In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

Riepilogo

Cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali. Un In vivo A due fotoni metodo di imaging è descritto qui che permette il tracciamento di tali alterazioni molecolari nei singoli neuroni corticali attraverso giornalisti geneticamente codificati.

Abstract

La capacità del cervello di cambiare in risposta alle esperienze è essenziale per la funzione cerebrale sano, e anomalie in questo processo contribuiscono a una varietà di disturbi cerebrali ^1,2. Per meglio comprendere i meccanismi con cui i circuiti cerebrali reagiscono all'esperienza di un animale richiede la capacità di monitorare i cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti in un dato insieme di neuroni, per un periodo di tempo prolungato, nell'animale vivo. Mentre l'esperienza e le relative attività neurale è noto per innescare cambiamenti di espressione genica nei neuroni ^1,2, la maggior parte dei metodi per rilevare i cambiamenti e non consentono l'osservazione ripetuta dei neuroni stessi più di più giorni o non hanno una risoluzione sufficiente per osservare i singoli neuroni ^{3 , 4.} Qui, descriviamo un metodo che combina in due fotoni microscopia in vivo con un giornalista geneticamente codificato fluorescente per monitorare l'esperienza-dipendenti cambiamenti di espressione genica nei singoli neuroni corticali sul corso del giorno per giorno l'esperienza.

Uno dei consolidata esperienza-dipendenti geni è regolata attività proteine ​​del citoscheletro associato (Arc) ^5,6. La trascrizione d'Arco è rapidamente e altamente indotta da attività neuronale intensificata ^3, e il suo prodotto proteico regola l'endocitosi dei recettori del glutammato e lungo termine plasticità sinaptica ^7. L'espressione di Arc è stato ampiamente utilizzato come marcatore molecolare per mappare circuiti neuronali coinvolti in comportamenti specifici ^3. Nella maggior parte di questi studi, espressione Arc stata rilevata mediante ibridazione in situ o immunoistochimica in sezioni di cervello fisse. Benché questi metodi ha rivelato che l'espressione di Arc è stato localizzato a un sottoinsieme di neuroni eccitatori, dopo l'esperienza del comportamento, come i modelli cellulari di espressione Arc potrebbe cambiare con episodi multipli di esperienze ripetute o distintivo più giorni non è stato studiato. S copi "> In vivo a due fotoni microscopia offre un modo efficace per esaminare i cambiamenti cellulari esperienza-dipendenti nel cervello vivente ^8,9. Per consentire l'esame di espressione Arc nei neuroni vivi da microscopia a due fotoni, abbiamo precedentemente generato un knock- in linea di topi in cui un reporter GFP è posto sotto il controllo del promotore endogeno Arc ^10. Questo protocollo descrive le preparazioni chirurgiche e le procedure di imaging per tracciamento esperienza-dipendenti Arc-GFP espressione modelli in formazioni neuronali nel animale vivo. In questo metodo , croniche finestre del cranio sono stati impiantati in Arc-GFP topi sulle regioni corticali di interesse. Tali animali sono stati quindi più volte ripreso da microscopia a due fotoni dopo desiderati paradigmi comportamentali nel corso di diversi giorni. Questo metodo può essere generalmente applicabili agli animali che trasportano altri reporter fluorescenti di cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti ^4.

Protocollo

Le procedure sperimentali descritte di seguito sono state approvate dal National Institute of Mental Cura la salute degli animali e del Comitato uso ed erano in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura ed uso di animali da laboratorio.

1. Preparazione pre-operatoria

1. Pulire tutti gli strumenti in autoclave a caldo tallone prima dell'intervento chirurgico asettico, pulire il sito chirurgico con il 70% di etanolo, e mettere giù teli puliti. Indossare guanti sterili. Anestetizzare l'animale con una soluzione preparata 1,2% avertin, dato a 0,02 ml / g, intraperitonially. In alternativa, anestetizzare con gas isoflurano attraverso un cono, 5% per induzione, 1,5% per la manutenzione, con un circuito passivo scavenger. Controllare il livello di anestesia con pizzichi di coda o del piede per garantire la sedazione completa.
2. Coprire gli occhi dell'animale con pomata oftalmica sterile, e iniettare desametasone preparata (0,2 mg / kg) e carprofen (5 mg / kg) subcutaneously per prevenire il gonfiore e l'infiammazione cerebrale ^11. Radersi i capelli sul cranio tra le orecchie, e sterilizzare la pelle con scrub betadine e tre tamponi alternati di etanolo al 70%.
3. Montare l'animale in una fase chirurgica stereotassico con earbars, con un cuscinetto riscaldante circolazione dell'acqua sotto il set animale a 37 ° C. Controllare regolarmente i livelli di anestesia dell'animale, e completare la dose di anestetico originale, se necessario.
4. Iniettare 200 ml di 0,5% Marcaine sotto la pelle del cuoio capelluto per intorpidire la zona. Incidere la pelle e rimuovere il lembo cutaneo sul cranio. Rimuovere il periostio e asciugare la zona con tamponi di cotone pulito.

2. Cronica Chirurgia Finestra cranico

1. Utilizzare un trapano ad alta velocità dentale con un diametro fresa da 0,5 a delineare delicatamente un cerchio del diametro di 3-5 mm sopra la regione del cervello di interesse. Periodicamente bagnare il sito di perforazione con polvere sterile salina allo 0,9% delle ossa e chiaro via con tamponi di cotone pulito. Se le ossa sanguina, utilizzare gelfoam ammollo con soluzione salina sterile per cancellare al vivo e aspettare che si fermi.
2. Quando lo strato ultimo osso è raggiunto, sollevare e rimuovere l'isola osso con punta fine pinze. Dura allegati al ripiano inferiore dell'osso può essere rilevato se la finestra attraversa una sutura ossea. Questi dovrebbero essere delicatamente rimosso come il lembo osseo viene sollevato.
3. Rotolo inumidito schiuma gel delicatamente sopra dura esposta per pulire la superficie ed attendere per qualsiasi sanguinamento durale per fermare passaggio critico:. Non procedere fino a quando tutto il sanguinamento si è fermato durale. Sangue che resta intrappolato all'interno della finestra del cranio di solito porta ad una finestra opaca.
4. Se la regione di interesse è in una posizione in cui la durata è particolarmente spesso, rimuovendo la dura sopra può essere necessario. Se questo è il caso, separare delicatamente la dura dalla pia sotto con pinze molto fini, una piccola incisione nella sollevato dura con un altro paio di pinze sottili, quindi afferrare i bordi di taglio e delicatamentedividere la dura madre. La dura madre è sottile ma resistente, quindi fate attenzione a non tagliare il cervello con i bordi intatti della dura.
5. Sciacquare la zona con ACSF sterile o soluzione fisiologica sterile.
6. Posare un vetrino sterile di vetro (3-5 mm) sulla durata o pia passaggio critico:. Se le curve cranio circostanti in modo significativo, utilizzare Kwiksil ¹² adesivo per riempire spazi in cui la dura madre e pia non avrebbe stretto contatto con il coprioggetto in regioni che non sarà ripreso.
7. Utilizzare gel cianoacrilato a coprire l'adesivo elastomero e bordi del vetrino coprioggetto. Coprire l'intero teschio esposto con cianoacrilato gel, o una miscela di cemento e krazyglue dentale passaggio critico:. Non lasciare che il gel di cianoacrilato a toccare la superficie del cervello.
8. Incorporare una misura testa barra metallica di fissaggio dalla parte opposta del cranio.
9. Rispedire l'animale verso una camera di recupero calda, dopo un'iniezione intraperitonial di ketoprofene, 5 mg / kg, for gestione del dolore. Continua l'analgesico per altri due giorni dopo l'intervento.
10. Dopo due settimane di recupero post-operatorio, anestetizzare l'animale con isoflurano (5% per l'induzione, 1,5% per la manutenzione), montarlo in una misura palco microscopio con una testa di fissaggio telaio, e controllare la finestra del cranio per chiarezza ottica con l'illuminazione con luce blu. Superficie dei vasi sanguigni del cervello chiarezza è altamente indicativo di qualità finestra cranica. Se i bordi dei vasi sanguigni sono nettamente definita, la finestra può essere utilizzabile. Le due settimane di post-operatorio i tempi di recupero si consiglia di disporre del tempo sufficiente per consentire all'animale di riprendersi da un intervento chirurgico. Finestre craniche tipicamente chiaro e migliorare in questo periodo, e restano otticamente trasparente per settimane supplementari per mesi fino a quando la ricrescita del cranio o ispessimento della dura degrada la qualità finestra.

3. Protocollo di comportamento e di scansione laser a due fotoni Microscopia

1. Gli animali con chiara cfinestre ranial saranno esposti ad uno stimolo ambientale o sottoposto ad una sessione di formazione comportamentale, e poi successivamente ripreso al momento del massimo Arc-GFP espressione. Prima di iniziare un protocollo comportamentale, l'animale deve essere conservato in un ambiente coerente gabbia di casa per ridurre al minimo giorno per giorno variazione della linea di base Arc-GFP livelli di espressione.
2. Iniziare la formazione comportamentale o paradigmi stimolazione ambientale, a seconda della regione del cervello di interesse. Per esempio, gli animali possono essere esposti a diversi ambienti visivi per più giorni consecutivi, e ripreso ogni giorno dopo la stimolazione visiva per identificare stimoli-risposte specifiche nella corteccia visiva ^10.
3. Arc-GFP fluorescenza nei neuroni in genere raggiunge il suo livello massimo due ore dopo la stimolazione. La timeline sperimentale può essere ottimizzato per facilitare l'individuazione di Arc-GFP espressione nei neuroni al loro livello di picco di fluorescenza.
4. Dopo una sessione di formazione comportamentale o environmentastimolazione l è completata, anestetizzare l'animale con isoflurano (5% per l'induzione, 1,5% per la manutenzione) e montare l'animale nella misura palco microscopio con testa di fissaggio telaio sotto il microscopio a due fotoni.
5. Posizione della testa dell'animale è fissato alla testa di fissazione cornice che si collega direttamente alla fase, utilizzando la barra di metallo impiantato sul cranio. Isoflurano e ossigeno vengono continuamente fornita al mouse tramite un cono. La temperatura corporea è mantenuta utilizzando una piastra elettrica.
6. Assicurarsi che i rivelatori microscopio sono protetti dalla luce ambientale, conducendo a due fotoni di scansione laser in una stanza buia. Utilizzare un 20x o 25x (1,05 apertura numerica) obiettivo a immersione in acqua per l'imaging. Primo, sotto epi-fluorescenza illuminazione, acquisire un'immagine di modelli di superficie del vaso sanguigno oltre la regione del cervello di interesse con una camera CCD per allineamento dell'immagine futuro.
7. Inizia a due fotoni di scansione laser per acquisire un 3-D serie di immagini. Una Olympus FV1000MPE multi-fotone microscopio è usato nel nostro setup. La lunghezza d'onda di eccitazione dei due fotoni laser è fissata a 920 nm, e la potenza del laser emesso dall'obiettivo è fissato a circa 50 mW. Fluorescenza emessa viene rilevata contemporaneamente nei canali verde e rosso (specchio dicroico a 570 nm, filtro barriera a 495-540 nm e 570-625 nm), utilizzando un esterno a due canali sistema di rilevazione photomutiplier posizionato vicino al campione. Arc-GFP fluorescenza appare solo nel canale verde, mentre i tessuti auto-fluorescenza appare in entrambi i canali ^{13, 14.}
8. Stack di immagini tipiche hanno dimensioni di circa 320x320x100 micron (larghezza x lunghezza x profondità), una risoluzione orizzontale di 0,5 micron / pixel e una risoluzione verticale di 3 micron / pixel.
9. Dopo aver acquisito la pila di immagini, rispedire l'animale verso la sua gabbia casa. Non disturbare l'animale fino alla prossima sessione di imaging e comportamentali. Ripetere la procedura di comportamento e di imaging in giorni come auspicabileed. Utilizzare il precedentemente acquisito superficie del cervello immagine dei vasi sanguigni per orientare nuovamente nella posizione di imaging stessa.

Risultati

Questo protocollo descrive un metodo per tenere traccia delle modifiche molecolari esperienza-dipendenti nei singoli neuroni corticali di animali vivi. Una finestra cronica craniale viene creato su una regione corticale di interesse in un topo che porta un reporter fluorescente dell'espressione genica. Due-fotone microscopia può essere accoppiato con diversi paradigmi comportamentali da osservare comportamentale indotti cambiamenti molecolari in singoli neuroni e tenere traccia delle modifiche negli stessi gr...

Discussione

Il metodo in vivo immagini qui descritto consente l'esame ripetuto di cambiamenti genetici Arc espressione negli stessi gruppi di neuroni più di più giorni in animale vivo. Si tratta di un metodo efficace e versatile per ottenere informazioni sulla dinamica molecolare plasticità neurali legate a singoli neuroni in risposta a varie esperienze comportamentali. Standard metodi istochimici come ibridazione in situ e colorazione può realizzare singola cella di risoluzione ^3, ma manca la c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome dell'apparecchiatura	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
FV1000 multi-fotone microscopio a scansione laser	Olimpo	FV1000MPE	Imaging
Dissezione microscopio	Omano	555V107	Chirurgia
Stereotaxis fase chirurgica per i topi	Harvard Apparatus	726335	Chirurgia
20X o 25X obiettivo immersione in acqua	Olimpo	XLPL25XWMP	Imaging
Fase Microscopio con testa di fissaggio telaio	Una soluzione su misura	N / A	Imaging
Una pinza sottile	Strumenti Scienza Belle	11251-20	Chirurgia
Dental trapano fresa	Strumenti Scienza Belle	19007-05	Chirurgia
Telecamera CCD	QImaging	QICAM 12 bit	Imaging