Neonatale Elettroporazione zona subventricolare

Riepilogo

Dimostriamo una tecnica minimamente invasiva denominata neonatale elettroporazione zona subventricolare. La tecnica consiste nell'iniettare DNA plasmidico nei ventricoli laterali di cuccioli neonati e l'applicazione di corrente elettrica per fornire e manipolare geneticamente le cellule staminali neurali

Abstract

Cellule staminali neurali (NSC) linea ventricoli postnatali laterali e danno luogo a diversi tipi cellulari che includono neuroni, astrociti e cellule ependimali ^1. La comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della NSC auto-rinnovamento, l'impegno, e la differenziazione è fondamentale per sfruttare il loro potenziale unico per riparare il cervello e capire meglio disturbi del sistema nervoso centrale. Metodi precedenti per la manipolazione dei sistemi di mammifero richiede l'impegno lungo e costoso dell'ingegneria genetica a livello animale intero ^2. Così, la maggior parte degli studi hanno esplorato le funzioni di molecole NSC in vitro o in invertebrati.

Qui, una dimostrazione della tecnica semplice e rapida per manipolare NPC neonatali che si riferisce a come neonatale zona subventricolare (SVZ) elettroporazione. Tecniche simili sono state sviluppate una decina di anni fa per studiare cellule staminali neurali embrionali e hanno aiutato studi sulla cortica^3,4 l di sviluppo. Più di recente questo è stato applicato per studiare il proencefalo roditore postnatale ^5-7. Questa tecnica comporta l'etichettatura robusto SVZ cellule staminali neurali e la loro progenie. Così, postnatale SVZ elettroporazione fornisce un costo e un'alternativa tempo efficace per mammiferi ingegneria genetica NSC.

Protocollo

Questa procedura è in conformità con i requisiti IACUC Yale. Gli scienziati dovrebbero fare in modo che le linee guida IACUC sono approvati e seguiti secondo le proprie esigenze istituzionali.

1. Sezione 1. Preparazione di Pipette DNA, soluzioni, e vetro

1. Generazione di elevata purezza (OD 260/280> 1,80) ad alta concentrazione (mg / ul> 2.5) privo di endotossine DNA.
2. Preparare soluzione fisiologica 0,9% e filtro sterile attraverso un filtro 22 micron.
3. Posto 10 centimetri tubi di fuoco lucido vetro borosilicato capillari (OD: 1,5 mm, ID: 1.10 mm) in un modello PP-830 Narishige PC-10 estrattore pipetta di vetro con un filo kanthal. Impostare estrattore ad un pull un passo ponderato a 70.5 ° C. Rompere le punte con pinza circolari e ispezionare sotto un microscopio da dissezione per i bordi frastagliati. Punte coniche e posto sotto una lampada UV per 15 minuti. Pipette tirato devono essere marcati a 2 mm dal bordo della punta.
4. Preparare 0,1% peso / volume soluzione molto veloce verdedalla miscelazione sterile filtrata soluzione salina allo 0,9% a secco verde veloce.

2. Sezione 2. Preparazione degli animali, pipetta di vetro di caricamento e iniezione Plasmid

1. Rimuovere giorno postnatale 0-1 cuccioli individualmente dalle gabbie, posto su un piatto di vetro Petri pre-refrigerato a 4 ° C, e quindi posto in ghiaccio.
2. Dopo circa 5 minuti, determinare lo stato di anesthetization utilizzando la risposta pinch piede. Se non si verifica il movimento, cuccioli di soggetti ai iniezione intraventricolare.
3. È importante notare che la combinazione di verde veloce, DNA, e soluzione salina può provocare una rapida evaporazione, cristallizzazione, e il blocco di pipette di vetro. Di conseguenza, generare una soluzione di riserva ed aliquota 1-2 microlitri su parafilm immediatamente prima di iniezioni.
4. Aspirare l'intero volume aliquotate con la pipetta di vetro tirato.
5. Tenere la testa del cucciolo tra il pollice e l'indice della mano meno dominante.
6. Accendere una lampadad tenere la testa del cucciolo appena fuori del fascio di luce. Se necessario, mettere salino sulla testa per ridurre la quantità di luce riflessa da pup. I ventricoli dovrebbe essere illuminato.
7. Con la mano dominante, inserire l'ago nel ventricolo laterale più vicino a voi (Figura 1A e 1B). Il sito di iniezione deve essere approssimativamente equidistante dalla sutura lambdoidea e occhio e 2 mm lateralmente alla sutura sagittale. Inserire tirato pipetta a volume 2 mm per un cucciolo P0, che dovrebbe garantire una maggiore penetrazione nel ventricolo laterale. Casualmente, è possibile visualizzare il riempimento del liquido cerebrospinale nella pipetta dal rilascio della pressione intracranica. Per ridurre la pressione intracranica, che aiuta a iniezione di plasmide, allentare la presa sulla testa del pup.Step 2.8. Iniettare circa 0,5 l di plasmide nel ventricolo laterale che utilizza l'aria compressa-iniettore (Picospritzer, Parker).

3. Sezione 3. Elettroporazione e recupero

1. Set la tensione del generatore di elettroporazione per 5 impulsi quadrati, 50 msec / impulso a 100 volt, con 950 msec. La specificità spaziale di elettroporazione plasmide è dettata dalla direzionalità del trasferimento di carica. Particolare attenzione dovrebbe essere data al collocamento data l'eterogeneità delle popolazioni di cellule staminali lungo la SVZ ^8. Le differenze nei tassi di proliferazione e il destino della cellula sono stati individuati per le posizioni-dorsale e ventrale rostrale-caudale ^9,10.
2. Una volta che il plasmide viene iniettato, dip elettrodi pinzetta in PBS. Questo passo è quello di massimizzare il trasferimento di carica e per evitare ustioni causate da resistività.
3. Posizionare l'elettrodo positivo sulla parete dorsale laterale del cucciolo vicino all'orecchio omolaterale al sito di iniezione plasmide (Figura 1C e 1D). Posizionare l'elettrodo negativo sul laterale dell'emisfero controlaterale ventrale al cucciolo muso.
4. Avviare il trasferimento corrente premendo i piedini di impulsistrega pedale e spazzare gli elettrodi da dorsale a laterale che utilizza ~ 25 ° intervalli angolari.
5. Posto elettroporata cuccioli su un rilievo di riscaldamento per 5 min. Ruotare delicatamente cuccioli ogni 30 secondi con una lieve stimolazione.

Risultati

Neonatali subventricolare elettroporazione risultati della zona nella etichettatura di quasi tutti glia radiale contigua alla dorsale, zona dorsale subventricolare laterale e laterale seguendo il movimento "spazzare" dell'elettrodo pinzetta (Figura 1E). Tuttavia, elettroporazione può essere adattato al requisito dell'esperimento rispettivo ma non spazzare l'elettrodo e utilizzando il posizionamento e l'orientamento specifico come dettagliato nel video. Ad esempio, poiché loca...

Discussione

Qui dettaglio la tecnica di elettroporazione neonatale SVZ, una tecnica per etichettare in modo rapido e robusto e manipolare le cellule staminali SVZ e la loro progenie. Ci sono diversi vantaggi che elettroporazione ha rispetto ad altre tecniche. Prima, data l'etichettatura focale di cellule, si è in grado di discernere cellule effetti autonomi e non autonomi cella. In secondo luogo, la manipolazione genetica utilizzando sistemi inducibili permette di confrontare gli effetti prima o dopo l'integrazione sinapti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Heavy Tubi lucido borosilicato	Sutter Instrument	BF150-110-10
Doppio-Stage Glass Micropipetta Puller	Narishige	PC-10H
Fast Green	Fischer Scientific	0521192205
ECM 830 Onda quadra generatore di impulsi	Harvard Apparatus	45-0052
Tweezertrodes	Harvard Apparatus	45-0488
Fibra ottica Sorgente luminosa	Fisher Scientific	12-562-36
Tungsteno alogenalampada	USHIO America, Inc	1002247
Picospritzer II	Parker Instruments	052-0312-900