Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Riepilogo

Complessi proteici catalizzano le funzioni cellulari fondamentali. Caratterizzazione funzionale e strutturale dettagliata di molti complessi essenziali richiede la produzione ricombinante. MultiBac è un sistema di celle di baculovirus / insetto particolarmente adattato per esprimere proteine ​​eucariotiche e dei loro complessi. MultiBac è stato implementato come una piattaforma open-access, e le procedure operative standard sviluppati per massimizzare la sua utilità.

Abstract

Ricerca proteomica ha rivelato l'impressionante complessità del proteoma eucariotiche in dettaglio senza precedenti. Ora è un concetto comunemente accettato che le proteine ​​nelle cellule esistono per lo più non come entità isolate, ma esercitano la loro attività biologica in collaborazione con molte altre proteine, nell'uomo dieci o più, formando catene di montaggio della cella per la maggior parte se non tutte le funzioni vitali. ^{1 , 2} Conoscenza della funzione e l'architettura di queste assemblee multiproteici richiede la loro disposizione in una qualità superiore e la quantità sufficiente per l'analisi dettagliata. La scarsità di molti complessi proteina nelle cellule, in particolare negli eucarioti, vieta loro estrazione da fonti native, e richiede la produzione ricombinante. Il sistema di vettore di espressione di baculovirus (BEVS) ha dimostrato di essere particolarmente utile per produrre proteine ​​eucariotiche, la cui attività si basa spesso su elaborazione post-traduzionale che altri sistemi di espressione comunemente usati spesso puònon supportano. ³ BEVS utilizzare un baculovirus ricombinante in cui è stato inserito il gene di interesse per infettare colture cellulari di insetto che a loro volta producono la proteina di scelta. MultiBac è un BEVS che è stato particolarmente su misura per la produzione di complessi di proteine ​​eucariotiche che contengono molte subunità. ⁴ Un prerequisito fondamentale per una produzione efficiente di proteine ​​e loro complessi sono protocolli affidabili per tutte le fasi coinvolte in un esperimento di espressione che idealmente può essere implementato come procedure operative standard (SOP) e seguito anche da utenti non specializzati con relativa facilità. La piattaforma MultiBac al Laboratorio europeo di biologia molecolare (EMBL) utilizza POS per tutti i passaggi necessari per un multiprotein esperimento un'espressione complessa, a partire dalle inserimento dei geni in un genoma baculoviral ingegnerizzato ottimizzato per la produzione di proteine ​​eterologhe proprietà di analisi su scala ridotta della proteina esemplari prodotti. ^5-8 La piattaforma diè installato in una modalità di accesso aperto presso l'EMBL di Grenoble e ha supportato molti scienziati del mondo accademico e industria per accelerare i progetti di ricerca complessi proteici.

Introduzione

Attività biologica è controllata da gruppi di proteine ​​e altre biomolecole che agiscono di concerto per catalizzare le funzioni cellulari. Tipici esempi sono i macchinari che trascrive l'informazione ereditaria contenuta nel DNA in RNA messaggero. Negli esseri umani, più di 100 proteine ​​si uniscono in un processo definito e disciplinato a trascrivere i geni, formando grandi complessi multiproteici con 10 e più subunità tra RNA polimerasi II e dei fattori di trascrizione generali come TFIID, TFIIH e altri. ⁹ Altri esempi sono il ribosoma, composto di molte proteine ​​e molecole di RNA, che catalizza la sintesi proteica, o il complesso nucleare del poro che è responsabile della spola biomolecole attraverso la membrana nucleare negli eucarioti. Una dissezione dettagliata architettonico e biochimici di sostanza, tutte le macchine multicomponente nella cella è fondamentale per capire la loro funzione. La delucidazione struttura dei procarioti e eukarribosomi yotic, per esempio, costituivano eventi caratteristici che producono visione senza precedenti di come queste macchine macromolecolari svolgere le loro funzioni indicate nella cella. ^10,11

Ribosomi possono essere ottenuti in qualità e quantità sufficiente per studio dettagliato purificando il materiale endogeno da cellule in coltura, dovuta al fatto che fino al 30% della massa cellulare consiste di ribosomi. RNA polimerasi II è già meno abbondante di ordini di grandezza, e molte migliaia di litri di coltura di lievito dovevano essere elaborati per ottenere una dettagliata vista atomico di questo complesso essenziale centrale per la trascrizione. ¹² La stragrande maggioranza degli altri complessi essenziali sono comunque presenti in molto più bassi importi in cellule native, e quindi non possono essere adeguatamente purificati da materiale di origine nativa. Per rendere tali complessi accessibili per l'analisi strutturale e funzionale dettagliata richiede produzione eterologa mediante te ricombinantechniques.

Produzione di proteina ricombinante ha avuto un grande impatto sulla ricerca di scienze biologiche. Molte proteine ​​sono state prodotte ricombinante, e la loro struttura e funzione sezionati ad alta risoluzione. Programmi di genomica strutturale hanno approfittato della delucidazione dei genomi di molti organismi per affrontare il gene prodotto repertorio di interi organismi in modalità high-throughput (HT). Migliaia di strutture proteiche sono state così determinato. Ad oggi, il sistema più prolifico utilizzato per la produzione di proteina ricombinante è stata E. coli, e molti sistemi di espressione sono stati sviluppati e perfezionati nel corso degli anni per la produzione di eterologa in questo host. I plasmidi che ospitano un gran numero di funzionalità per consentire la produzione di proteine ​​in E. coli riempiono interi cataloghi di fornitori commerciali.

Tuttavia, E. coli ha alcune limitazioni che rendono non adatti per produrre molte proteine ​​eucariotiche e in pcomplessi proteici articolari con molte subunità. Pertanto, la produzione di proteine ​​in ospiti eucariotici è diventata sempre il metodo di scelta negli ultimi anni. Un sistema particolarmente idoneo per produrre proteine ​​eucariotiche è il sistema di vettore di espressione di baculovirus (BEVS) che si basa su un baculovirus ricombinante che trasportano i geni eterologhi per infettare colture di cellule di insetto coltivate in laboratorio. Il sistema è un MultiBac BEVS recentemente sviluppate, particolarmente su misura per la produzione di complessi proteici eucariotiche con molte subunità (Figura 1). MultiBac è stato introdotto nel 2004. ¹³ Dalla sua introduzione, MultiBac è stato continuamente perfezionato e snella per semplificare la gestione, migliorare la qualità delle proteine ​​bersaglio e in generale rendere il sistema accessibile agli utenti non specialisti per la progettazione di procedure operative standard (SOP efficienti). ⁴ MultiBac è stato implementato in molti laboratori in tutto il mondo, in academia e industria. Alla EMBL di Grenoble, programmi di accesso transnazionali sono state messe in atto dalla Commissione europea per fornire formazione di esperti presso la piattaforma MultiBac per gli scienziati che hanno voluto utilizzare questo sistema di produzione per far progredire la loro ricerca. La struttura e la funzione di molti complessi proteici che erano fino a quel momento non accessibile è stato spiegato, utilizzando campioni prodotti con MultiBac. ⁴ Nel seguito, le fasi essenziali della produzione MultiBac sono riassunti in protocolli come sono in funzione presso l'impianto MultiBac presso l'EMBL di Grenoble.

Protocollo

1. Recombineering Tandem (TR) per la creazione di multigenica costrutti di espressione

1. Pianificare la strategia di co-espressione. Approccio progettuale per l'inserimento dei geni di interesse in donatori e accettori. Potenziali moduli fisiologici del vostro complesso dovrebbero essere raggruppati insieme su Aderenti ei donatori specifici. Utilizzare Modulo Moltiplicazione composto da endonucleasi Homing (HE) - coppie BstXI combinare cassette di espressione sul singolo donatore e plasmidi Acceptor ^7,8 Crea tutti i costrutti rilevanti in silico e validare accuratamente la strategia prima di procedere al lavoro sperimentale.. Per esempio, geni di interesse dovrebbero essere controllati per non contenere HE o altri siti di restrizione e la presenza di corrette fasi di lettura aperta (ORF) dovrebbe essere convalidato. Considerare l'ordinazione geni sintetici ottimizzati per insetti cella codon usage e struttura secondaria dell'mRNA per migliorare i livelli di produzione di proteine ​​così come la rimozione di qualsiasi esisting HE siti dei geni di interesse. Provare a inserire i tag di depurazione sulla base dei dati della letteratura sulla N-o flessibili o esposti C-terminali delle vostre proteine ​​di scelta. Si consideri l'applicazione di strategie poliproteici che mirano a produrre diverse subunità proteiche nel complesso se le quantità relative di singole proteine ​​devono essere controllati a causa di problemi di stechiometria del complesso. ⁴ Preparare dettagliato "How-To" del documento (si consiglia di prenotare laboratorio elettronico) contenente tutte le fasi proiettate sperimentali del progetto che porta al costrutto multigene completa (s). Creare file elettronici dei Cre-LoxP plasmidi fusi per esempio utilizzando il software di Cre-ACEMBLER che può essere scaricato dalla home page Berger gruppo ( multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / CRE-acembler ).
2. Inserisci i tuoi geni di interesse in donatori selezionati eAccettori utilizzando enzimi di restrizione e ligasi, o, in alternativa, mediante legatura metodi indipendenti seguenti protocolli pubblicati. ^5,6,14 Se si ha accesso a una gestione dei liquidi stazione di lavoro e se si prevede un gran numero di costrutti da generare ( ad esempio, per gli approcci combinatori) considerare l'utilizzo di script robotica sviluppate e attuate dal gruppo Berger (Figura 2). ^14,15 Se una manipolazione dei liquidi stazione di lavoro non è disponibile, il funzionamento manuale utilizzando micropiastre permette l'inserimento del gene in un HT come la moda.
3. I vincoli imposti dalla necessità di controllare la stechiometria delle subunità espresse potrebbero materializzarsi. Nel caso di stechiometricamente livelli di espressione squilibrate di singole subunità di un complesso proteico, è consigliabile applicare strategie poliproteici di coniugare diverse subunità del vostro complesso e una proteasi specifica (ad esempio tabacco etch virus NIA proteasi) in singoli grandi ORF distanziati di ssiti proteolitici specifici applicabili. ^4,8 considerare co-esprimono uno o più poliproteine ​​con cassette di espressione singoli, se si dispone di un grande complesso con numerose subunità e ampiamente che vanno pesi molecolari delle singole unità. Considerare co-esprimono diversi geni che codificano per la stessa proteina in una poliproteina o come diversi cassette di espressione identici se tale proteina è caratterizzata da una bassa resa di produzione. ^4,13
4. Convalidare tutti i costrutti del donatore e l'accettore clonati da mappatura di restrizione (a scelta in high-throughput) e sequenziamento. Procedere a fondere combinazioni donatore-accettore di Cre-loxP ricombinazione per generare i multigeniche espressione costrutti di scelta. Confermi purificata Acceptor-donatori plasmidi fusione di mappatura di restrizione, utilizzare sequenze elettroniche create da Cre-ACEMBLER o programmi simili come riferimento.
5. Conservare purificati e convalidato I donatori, accettori e fusioni donatore-accettore a -20 ° C o -80 ° C. Archivio plasmids e le loro sequenze (Microsoft Excel, Filemaker, altri) con cura per un utilizzo successivo.

2. Composito multigene Baculovirus Generation, Amplificazione e conservazione

1. Integrare vettori di trasferimento multigeniche genoma baculoviral MultiBac trasformandosi in DH10 cellule che ospitano il genoma virale e le funzionalità necessarie per la TN7 trasposizione. Si noti che il genoma baculoviral MultiBac può essere precaricato con particolari geni di interesse (YFP marcatore, accompagnatori, ecc) nel proprio sito loxP (costruito nel genoma distale al sito di attacco TN7) da una reazione in vivo Cre precedente TN7 integrazione. Dopo ¹³ TN7 trasposizione, cellule con baculovirus composito contenente i geni di interesse sono selezionati mediante screening blu / bianco (successo TN7 risultati trasposizione in perdita di α-complementazione della β-galattosidasi, pertanto, colonie con TN7 corretta trasposizione rimangono bianco su una selettivapiatti gar contenenti X-gal) e il genoma è preparato da lisi alcalina e etanolo / isopropanolo precipitazioni. ^5,6
2. Trasfezione e produzione di virus iniziale. Posto 6 pozzetti coltura tissutale in cappa sterile. Dal log-fase SF21 coltura di cellule di insetto, seme fuori aliquote di cellule nei pozzetti e trasfezione con l'aggiunta del genoma purificata baculoviral e un reagente di trasfezione mescolato in terreni di coltura, come descritto. ⁶ Harvest virus iniziale dopo 48-60 ore rimuovendo il materiale ( alta qualità, basso titolo virale V _0, tipicamente 3 ml per pozzetto). Supplemento mezzi freschi e di prova per la produzione di proteine ​​(e, se un marcatore YFP è presente, per fluorescenza) dopo altri 2-3 giorni. ^6,7
3. Amplificazione di virus, basso MOI regime. Utilizzare V ₀ virus per infettare 25-50 ml di cellule in fase logaritmica (densità cellulare <1x10 ⁶ cellule per ml) in piccolo (100-250 ml) Erlenmeyer palloni shaker agitatosulla piattaforma agitatori orbitali (Figura 3). Contare le celle e dividere ogni hr 24 fino le cellule smettono di raddoppio (proliferazione arresto). Seguire un regime basso MOI (molteplicità di infezione cioè il numero di particelle virali per cellula): Le cellule devono raddoppiare (almeno) una volta (MOI <1), altrimenti ripetere esperimento con un volume minore di V ₀ aggiunti. Normalmente, 3 ml di ₀ V sono usati per infettare 25 ml di cellule di insetti Sf21 ad una densità di 0.5x10 ⁶ cellule / ml. Ciò è essenziale per evitare dannose sovra-amplificazione e cancellazione automatica di virus che può causare la perdita di geni eterologhi di interesse. Harvest V ₁ virus (25-50 ml) dopo 48-60 ore dal pellet cellule e rimuovendo i supporti contenenti il virus. Integrare con mezzi freschi e test di YFP e la produzione di proteine, eliminando ⁶ celle 1x10 ogni 12 o 24 ore, pellet e convalidare la produzione di proteine ​​e di segnale proteina marker (YFP). ^6, Amplifica virus (perV ₂₎ ulteriormente se volumi di espressione più grandi sono finalizzate a infettando fino a 400 cellule in 2 ml L shaker beute con V ₁ virus rispettando il basso sopra MOI regime (cellule devono raddoppiare almeno una volta dopo l'infezione con V _1). Rigorosamente testare la produzione di proteine ​​e di segnale proteina marker durante l'amplificazione per evitare l'accumulo di virus difettosi contenenti non più i tuoi geni di interesse. ^5-7 Utilizzo pellet cellulari si accumulano ad ogni amplificazioni passo già per stabilire protocolli di purificazione per il complesso proteina espressa di interesse.
4. Stoccaggio BIIC produzione del virus. Si consiglia vivamente di memorizzare virus V ₂ come il virus di produzione utilizzando il BIIC (B aculovirus-i nfected i nsect c ell) metodo, per evitare modifiche (ad esempio la perdita del gene di interesse) del virus ricombinante e per preservare l'alta espressione livellos ¹⁶ pellet cellule infette è osservata 24 ore dopo l'arresto della proliferazione -. di questo stadio le cellule contengono particelle virali complete poco prima che sarebbero stati rilasciati (per gemmazione) nei mezzi di comunicazione. Rimuovere i supporti e le aliquote congelamento del pellet di cellule in azoto liquido e conservare a tempo indeterminato. ^7,16

3. Produzione di proteine ​​e trattamento a valle

1. Infettare grandi culture (R) e di monitoraggio YFP. Utilizzare V _1, V ₂ o congelati aliquote BIIC di infettare colture cellulari più grandi per i cicli di produzione (in genere 400 ml a 2 l fiaschi). Aderire a basso regime di MOI (regolare il volume virus utilizzato per l'infezione in modo che la cultura infetto raddoppia almeno una volta). Ingrandire volumi di coltura infetti, se necessario in base al numero di flaconi moltiplicando. Se YFP proteina marker è presente, recedere in definiti intervalli di 1x10 ⁶ celle, pellet e lisare le cellule e monitorare l'evoluzione del segnale YFP fino a un plateau viene raggiunto indicating massima produzione di proteina ricombinante. YFP livelli possono essere misurati in un pozzo lettore di piastra di serie 96 in grado di registrare segnali di fluorescenza (ad esempio Tecan SPECTRAFluor). Celle di raccolta in questa fase. Pellet cellulari conservare a -20 ° C (breve termine) o -80 ° C (a lungo termine).
2. La lisi cellulare e frazionamento. Lyse cellule dal vostro metodo preferito di scelta, su misura per le esigenze della vostra proteina (gelo-disgelo, sonicazione, stampa francese, altri). ^5-7 citosol frazionare e di nuclei e di test per la presenza dei vostri proteine ​​di interesse. Sviluppare protocolli di purificazione basati sui risultati di semplificare la purificazione di proteine. Si consideri l'applicazione di procedure di immersione totale per estrarre la vostra proteina dalla frazione nucleare in condizioni di alto KCl se le proteine ​​risiedono nel nucleo. ^7,18
3. Purificazione della proteina (micro-scala, su larga scala). Si noti che spesso piccoli volumi (10 o 25 ml) di coltura cellulare sono susere sufficienti per ottenere pellet cellulari per la purificazione di notevoli quantità di vostre proteine ​​di interesse a causa dei tipicamente elevati o molto elevati livelli di produzione di proteine ​​eterologhe nei sistemi cellulari baculovirus / insetto (spesso 10-100 mg di proteine ​​per L cultura e altro ancora). In concomitanza con micro-depurazione (piastre a pozzetti multipli, metodi MicroTip, sistema di GE Healthcare ÄKTAmicro, altri) è possibile ottenere dati biochimici e di attività e spesso anche quantità sufficiente di proteine ​​desiderate e complessi per nanolitri scala cristallizzazione high-throughput (HTX ). Considerare l'utilizzo di metallo purificazione di affinità (Clonetech Takara TALON, Qiagen Ninta resine chelante metallo) e un oligo-istidina (6-10 residui) tag su subunità esposte della vostra proteina complessi per facilitare la purificazione, in collaborazione con scambio ionico e cromatografia ad esclusione dimensionale in piccolo volumi usando per esempio la ÄKTAmicro o una simile piccola macchina di purificazione del volume (Figura 4 ). Altri passaggi di purificazione di affinità e di scambio ionico (IEX) passi oltre alla purificazione di affinità con i tag oligo-istidina o altri tag (scegliere tra GST, MBP, CBP, altri) possono e devono essere considerati, in base alle proprietà biochimiche delle proteine di interesse e le preferenze individuali. Considerare codifica più di una subunità di etichetta di affinità per migliorare l'efficienza di purificazione. Concentrate i vostri complessi proteici purificati e stabilire protocolli di storage, quali il congelamento con o senza glicerina. Sviluppare criteri di controllo di qualità che possono essere applicati in standard (saggi di attività, test biochimici e biofisici) per valutare variazioni da lotto a lotto dei vostri proteine ​​purificate.

Risultati

Forte co-espressione di proteine ​​eterologhe raggiunti dal sistema MultiBac è mostrato in Figura 1d (sonde prelevati 48 ore dopo infettare una coltura cellulare di sospensione). Le bande proteiche sono overexpressed chiaramente distinguibile nell'estratto cellula intera (SNP) e il lisato eliminato (SN). La qualità e la quantità del materiale di proteina prodotta è spesso sufficiente a consentire la determinazione della struttura di complessi proteici, come il punto di arresto mitotico compl...

Discussione

Video istantanee delle figure 2 e 3 illustrano l'intero processo di generazione robot-assistita da cDNA di espressione multigene costruisce fino alla infezione di colture cellulari di insetto per la produzione di proteine. Nuovi reagenti (plasmidi e virus) e protocolli robusti sono stati sviluppati per consentire una pipeline basandosi su SOP. L'intera filiera è stato implementato come una piattaforma tecnologica al EMBL di Grenoble. La piattaforma MultiBac è stata letta da mo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetracycline	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine	Euromedex	EU0420 (25 g)	1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine	SIGMA	G3632 (5 g)	1,000X at 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1,000X at 1M
Cre-recombinase	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
6-well plate Falcon	Dominique Dutscher	353046
2 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357507
5 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357543
10 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357551
25 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357535
50 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357550
50 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352070
15 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352096
1.8 ml cryotube Nunc	Dominique Dutscher	55005
100 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211917
250 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211918
500 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211919
2 L shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211921
Certomat Orbital Shaker + plateau	Sartorius	4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Biological Safety Cabinet Faster	Sodipro	FASV20000606
Optical Microscope	Zeiss	451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus	TECAN
10 μl conductive tips (black),	TECAN	10 612 516
200 μl conductive tips (black)	TECAN	10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted	Eppendorf	0030 128.648
96 well V bottom, non sterile	BD falcon	353263
96 deepwell plate color natural, PP)	Fisher	M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom	Greiner	655101
96 deepwell plate	Thermo scientific	AB-0932
24 well blocks RB	Qiagen	19583
DpnI restriction enzyme	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	homemade		7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1% agarose GP	Life Technologies	G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit	Macherey Nagel	740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq green master mix	Promega	M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	homemade
Urea 2 M	homemade
EDTA 500 mM pH 8.0	Homemade
LB broth (Miller) 500 g	Athena ES	103