono state sviluppate per misurare la lunghezza di persistenza ^16, per exampLe tecniche attive che coinvolgono piegare il polimero attraverso il flusso idrodinamico, trappole ottiche, o campi elettrici ^4,17,18, e tecniche passive che misurano le fluttuazioni di polimeri libere in soluzione ^5,6. Le misurazioni attivi, tuttavia, richiedono configurazioni specializzate per implementare forze note sulla scala del micrometro, e le misurazioni di fluttuazione libera può essere difficile a causa della diffusione di piano focale del microscopio utilizzato.

In questo articolo, si descrive un complementare, passiva, tecnica per misurare la lunghezza di persistenza dei microtubuli, un polimero del citoscheletro. La tecnica prevede saggi volo a vela, che assicurano che il polimero rimane sempre nel piano focale ^19. Inoltre, esso comporta il rilevamento fluorofori singoli collegati in modo permanente al polimero di interesse, in modo che punti specifici lungo il polimero sono ben caratterizzati.

Un cartone animato del metodo è illustrato nella Figure 1. Kinesina si muove in particolare verso la fine + di microtubuli, in modo che i microtubuli in un test di volo a vela sono spinti unidirezionale. L'estremità anteriore del microtubulo, oltre l'ultima chinesina collegato, è libero di fluttuare sotto le forze termici della soluzione circostante. Come il microtubulo viene spinto in avanti, fino alla fine oscilla legarsi a una molecola chinesina nuovo più avanti lungo il vetrino si congela in una fluttuazione dato. Poiché chinesina attribuisce microtubuli fortemente, la microtubuli è costretto a seguire il percorso della estremità anteriore. Pertanto, le fluttuazioni statistiche congelati nella traiettoria microtubuli sono le stesse delle fluttuazioni statistiche della estremità libera ¹¹ microtubuli, e può quindi essere utilizzata per calcolare la lunghezza di persistenza secondo ²⁰

dove L è la lunghezza _p persistenza del microtubulo, _s θ è l'angolo tra tangenti alla traiettoria separate da una lunghezza s contorno, e <> indica una media di tutte le coppie di posizioni separate da una lunghezza s contorno.

Il saggio di scorrimento si utilizza chinesina biotinilato al coiled-coil ²¹ legato specificamente al vetrino tramite una streptavidina-biotina linkage. Questo accessorio assicura che i domini motore sono liberi di legarsi ai microtubuli e spingere. Al fine di seguire traiettorie microtubuli, microtubuli sono scarsamente etichettati con fluorofori organici ^22,23 - le etichette devono essere sparso abbastanza fluorofori singoli sono risolvibili utilizzando singola molecola microscopia a fluorescenza. Fluorofori singole sono monitorati tramite routine di analisi di immagini scritte in IDL. Le traiettorie di ciascun fluoroforo legato ad un determinato microfonorotubule sono combinati in una traiettoria microtubulo automaticamente composito ^24. Gli angoli θ tangente ad ogni punto lungo una traiettoria vengono calcolati; da questi angoli tangenti l's> valore viene calcolato per ogni s lunghezza dei contorni. Infine, questi dati sono idonei a Eq. 1 in modo da estrarre una lunghezza di persistenza per un determinato microtubulo, o per molti microtubuli nello stesso dosaggio scorrimento.

Il metodo è abbastanza robusta per lavorare con microtubuli preparati in una varietà di condizioni (con differenti agenti stabilizzanti o altre piccole molecole legate al microtubulo, con proteine ​​legate associati microtubuli (MAP), o con una varietà di soluzioni viscose). Nel nostro laboratorio, la tecnica è stata utilizzata per caratterizzare la lunghezza di persistenza dei microtubuli in funzione della lunghezza lungo i microtubuli ei microtubuli con diversi agenti stabilizzanti. La limitazione principale è che i microtubuli devono ancora sOSTEGNO chinesina motilità. Poiché chinesina è un enzima motore robusto, questa è una restrizione abbastanza sciolto. Sostituendo con actina e microtubuli chinesina con un enzima famiglia miosina, la lunghezza di persistenza di actina può essere misurata utilizzando la stessa tecnica.

Protocollo

1. Microtubuli Gliding scorta di saggio Solutions

Preparare in anticipo dosaggio volo a vela.

1. Polimerizzare microtubuli 0,5 mg scarsamente etichettati con brillante organico fluoroforo ^22. La concentrazione etichetta di destinazione è 1 fluoroforo per micrometro di microtubuli, etichettatura o una densità di circa 1 fluoroforo per 1.500 dimeri di tubulina. Conservare a temperatura ambiente, la luce protetta con alluminio, pellicola per un massimo di due settimane.
2. Purificare biotina-chinesina ²¹ a circa 1 pM. Conservare a -80 ° C in aliquote di 5 microlitri per uso in esperimenti singoli.
3. Preparare il tampone di saggio (AB) di 50 imidiazole mM, 50 mM di cloruro di potassio (KCl), 4 mM di cloruro di magnesio (MgCl _2), 2 mM di etilene glicole tetraacetico (EGTA), pH 6,7. Filtro sterile e conservare a 4 ° C.
4. Sciogliere biotinilato albumina di siero bovino (biotina-BSA) a 2 mg / ml in AB. Filtro con 0,2 micron filtro siringa.Conservare a -80 ° C in aliquote di 100 microlitri per lunghi periodi, a 4 ° C per un mese.
5. Sciogliere streptavidina (SA) a 10 mg / ml in AB. Filtro con 0,2 micron filtro siringa. Conservare a -80 ° C in 20 aliquote pl per lunghi periodi, a 4 ° C per un massimo di due settimane.
6. Sciogliere α-caseina a 5 mg / ml in AB. Filtro con 0,2 micron filtro siringa. Conservare a -80 ° C in aliquote di 100 pl per lunghi periodi, a 4 ° C per un massimo di due settimane.
7. Sciogliere ditiotreitolo (DTT) in acqua deionizzata a 200 mM. Conservare a -20 ° C in aliquote di 100 pl, da usare entro 8 ore di scongelamento. Può essere ricongelato.
8. Sciogliere paclitaxel (PT) in grado HPLC dimetilsolfossido (DMSO) a 4 mM. Conservare in aliquote da 10 pl a -80 ° C lungo termine, -20 ° C a breve termine. Utilizzare entro 8 ore dallo scongelamento. Può essere ricongelato.
9. Sciogliere il glucosio in acqua deionizzata a 120 mg / ml. Conservare in aliquote di 100 pl a -20 ° C. Può essere ricongelato.
10. Disrisolvere adenosina trifosfato (ATP) in acqua deionizzata a 150 mM, pH 7,0. Conservare in aliquote di 5 pl a -80 ° C, da usare entro 8 ore di scongelamento.
11. Preparare 100x magazzino l'assorbimento di ossigeno ^25, sciogliendo 10.000 unità di glucosio ossidasi e catalasi 156.000 unità in 600 microlitri di buffer totale del saggio. Centrifugare brevemente in una microcentrifuga per far sedimentare i solidi; sopranatante filtro con filtro 0,2 micron siringa. Conservare a -80 ° C in aliquote da 10 pl per lunghi periodi, a 4 ° C per una settimana.

2. Microtubuli Gliding Assay, in giornata Soluzione Preparazione

Preparare le soluzioni in 2,1-2,6 il giorno dell'esperimento. Con la pratica, le soluzioni 2,2-2,6 può essere preparato durante la cella a flusso di lavaggio. Se non diversamente specificato, mantenere le soluzioni di archivi su ghiaccio.

1. Preparare AB, 1 ml di tampone con 10 ml di DTT magazzino (AB con 2 mM DTT). Conservare a temperatura ambiente.
2. Preparare bio-BSA, 40 e mu, L di una miscela 1:1 di biotina-BSA magazzino e AB. Conservare a temperatura ambiente.
3. Preparare tampone BSA, mescolando 645 ml di AB 5,5 microlitri con BSA (1 mg / ml di BSA in AB). Conservare a temperatura ambiente.
4. Preparare tampone SA, mescolando 57 ml di AB con 3 stock microlitri streptavidina (0,5 mg / ml di streptavidina in AB). Conservare a temperatura ambiente.
5. Preparare α-caseina buffer, mescolando 200 ml di BSA, 50 microlitri archivio di caseina, e 0,8 pl di ATP 15 mM (1 mg / ml α-caseina, 0,8 mg / ml BSA, 50 nM ATP in AB). Conservare a temperatura ambiente.
6. Preparare fluorescenza anti-candeggina tampone, mescolando 95 microlitri α-caseina tampone, 2,5 microlitri archivio di glucosio, 1 mix microlitri ossigeno 100x scavenging, 1 stock paclitaxel pl, 1 ml 2-mercaptoetanolo (βME). Aggiungi βME sotto cappa d'aspirazione. Utilizzare fluorescenza anti-candeggina buffer entro 1 ora di preparazione. ATTENZIONE: βME è altamente tossico e odori terribili. Assicurarsi di aprire solo sotto la cappa aspirante. Conservare nella bottigliaassenza di luce, la luce degrada βME e la sua capacità di ridurre photobleaching.

3. Microtubuli Gliding Assay

1. Costruire circa quattro corsie di flusso tra un x 24 60 coprioggetto mm e 22 x 22 mm con l'utilizzo coprioggetto grasso per vuoto, estrusi da una siringa attraverso un puntale, come un distanziatore. Ogni corsia flusso deve essere di circa 10 microlitri di volume (scala volumi successivi di conseguenza).
2. Lavare 10 pl di bio-BSA buffer in ogni corsia. Incubare 5 min per permettere BSA per rivestire le superfici di vetro.
3. Lavare ogni corsia tre volte con 15 microlitri tampone BSA per rimuovere libera biotina-BSA, pur continuando a bloccare la superficie di scorrimento. Utilizzare un Kimwipe o carta da filtro per rimuovere il tampone dal lato opposto della camera di flusso, assicurandosi di non lasciare bolle d'aria di passare attraverso la camera di flusso.
4. Lavare 15 microlitri SA-buffer in ogni corsia. Attendere 10 minuti, o fino a 2 ore. La streptavidina si legano alla superficie è legato biotina-BSA.
5. Lavare ogni corsia per tre volte con 15 microlitri di buffer BSA per rimuovere libero SA, pur continuando a bloccare la superficie del vetrino.
6. Lavare ogni corsia con 15 microlitri α-caseina buffer. α-caseina aiuta ulteriormente bloccare il legame non specifico di chinesina e microtubuli al vetro.
7. Diluire chinesina a 10 nM in α-caseina tampone e lavare ogni corsia con 15 pl di questo chinesina - α-caseina soluzione. Attendere 15 minuti (o fino ad un'ora) per la cinesina biotinilato di legarsi specificamente alla superficie è legato il streptavidina. I domini motore chinesina resteranno liberi di microtubuli si legano.
8. Diluire paclitaxel a 40 pM a temperatura ambiente α-caseina tampone, e lavare ogni corsia con 15 pl di questa soluzione per lavare chinesina libero e per pre-caricare ogni camera di flusso con una soluzione di paclitaxel per impedire microtubuli dai depolimerizzante. Freddo depolimerizza anche microtubuli, in modo da assicurarsi che questi passaggi avvengono a temperatura ambiente con temperature ambienteri soluzioni.
9. Diluire il marcato in modo fluorescente microtubuli 1:100-1:1,000 della fluorescenza anti-candeggina buffer con 1 mM ATP. Lavare 15 microlitri in una corsia ed osservare entro 30 min.

4. Raccolta dei dati

1. Osservare il volo a vela microtubuli mediante microscopia a fluorescenza, un microscopio in grado di risolvere fluorofori singoli come un setup commerciale o casa-build TIRF è richiesto ²⁶ (Figura 2).
   I microtubuli devono essere azionati da motori chinesina sul substrato a circa 0,5 micron / s, a seconda della temperatura. Se il campo di vista del microscopio è 50 pm, microtubuli singoli dovrebbero essere visibili per circa 100 sec. Impostare l'intensità di illuminazione in modo che singoli fluorofori non fotosbiancante più velocemente di 100 sec. Se si utilizza eccitazione laser, un livello di potenza di circa 3-5 mW è appropriato.
2. Raccogliere sequenze di immagini per l'analisi. 600 immagini a5 Hz (2 totale min) funziona bene. Utilizzare sequenze abbastanza a lungo microtubuli che attraversano l'intero campo di vista.

5. Analisi dei dati

Una routine IDL, get_lp.pro , è allegato. Questa routine restituisce un valore di lunghezza di persistenza sulla base di tutte planata microtubuli in una sequenza data immagine. O eseguire questa routine su ogni sequenza di immagini, modificare i parametri di intensità a seconda della configurazione del microscopio particolare, o di effettuare le seguenti operazioni:

1. Traccia ogni fluoroforo collegato a un microtubulo per creare traiettorie fluorofori.
2. Combinare tutte le traiettorie di fluorofori su un microtubulo data in una traiettoria complessiva microtubuli; ripetere per ogni microtubule nella sequenza di immagini (Figura 3).
3. Calcolare l'angolo tangente ad ogni punto lungo la traiettoria (Figura 4), E calcolare θ _s> nell'eq. 1 mediando il coseno della differenza di angolo per ogni coppia di punti separati da un percorso di lunghezza s (Figura 5). Trovare la lunghezza di persistenza di un microtubulo o un gruppo di microtubuli θ _s> a Eq. 1, ponderazione singoli punti dati nella forma per il numero di valori indipendenti di cos θ _s che sono utilizzati per calcolare la media.

Risultati

Un'istantanea da un saggio scorrimento è mostrato in Figura 2. Una buona densità microtubuli è microtubuli 1-10 per campo; sostanzialmente più provocherà sbandamento come microtubuli incrociano. Un grafico delle traiettorie 11 microtubuli del dosaggio scorrimento in figura 2 è mostrato in Figura 3. Traiettorie tipiche sono 10-30 micron di lunghezza, alcune traiettorie presentano spazi vuoti dove si incrocia un altro microtubuli. Tali traiettorie possono essere...

Discussione

Misure di lunghezza persistenza sono una buona caratterizzazione delle proprietà meccaniche dei biopolimeri singoli. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo per misurare la lunghezza di persistenza dei microtubuli. Come detto nell'introduzione, questo metodo è facilmente esteso ad esaminare le proprietà meccaniche microtubuli in una varietà di condizioni semplicemente variando i reagenti, temperatura o viscosità nella fase finale del saggio planata, 3,9, o da microtubuli polimerizzanti, passo 1,1, in co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imidazolo	Sigma-Aldrich	I2399
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P9541
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
BSA	Calbiochem	126615
Biotinilato BSA	Thermo Scientific	29130
Α-caseina	Sigma-Aldrich	C6780
Streptavidina	Thermo Scientific	21125
Ditiotreitolo	Sigma-Aldrich	D0632
Paclitaxel	LC Laboratori	P-9600
Glucosio ossidasi	Sigma-Aldrich	G2133
Catalasi	Sigma-Aldrich	C100
Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
2-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	M3148	Toxic. Acquista piccola quantità.
24x60 mm N ° 1 1/2 bicchiere di copertura	VWR	48393-252
22X22 mm N ° 1 bicchiere di copertura	Gold Seal	3306
Grasso per alto vuoto	Dow-Corning	NA
TIRF microscopio	Molti	NA	Il microscopio TIRF utilizzato in questo metodo è stato fatto in casa.
IDL (software)	Exelis	NA	Potrebbe sostituire MATLAB, ImageJ, o altri software di analisi dell'immagine.